桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用，所制備的藥物對(duì)肝癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃腸間質(zhì)瘤等腫瘤具有較好的療效，不僅為桑黃在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用及其臨床推廣提供了理論依據(jù)，而且對(duì)桑黃資源的綜合利用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【專利說(shuō)明】桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用，屬藥品【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是一類常見(jiàn)病和多發(fā)病，是機(jī)體組織細(xì)胞在內(nèi)外各種致瘤因素長(zhǎng)期作用下， 發(fā)生基因突變失去對(duì)其生長(zhǎng)和分化的正常調(diào)控，引起克隆性異常增生和分化所形成的新生 物或贅生物。腫瘤分為良性腫瘤和惡性腫瘤，惡性腫瘤又細(xì)分為來(lái)源于上皮組織的癌、來(lái)源 于間葉組織的肉瘤和癌肉瘤三類。通常人們所說(shuō)的"癌癥"是泛指所有的惡性腫瘤。
[0003] 惡性腫瘤是威脅人類健康最主要的惡性疾病之一，是目前全球人口的第一死因， 最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007年，全球有約790萬(wàn)人死于各類癌癥，占死亡總數(shù)的13%，有超過(guò)1200 萬(wàn)個(gè)腫瘤病例被確診，其中72%以上腫瘤患者和致死病例都發(fā)生在不發(fā)達(dá)國(guó)家，且呈不斷 上升的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)2015年，全球腫瘤致死人數(shù)將增至900萬(wàn)人，2030年將超過(guò)1200萬(wàn)人； 目前，我國(guó)每年癌癥發(fā)病人數(shù)約280萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)40萬(wàn)人，位列我國(guó)各類疾病致死原因 之首，并呈不斷上升趨勢(shì)。隨著社會(huì)生活節(jié)奏加快，競(jìng)爭(zhēng)壓力增大，以及人類的生活方式和 環(huán)境的改變，腫瘤發(fā)病率和死亡人數(shù)正逐年增長(zhǎng)，已成為現(xiàn)代社會(huì)的常見(jiàn)病和高發(fā)病，不僅 嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，也是困擾全球 的重大社會(huì)問(wèn)題，癌癥的治療和預(yù)防始終是全球范圍類最為迫切的問(wèn)題之一。目前，化學(xué)藥 物治療是抗擊腫瘤的主要手段，雖然有較好的療效，但是常引起骨髓抑制、免疫功能低下等 副反應(yīng)，使患者難以堅(jiān)持治療，并且化療藥物在治療過(guò)程中出現(xiàn)的耐藥性已成為目前臨床 治療中的難題之一。近年來(lái)，全球抗腫瘤藥物市場(chǎng)呈快速增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，據(jù)美國(guó)FDA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)， 全球抗癌藥物市場(chǎng)銷售總額由2004年的240億美元，激增至2007年的396億美元。雖然 全球每年都不斷有新型抗腫瘤藥物問(wèn)世，但至今人類仍然沒(méi)有一種有效的手段戰(zhàn)勝癌癥， 同時(shí)不斷發(fā)現(xiàn)新的癌癥種類，以及腫瘤抗/耐藥性的產(chǎn)生和增強(qiáng)，使得對(duì)發(fā)現(xiàn)新型有效抗 癌藥物的需要顯得尤為迫切?？v觀全球1981至2002年期間所開(kāi)發(fā)的抗癌藥物，約60%直 接或間接來(lái)自于天然產(chǎn)物，充分表明自然界是人類獲取抗腫瘤藥物的最重要的源泉。植物 中廣泛存在著具有抗腫瘤作用的活性成分，喜樹(shù)堿、長(zhǎng)春新堿和紫杉醇等的先后被發(fā)現(xiàn)，標(biāo) 志著天然抗癌藥物研宄所取得的重大進(jìn)展，我國(guó)中藥資源豐富，從傳統(tǒng)的藥用資源中尋找 抗腫瘤藥物是完全可行的。
[0004] 桑黃，基原為多孔菌科針層孔菌的子實(shí)體，拉丁學(xué)名：phellinus igniarius(L. ex Fr. )Quel。又名：火木層孔菌，子實(shí)體無(wú)柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形?，F(xiàn)代研宄證實(shí)桑黃含 有酚類、黃酮、多糖等有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多方面的藥理活性，因此，桑黃作 為抗腫瘤藥物是可行的。
[0005] 發(fā)明人所在的研宄團(tuán)隊(duì)于去年申報(bào)了中國(guó)發(fā)明專利一桑黃提取物在制備治療肝 癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應(yīng)用（發(fā)明專利號(hào)201410023184. 3,已經(jīng)進(jìn)入實(shí)質(zhì)審查階 段），公開(kāi)了桑黃子實(shí)體的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位抗肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物 中的應(yīng)用。研宄組繼續(xù)對(duì)桑黃抗腫瘤作用進(jìn)一步研宄，體外對(duì)肝癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、 宮頸癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃腸間質(zhì)瘤等43種腫瘤細(xì)胞株進(jìn) 行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)桑黃對(duì)肺癌細(xì)胞系H460、H526,結(jié)腸癌細(xì)胞系C0L0205,宮頸癌細(xì)胞系 Hela，前列腺癌細(xì)胞系DU145,人骨肉瘤細(xì)胞U20S，肝癌細(xì)胞系H印G2,淋巴癌細(xì)胞系TMD8、 NAMLWA、Z-138,乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,膀胱癌EJ，急性髓性白血病細(xì)胞系NOMO-I、SKM-I、 NB4、HEL、Raji，胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST-T1，抑制效果較為明顯，在藥物測(cè)試濃度為150yg/ ml時(shí)，抑制率均大于80% (見(jiàn)表1);研宄組從上述腫瘤中隨機(jī)抽取三種，即肺癌、白血病、 淋巴癌，在整體動(dòng)物模型上進(jìn)行驗(yàn)證，研宄發(fā)現(xiàn)桑黃對(duì)肺癌、白血病、淋巴癌的老鼠有明顯 的治療作用。說(shuō)明不僅桑黃提取物有抗癌作用，桑黃也具有較好的抗癌作用；桑黃不僅對(duì)肝 癌、子宮頸癌、乳腺癌有療效，而且對(duì)其它腫瘤也有較好的治療作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用。
[0009] 所述藥物中以桑黃為唯一活性成分。
[0010] 所述藥物是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用中藥制劑常規(guī)方法制備成任何可藥用的制 劑。
[0011] 所述腫瘤是肝癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉 瘤、前列腺癌、胃腸間質(zhì)瘤。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 本發(fā)明證明了桑黃具有較好的抗腫瘤作用，尤其對(duì)肝癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮 頸癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃腸間質(zhì)瘤等腫瘤具有較好的療效，不 僅為桑黃在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用及其臨床推廣提供了理論依據(jù)，而且對(duì)桑黃資源的綜 合利用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0014] 為了更好地理解本發(fā)明，下面以桑黃治療腫瘤的主要藥效學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明。試 驗(yàn)效果旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的作用，而非本發(fā)明的限制。
[0015] -、桑黃體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)
[0016] ( -）實(shí)驗(yàn)材料
[0017] 1、細(xì)胞株
[0018] 肝癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃腸間質(zhì)瘤等 45種細(xì)胞株；安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院和中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)研宄院提供。
[0019] 2、藥物與試劑
[0020] DMEM培養(yǎng)粉：購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；
[0021] 胎牛血清：購(gòu)自杭州四季青生物材料研宄所。置于_20°C冰箱保存，4°C冰箱過(guò)夜 融化，在56°C水浴30min滅活后使用；
[0022] 氟尿嘧啶：購(gòu)自齊魯制藥有限公司；
[0023] 青霉素：購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠；
[0024] 鏈霉素：購(gòu)自深圳華南南方制藥有限公司；
[0025] 二甲基亞諷（DMSO):購(gòu)自Sigma公司；
[0026] 噻挫藍(lán)（MTT):購(gòu)自Sigma公司；
[0027] 50mm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔板：購(gòu)自康寧公司
[0028] 3、主要溶液配制
[0029] DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM粉末一包，丙酮酸鈉0. llg，谷氨酰胺0. 58g，碳酸氫鈉 2. 0g，加入三蒸水定容至1000ml，0. 22 μ m過(guò)濾除菌，分裝后置于-20°C保存?zhèn)溆?。臨用前 37°C水浴融化，后加入105IU/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10%小牛血清（10%胎牛血清用于 培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞）。
[0030] 磷酸鹽緩沖液（PBS) :8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na2HP0412H20,0.2gKH2P0 4;溶解 于適量三蒸水，調(diào)節(jié)PH值至7. 2,定容至1L，過(guò)濾分裝，高壓滅菌后，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031 ] MTT溶液：MTT粉劑溶于PH為7. 4的PBS溶液中，濃度5mg/ml，避光、超聲助溶，過(guò) 濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用，4°C保存。
[0032] 4、儀器與設(shè)備
[0033] 4°C，_20°C低溫冰箱：日本三洋公司；
[0034] MDF-U40865型-80°C超低溫冰箱：日本三洋公司；
[0035] SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)：寧波新芝公司；
[0036] DHG-9243BS- III型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗；
[0037] DK-8D三孔電熱恒溫水槽：合肥科隆公司；
[0038] 3-16K型冷凍離心機(jī)：Sigma公司；
[0039] TGL高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘智離心儀器有限公司；
[0040] 2306-Z型CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Shellab公司；
[0041] 立式壓力蒸汽滅菌器：
[0042] SW-CJ-IF型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化公司產(chǎn)品；
[0043] Rios83olPE超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司產(chǎn)品；
[0044] MULISKAN MK3 酶標(biāo)儀：Thermo forma 儀器有限公司；
[0045] 移液器：法國(guó)PIPETMA公司；
[0046] XD-202倒置顯微鏡：合肥科?。?br> [0047] (二）實(shí)驗(yàn)方法
[0048] 2. 1細(xì)胞培養(yǎng)
[0049] 本實(shí)驗(yàn)所用的肝癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、人骨肉瘤、前列腺癌、 胃腸間質(zhì)瘤等45種細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞株，用含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，并加 入青霉素10IU/mL和鏈霉素100 μ g/mL的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37°C，5%的CO2培養(yǎng) 箱，每2天更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)消化傳代，（細(xì)胞種類不同，傳代比例不同）， 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0050] 2. 2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況
[0051] 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶 甲臜（Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO)能溶解細(xì)胞中 的甲臜，用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的 量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值A(chǔ)，來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，A值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。
[0052] 細(xì)胞以5X IO5個(gè)/ml的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種量為100 μ L。待細(xì) 胞貼壁后，分為空白對(duì)照組，溶劑對(duì)照組（I % DMSO)，陽(yáng)性對(duì)照5-Fu組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔組， 每孔總體積為200 μ L，分別于48h、72h后，棄去孔內(nèi)液體，用PBS清洗2便，之后加入180 μ L 無(wú)血清培養(yǎng)液，并加入MTT (濃度為5mg/mL) 20 μ L，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，棄上清，每孔加 入150 yL的DMS0,震蕩搖勻，使甲瓚顆粒充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，以波長(zhǎng)492nm， 試劑對(duì)照組調(diào)零，測(cè)吸光度（A492)值，重復(fù)3次，取其平均值。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng) 抑制率：
[0053] 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=〔（對(duì)照組平均A492值-空白組平均A 492值）-實(shí)驗(yàn)組平均A 492 值-空白組平均A492值）/對(duì)照組平均A 492值-空白組平均A 492值〕X 100 % 〇
[0054] (三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055] 經(jīng)過(guò)對(duì)肝癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃腸間 質(zhì)瘤等45種細(xì)胞進(jìn)行的高通量篩選結(jié)果顯示：
[0056] 1、桑黃對(duì)倉(cāng)鼠正常細(xì)胞CHL、CHO均無(wú)明顯抑制作用，顯示：桑黃對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒 副作用；
[0057] 2、桑黃對(duì)肺癌細(xì)胞系H460、H526,結(jié)腸癌細(xì)胞系C0L0205,宮頸癌細(xì)胞系Hela，前 列腺癌細(xì)胞系DU145,人骨肉瘤細(xì)胞U20S，肝癌細(xì)胞系H印G2,淋巴癌細(xì)胞系TMD8、NAMLWA、 Z-138,乳腺癌細(xì)胞系MCF-7,膀胱癌EJ，急性髓性白血病細(xì)胞系N0M0-1、SKM-I、NB4、HEL、 Raji，胃腸間質(zhì)瘤細(xì)胞GIST-Tl，抑制效果較為明顯，在藥物測(cè)試濃度為150 μ g/ml時(shí)，抑制 率均大于80% (見(jiàn)表1)，并顯示出較好的選擇性。
[0058] 3、桑黃對(duì)其余腫瘤細(xì)胞株均無(wú)明顯抑制作。
[0059] 表1桑黃對(duì)43個(gè)腫瘤細(xì)胞的抑制作用
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于：所述藥物中以 桑黃為唯一活性成分。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于：所述藥物 是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用中藥制劑常規(guī)方法制備成任何可藥用的制劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑黃作為治療腫瘤藥物的應(yīng)用，其特征在于：所述腫瘤是肝 癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、淋巴癌、人骨肉瘤、前列腺癌、胃腸間質(zhì) 瘤。
【文檔編號(hào)】A61K36/07GK104490942SQ201410788390
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】李寧, 王開(kāi)金, 余春富, 尹維龍, 陳剛 申請(qǐng)人:安徽省康美來(lái)大別山生物科技有限公司, 安徽醫(yī)科大學(xué)