一種親和層析純化烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種親和層析純化烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物。具體的說，就是以健康成年男性新鮮尿液為原料，經(jīng)過甲殼質(zhì)吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析、吸附柱層析以及親和層析等現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)來制備高純度的烏司他丁，可以將總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg。
【專利說明】一種親和層析純化烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說涉及一種應(yīng)用親和層析法制備收率高、效價(jià)穩(wěn)定的烏司他丁的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]烏司他丁(ULinastatin)系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強(qiáng)的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約37000~43000，屬于蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子(MDF)產(chǎn)生、清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時(shí)的循環(huán)狀態(tài)等。
[0003]1909年歐洲首先報(bào)道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體受到感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)、給予糖皮質(zhì)激素等刺激時(shí)，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開發(fā)上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的治療藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。
[0004]本發(fā)明人自2008年開始對UTI的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研宄，采用現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，使UTI的總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)3；可控。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種親和層析純化烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統(tǒng)方法提取烏司他丁收率過低、效價(jià)不高不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，采用親和層析來純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁的收率，保證了效價(jià)的穩(wěn)定。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種親和層析純化烏司他丁的方法及含有烏司他丁的藥物組合物，其特征在于:選用特異樹脂的親和層析來純化烏司他丁，可以使總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mgo
[0007]該技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征:所述親和層析法包括如下步驟:
I)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0008]2)吸附柱層析(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2)陰離子交換柱用洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120~130mL/min左右；
2.3)用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0009]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在120~130mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，流速120~130mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C 洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120~130mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至一定體積，超濾液中加入一定量磷酸氫二鈉溶液，繼續(xù)超濾至同一體積，然后再加入等量磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至相同體積。
[0010]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0011]5)凍干
將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0012]經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率高達(dá)70%以上，按中國藥典所示方法測定，總效價(jià)高達(dá) 5000iu/mg 以上。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
選用親和層析純化烏司他丁，可以更有效的去除烏司他丁中的多種雜蛋白，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而使產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過工藝的不斷改進(jìn)和完善，使得烏司他丁總收率達(dá)到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制。
[0015]實(shí)施例1
I)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)，并用精密pH試紙測定，調(diào)節(jié)尿液PH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脫lh，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品O
[0016]2)吸附柱層析(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液； 2.2)陰離子交換柱用2.5L的洗脫液A平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120mL/min左右；
2.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0017]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用3.0L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在1 20mT,/mi η ；
3.2)上樣結(jié)束后，用1L的洗脫液C洗脫，流速120mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C 洗脫后，用5.0L的洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續(xù)超濾至170mL,然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至170mL。
[0018]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0019]5)凍干
將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0020]經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率為73%，按中國藥典所示方法測定，總效價(jià)高達(dá)5210iu/mgo
[0021]實(shí)施例2
I)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)，并用精密pH試紙測定，調(diào)節(jié)尿液PH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脫lh，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品O
[0022]2)吸附柱層析(以0.25L柱體為例)
2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2)陰離子交換柱用3.0L的洗脫液A平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的樹脂柱，流速控制在130mL/min左右；
2.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130mL/min，得洗脫液；
2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0023]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用3.0L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在130mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用1L的洗脫液C洗脫，流速130mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C 洗脫后，用7.5L的洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在130mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續(xù)超濾至170mL,然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至170mL。
[0024]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0025]5)凍干
將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。
[0026]經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率為71%，按中國藥典所示方法測定，總效價(jià)高達(dá)5132iu/mg。
[0027]實(shí)施例3
取實(shí)施例2中制備的烏司他丁 I億單位，稱取30g甘露醇，人血白蛋白5g，1g右旋糖酐70，加500ml注射用水溶解，混合后調(diào)節(jié)pH值至6.5，然后再加注射用水至2000ml，聚醚砜超濾膜無菌過濾，分裝于1000個(gè)已處理好的西林瓶中，凍干、乳蓋即可。
[0028]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種純化烏司他丁的方法，該方法包括:將烏司他丁粗品通過離子交換層析、超濾液沉淀、沉淀物凍干步驟進(jìn)行純化，所得純化后的烏司他丁的總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述烏司他丁粗品是通過以男性尿液為原料，將原料依次經(jīng)過甲殼質(zhì)吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析制備得到的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述吸附柱層析包括如下步驟: (O用洗脫液A溶解烏司他丁粗品，攪拌、離心，留取離心液，所述洗脫液A為0.01-0.3moL/L的醋酸鹽緩沖液； (2)用洗脫液B平衡吸附柱，將上述離心液上柱，洗脫液B為0.01-0.5moL/L醋酸鈉和0.l-5moL/L NaCl 的緩沖液； (3)用洗脫液B洗脫吸附柱，收集洗脫液； (4)用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液上柱，洗脫液C為0.01-0.5moL/L甘氨酸和0.l-5moL/L NaCl 的緩沖液； (5)上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，收集洗脫液； (6 )柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C 洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，密封待用，洗脫液D為0.01-0.3moL/L鹽酸和0.l-5moL/L NaCl的緩沖液； (7)將洗脫液經(jīng)超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復(fù)超濾，得超濾液。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.5moL/L0
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述吸附柱為陰離子交換柱。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換柱包括:強(qiáng)陰離子交換柱Q-Sephadex A-25, Q-Sephadex A-50, Q-Sephadex C-25, Q-Sephadex C-50 ;弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-CelluloseDE-52，DEAE-Cellulose DE-53。
7.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述親和層析柱包括:CM_SephadexA-25,CM-Sephadex A-50,CM-Sephadex C-25,CM-Sephadex C-50, SP-Sepharose2B, SP-Sepharose 4B, SP-Sepharose 6B，SP-Sepharose CL-2B, SP-SepharoseCL-4B, SP-Sepharose CL-6B。
8.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述超濾液沉淀步驟包括:超濾液中加入乙醇沉淀。
9.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-8制備的烏司他丁作為活性成分，還含有人血白蛋白、甘露醇、右旋糖酉干70。
【文檔編號】A61P9/02GK104497134SQ201410807914
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】劉乃山, 林曉磊, 劉翠珍 申請人:青島康原藥業(yè)有限公司