一種含有miRNA-324的藥物組合物及其用途
【專利摘要】一種含有miRNA-324的藥物組合物及其用途，藥物組合物包括有效劑量的miRNA-324及其藥學上可接受的載體、病毒或輔料；所述載體為殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體或納米顆粒，通過口服或注射，藥物組合物的核苷酸序列為：5’-CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3’；用于治療心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌肥厚或心肌纖維化的心臟疾病。本發(fā)明的藥物組合物制備工藝簡單，藥效明顯，使用方便，治療環(huán)境友好。
【專利說明】一種含有mi RNA-324的藥物組合物及其用途

【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥【技術領域】，涉及一種內(nèi)源性非編碼小RNAs的新藥及其用途， 尤其是一種含有miRNA-324的藥物組合物及其預防或治療心臟疾病的用途。

【背景技術】：
[0002] 心血管疾病是人類健康和生命的主要威脅，是人類健康的頭號殺手，全世界范圍 內(nèi)每年有一千七百多萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和；隨著 人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢，已超過癌 癥成為第一大致死原因。根據(jù)國家衛(wèi)生部近期公布的最新統(tǒng)計結(jié)果表明，我國18歲及以 上居民高血壓患病率為18. 8%，估計全國患病人數(shù)1. 6億多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗 死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相關心臟疾病的病人達幾千萬。目前關于心臟疾病發(fā)病機 理尚不完全清楚，心臟疾病的預防、診斷和治療尚不能達到讓人滿意的效果，急需開發(fā)新的 技術、方法用于心臟病的診斷、防治。miRNA是新近研宄發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小RNA分 子，許多研宄表明miRNA對于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表 達與許多心臟疾病的發(fā)生相關。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點，開發(fā)相關藥物具 有潛在的臨床應用價值。單一的miRNA可以同時作用于多個靶基因的mRNA的表達，藥物作 用于一個miRNA可以調(diào)節(jié)多個參與心臟發(fā)病基因的表達，影響多個信號通路，從整體上達 到治療疾病的目的。由于miRNA在心臟病理狀態(tài)下表達水平不同，因此可以通過檢測miRNA 的表達水平來預測診斷疾病。
[0003] 細胞凋亡（apoptosis)又稱程序性細胞死亡，是指細胞在一定的生理或病理條件 下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程，它是一個主動的、高度有序的、由基因控制及一 系列酶參與的過程，對正常胚胎發(fā)育，維持細胞群體及惡性病變過程中均起重要作用，在保 證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵的角色。在許多心肌損傷或心臟病理狀態(tài)下， 如心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭等，心肌細胞會發(fā)生凋亡；由于成熟的心肌細 胞不能分裂增殖，心肌細胞過度凋亡必然會使心肌細胞數(shù)目減少，這一點可能是一些心臟 疾病發(fā)病的機理。目前研宄發(fā)現(xiàn)許多miRNA通過調(diào)控凋亡相關靶蛋白的表達參與細胞凋亡 的發(fā)生，這些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的，所以尋找心臟中特異表達的、參與心肌細 胞凋亡的miRNA，闡明其作用機理，對于開發(fā)以miRNA為策略的心臟疾病的診斷、治療具有 及其重要的意義和應用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足，尋求提供一種含有miRNA-324的藥 物組合物及其預防或治療心臟疾病的用途。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的含有miRNA-324的藥物組合物包 括miRNA-324和藥學上可接受的載體、病毒或輔料；所用的miRNA-324的序列為 5' -CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3 ;所述載體為殼聚糖、膽固醇、納米顆粒和脂質(zhì)體中的一種 或多種；所述病毒載體為腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種或多種，優(yōu)選 的，本發(fā)明中選擇的病毒載體為腺病毒載體；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽水 中的一種或多種。
[0006] 本發(fā)明中所述的藥物組合物中過表達miRNA-324的病毒載體感染滴度為1016PFU。
[0007] 藥物劑型為口服制劑、注射制劑、片劑、干粉劑型中的一種或多種，優(yōu)選的為注射 用小水針劑或注射用凍干粉針。
[0008] 本發(fā)明的含有miRNA-324的藥物組合物，用于治療心肌梗死、心肌缺血損傷、心肌 肥厚或心肌纖維化的心臟疾病。
[0009] 本發(fā)明涉及的含有miRNA-324的核苷酸序列的藥物組合物在心臟中高表達、 心肌缺血損傷和缺氧誘導的心肌細胞凋亡過程中，miRNA-324表達顯著下調(diào)；通過構(gòu)建 miRNA-324過表達腺病毒或miRNA-324轉(zhuǎn)基因小鼠加強miRNA-324的表達能夠抑制心肌 細胞凋亡及心肌缺血損傷，心肌梗死面積減少；心肌缺血再灌注損傷后，過表達miRNA-324 能夠減輕缺血再灌注損傷所致的凋亡，減小心肌梗死面積，過表達miRNA-324還能改善缺 血再灌注損傷所致的心功能的損傷，抑制內(nèi)源性的miRNA-324能夠加重缺血再灌注損傷； miRNA-324通過抑制心肌細胞凋亡對心臟具有保護作用，miRNA-324對許多心臟疾病具有 潛在的預防和治療價值；給予miRNA-324反義核苷酸抑制miRNA-324的表達則能夠誘導心 肌細胞凋亡，心肌缺血損傷會加重。
[0010] 本發(fā)明設計的藥物組合物與現(xiàn)有技術相比，心肌細胞缺氧或心肌缺血損傷過程 miRNA-324表達顯著下調(diào)，miRNA-324的下調(diào)能誘導心肌細胞凋亡的發(fā)生；miRNA-324在缺 血再灌注動物模型的心肌組織中表達下調(diào)，過表達miRNA-324的心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠， 可以抵抗心肌缺血再灌注損傷，心肌梗死面積減少，心功能顯著改善。通過構(gòu)建能夠過表達 miRNA-324的腺病毒從冠狀動脈注射入小鼠心臟，發(fā)現(xiàn)心肌缺血損傷程度明顯被抑制，動物 模型證明miRNA-324對缺血性心臟病的治療作用，將miRNA-324與載體包裝形成藥物分子， 通過口服或注射用于防治心臟疾病和改善心臟功能，阻止心肌纖維化及心肌重構(gòu)的發(fā)生； 其藥物組合物制備工藝簡單，藥效明顯，使用方便，治療環(huán)境友好。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0011] 圖1為心肌缺血損傷及低氧誘導的心肌細胞凋亡過程中miRNA-324表達水平的變 化的試驗結(jié)果示意圖，圖中A為原代心肌細胞缺氧處理miRNA-324表達水平的試驗結(jié)果示 意圖；B為小鼠心肌缺血miRNA-324表達水平的試驗結(jié)果示意圖。
[0012] 圖2為miRNA-324抑制心肌細胞凋亡的實驗結(jié)果示意圖，圖中A為原代心肌細胞 感染miRNA-324腺病毒miRNA-324過量表達對細胞凋亡的作用實驗結(jié)果示意圖；圖中B為 原代心肌細胞感染miRNA-324腺病毒miRNA-324過量表達對細胞色素 C的釋放作用實驗結(jié) 果示意圖。
[0013] 圖3為miRNA-324過表達抑制心肌缺血損傷實驗結(jié)果示意圖，圖中A為小鼠經(jīng) 注射冠動脈miRNA-324病毒后，其心臟的左心室面積（LV)所占的百分比和危險區(qū)總面積 (AAR)所占的百分比實驗結(jié)果示意圖；圖中B為小鼠經(jīng)注射冠動脈miRNA-324模擬物病毒 后對缺血再灌注手術（I/R)引起的心肌凋亡的影響的實驗結(jié)果示意圖。
[0014] 圖4為小鼠靜脈注射miRNA-324后再進行心肌缺血再灌注后24小時與野生型小 鼠再灌24小時后的心功能狀況比較，圖中A為miRNA-324過量表達對小鼠的左室舒張末 內(nèi)徑（LVIDd)的作用實驗結(jié)果示意圖；圖中B為miRNA-324過量表達對左室收縮末內(nèi)徑 (LVIDs)的作用實驗結(jié)果示意圖；圖中C為miRNA-324過量表達對短軸截短率（FS)的作用 實驗結(jié)果示意圖。
[0015] 圖5為小鼠靜脈注射miRNA-324抑制劑抑制內(nèi)源性miRNA-324及抑制劑陰性對 照后缺血再灌注所致的比較實驗結(jié)果示意圖，圖中A為心肌細胞凋亡的比較實驗結(jié)果示意 圖，圖中B為心肌梗死面積的比較實驗結(jié)果示意圖。

【具體實施方式】：
[0016] 下面結(jié)合附圖并通過實施例對本發(fā)明進一步說明，其實驗小鼠均購自北京醫(yī)科大 學，品系均為C57。
[0017] 實施例1、
[0018] 心肌缺血及心肌細胞缺氧誘導的心肌細胞凋亡過程中miRNA-324表達情況檢 測，本實施例對于心肌細胞凋亡實驗模型，采用本實驗室已建立的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠 原代心肌細胞（大鼠乳鼠購自北京醫(yī)科大學，大鼠品系為Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代 心肌細胞的制備可參見以下文獻：W. -Q. Tan, etal, Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem. 20080ctober 31 ； 283(44) :29730-29739)，低氧培養(yǎng)箱（氧濃度低于1% )培養(yǎng)不同時間，提取RNA，實時熒光 定量PCR技術檢測miRNA-324的表達水平，如圖IA所示，miRNA-324表達水平在低氧處理 IOmin?180min內(nèi)顯著下調(diào)。
[0019] 本實施例以假手術處理的大鼠乳鼠原代心肌細胞作為對照組，采用結(jié)扎大鼠冠狀 動脈建立心肌缺血模型，缺血不同時間取心臟缺血區(qū)及非缺血區(qū)心肌組織，提取總RNA，實 時熒光定量PCR技術檢測miRNA-324的表達水平，如圖IB所示，結(jié)果顯示缺血IOmin? 60min心肌缺血組織較非缺血組織及非缺血模型組miRNA-324表達水平顯著下降。
[0020] 實施例2、
[0021] miRNA-324抑制心肌細胞凋亡的實驗，本實施例涉及的miRNA-324腺病毒的構(gòu)建 采用Ambion公司的pSilencer Adeno I. O-CMV系統(tǒng)。按照公司說明書構(gòu)建相應載體及 腺病毒，具體方法如下：提取大鼠心臟的基因組，以其為模板，PCR擴增miRNA-324及其上 下游兩端各將近200個bp的序列（PCR體系50 μ L，PCR條件如下：95°C 3min-個循環(huán)； 95°C 30s，56°C 30s，72°C Imin共28個循環(huán)；最后72°C延伸5min)，將該擴增片段用spe I 和xho I進行雙酶切，再將腺病毒載體pSilencer Adeno CMVL 0穿梭載體（pSilencer Adeno CMVLOshuttle vector載體）（購自Ambion公司）進行雙酶切后與酶切后的 片段進行連接，即將片段克隆入腺病毒載體中，Pac I酶切線性化該載體及腺病毒骨架 (Adenovirus LacZ Backbone)，共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞（人胚腎細胞，購自上海研生生化試劑 有限公司），包裝腺病毒，擴增收集病毒，測定病毒滴度。
[0022] 本實施例中使用原代培養(yǎng)的心肌細胞為模型。感染上述的miRNA-324腺病毒過 表達miRNA-324,突變的miRNA-324腺病毒作為對照（即miRNA-對照），病毒感染24小時 后，在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理細胞3小時，誘導細胞凋亡；臺盼蘭染色方法檢測心肌細胞凋 亡情況，結(jié)果見圖2A。同時又檢測了細胞色素 C的釋放用來證明凋亡的發(fā)生（圖2B)，其 中線粒體部分以COX IV為陽性對照，細胞質(zhì)部分以微管蛋白為陽性對照。結(jié)果顯示過表達 miRNA-324可以顯著抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。
[0023] 實施例3、
[0024] miRNA-324過表達抑制心肌缺血損傷實驗驗證，本實施例設計的小鼠經(jīng)冠狀動 脈注射miRNA-324模擬物可顯著抑制心肌缺血再灌注損傷，以C57小鼠為實驗對象，按 照如下方法注射miRNA-324模擬物（miRNA-324mimic)及miRNA-324模擬物陰性對照 (miRNA-324mimic NC)，并以假手術處理小鼠為作為對照組，以C57小鼠為野生型。小鼠稱 重并麻醉，仰臥位固定，剪毛并用碘酒消毒手術區(qū)；頸部正中切開氣管并插管，連動物呼吸 機進行正壓通氣，在胸骨左緣處及心臟搏動處縱行切開皮膚約3cm，逐層鈍性分離皮下組 織、肌肉，開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟；稀釋2X IO11Pfu(感染系數(shù)）腺病 毒于PBS中，終體積為200 μ L，26號導管從心尖進入動脈根部，注射病毒時同時夾閉主動 脈及肺動脈，持續(xù)夾閉20秒；監(jiān)測5min，待心臟恢復竇律后，清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭 注射器抽吸氣體關閉胸腔；等小鼠清醒后，脫離呼吸機，放回籠中，心電圖監(jiān)測整個手術過 程；注射病毒3天后進行心臟缺血再灌注手術，具體操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于實 驗用木板上，并進行心電圖監(jiān)測，頸部正中切開氣管并插管，連動物人工呼吸機，于第四肋 間開胸，小心提起心包并剪開，充分暴露心臟、血管；在肺動脈圓錐和左心耳之間，以左冠 狀靜脈主干為標志，于左心耳根部下方2_處進針，進針深度0. 5_ ;以6/0帶針縫合線穿 過心肌表層，在肺動脈圓椎旁出針；待心電圖恢復穩(wěn)定IOmin后，予以結(jié)扎左冠狀動脈前 降支（LAD)，以ST段弓背向上抬高大于0. Imv并持續(xù)0. 5h以上作為結(jié)扎成功的標志，缺 血45min之后，松開結(jié)扎線開始再灌注；以ST段下降為標志，清除胸腔內(nèi)積血并用去針頭 注射器抽吸氣體關閉胸腔，再灌注24h用伊文氏藍雙染測定心肌梗死面積；結(jié)果顯示：注射 miRNA-324mimic的小鼠 I/R組心肌梗死面積比野生小鼠 I/R組明顯降低，有統(tǒng)計學差異 (p〈0. 01)，見圖3A ;其心梗面積按如下方法計算：左心室面積（left ventricle，LV)為藍 色、紅色和白色面積之和；危險區(qū)總面積（area at risk，AAR)為紅色和白色面積之和；梗 死區(qū)面積（infarct area，INF)為白色面積；危險區(qū)面積（AAR/LV，％ )=(危險區(qū)總面積/ 左心室面積）X 100%，心梗面積（INF/AAR，％ )=(梗死區(qū)面積/危險區(qū)總面積）X 100%; 同時又檢測了注射miRNA-324mimic對I/R的凋亡的影響，用細胞凋亡檢測試劑盒（TUNEL 法）檢測（圖3B)，結(jié)果表明注射了 miRNA-324mimic的組份與I/R組份相比凋亡率明顯的 減小，即miRNA-324對心肌具有保護作用。
[0025] 實施例4、
[0026] miRNA-324過表達顯著抑制心肌缺血再灌注引起的心功能的損傷，本實施例對 實驗小鼠分別進行假手術處理作為對照組，缺血再灌注手術處理作為為缺血再灌組，注射 miRNA-324模擬物后進行缺血再灌注手術處理（作為miRNA-324模擬物）及注射miRNA-324 模擬物陰性對照后再進行缺血再灌注手術處理（作為miRNA-324模擬物陰性對照）；以購 自上海吉瑪公司的一段無關序列為陰性對照序列，其不抑制現(xiàn)有已知的任何基因的表達， 為了證明目標的小RNA即miRNA-324的有效性，在購買miRNA-324模擬物的時候公司都會 配送一個目標小RNA的陰性對照以此來證明我們目標小RNA的有效性；對實驗小鼠各組別 進行超聲心動的心功能檢測，檢測指標包括（圖4A)左室舒張末內(nèi)徑（LVIDd)、（圖4B)左 室收縮末內(nèi)徑（LVIDs)和（圖4C)短軸截短率（FS)，結(jié)果表明miRNA-324模擬物的注射可 以改善缺血再灌手術造成的心功能的損傷。
[0027] 實施例5、
[0028] 抑制內(nèi)源性miRNA-324可加重缺血再灌注所致的心肌細胞凋亡、心肌梗死面積， 本實施例對小鼠尾靜脈30mg/kg注射miRNA-324抑制劑及陰性對照（功能同實施例4中相 同的無序序列），以假手術處理小鼠作為對照組；三天后進行缺血再灌注手術，再灌注3h監(jiān) 測心肌細胞凋亡，再灌注24小時用伊文氏藍雙染測定心肌梗死面積；與陰性對照注射組相 比，miRNA-324抑制劑I/R組心肌細胞凋亡率明顯增高（圖5A)，心肌梗死面積顯著增高（圖 5B)，說明抑制內(nèi)源性miRNA-324可加重缺血再灌注所致的心肌細胞凋亡、心肌梗死面積。
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種含有miRNA-324的藥物組合物，其特征在于藥物組合物包括miRNA-324和藥學 上的載體、病毒或輔料；所用的miRNA-324的序列為5'-CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU-3 ;所述 載體為殼聚糖、膽固醇、納米顆粒和脂質(zhì)體中的一種或多種；所述病毒載體為腺病毒載體、 慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的一種或多種；所述輔料為甘露醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽 水中的一種或多種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有miRNA-324的藥物組合物，其特征在于藥物組合物 中過表達miRNA-324的病毒載體感染滴度為1016PFU。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種含有miRNA-324的藥物組合物，其特征在于藥物劑型為 口服制劑、注射制劑、片劑、干粉劑型中的一種或多種。
4. 一種含有miRNA-324的藥物組合物的用途，其特征在于用于治療心肌梗死、心肌缺 血損傷、心肌肥厚或心肌纖維化的心臟疾病。
【文檔編號】A61P9/10GK104491878SQ201410803075
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】王昆, 李培峰 申請人:青島大學