一種大型海藻活性素的生物提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大型海藻活性素的生物提取方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)活性成分提取方法易破壞有效成分，且提取劑用量大、提取效率低的問題。大型海藻活性素的仿生提取方法，包括以下步驟：1）配制仿生胃液；2）配制仿生腸液；3)將海藻干燥粉碎并50-80目篩過篩，得較均勻的海藻粉末；4)向海藻粉末加入仿生胃液，發(fā)酵30-50h；5)發(fā)酵后的藥物采用孔徑為0.005-0.01um的超濾膜過濾；6)向超濾透過液中加入仿生腸液，將PH調(diào)為6.5-7.5。本發(fā)明方法提取的大型海藻活性素，有效成分提取充分，吸收速度快、有效組分的結(jié)構(gòu)或組成不變。本發(fā)明是天然藥物應(yīng)用領(lǐng)域的重要突破。
【專利說明】一種大型海藻活性素的生物提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵提取【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種大型海藻活性素的生物發(fā)酵提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]天然產(chǎn)品的成分復(fù)雜，且多種有效成分進(jìn)入人體后相互配合、協(xié)同作用，而后起到治療疾病的作用。傳統(tǒng)的提純分離技術(shù)，如煎煮法、回流、浸漬等，以及現(xiàn)代中藥提取分離技術(shù)，如超微粉碎技術(shù)、超臨界萃取技術(shù)、逆流動態(tài)提取技術(shù)、吸附分離純化技術(shù)、膜分離技術(shù)等，均沿用純粹傳統(tǒng)的物理或化學(xué)手段，與吸收入人體的中藥有效成分的協(xié)同作用無關(guān)，易破壞中藥有效成分的結(jié)構(gòu)或組成，難以將中藥中含有的有效成分完全提取出來，且提取劑用量大、需反復(fù)提取、提取效率低、周期長。
[0003]仿生提取法是近幾年提出的新方法，它是從生物藥劑學(xué)的角度，將整體藥物研宄法與分子藥物研宄法相結(jié)合，模擬口服藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的環(huán)境，采用活性指導(dǎo)下的導(dǎo)向分離法。該方法不僅能充分發(fā)揮中藥混合物的綜合作用，又能利用單體成分控制中藥制劑的質(zhì)量，有效成分損失少。但是現(xiàn)有仿生提取技術(shù)中使用的仿生液僅僅是模仿胃液或腸液的PH值，仿生程度低，有效成分的提取效率以及有效成分的損失依然沒有明顯改善。
[0004]比如，公布號為“CN102266370 ”的中國發(fā)明專利公開了一種杭白菊中抗胃癌活性物質(zhì)的半仿生提取方法，包括以下步驟:1)將干燥的杭白菊粉碎后過40-60目篩，然后加入PH為2.0-2.2的緩沖液I，置于36.5-37.5°C水浴中提取1_2小時；提取結(jié)束后過濾，棄去濾液I ;2)在步驟I)所得濾渣中加PH為7.8-8.2的緩沖液II，置于36.5-37.5°C水浴中提取1-2小時；提取結(jié)束后，過濾，去濾液II ;濾液II經(jīng)干燥處理，得杭白菊抗癌提取物。
[0005]大型海藻活性素是人或動物通過胃液消化分解再分段排入十二指腸、小腸吸收后通過門靜脈到達(dá)肝臟，經(jīng)肝臟分解后通過血液靶向性到達(dá)病灶起作用。目前尚沒有高效且對有效成分無損害的大型海藻活性素提取方法。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種大型海藻活性素的生物提取方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的大型海藻活性素提取方法，易破壞海藻有效成分的結(jié)構(gòu)或組成，難以將海藻中含有的有效成分完全提取出來，且提取劑用量大、需反復(fù)提取、提取效率低、周期長的問題。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種大型海藻活性素的生物提取方法，包括以下步驟:
I)制備仿生胃液:
a.取濃度為17-1O8cfu /ml的乳桿菌菌和濃度為106-107cfu/ml的酵母菌按體積3:1進(jìn)行混合；
b.向混合菌液中加入濃度為3mol/L的稀鹽酸，調(diào)節(jié)混合液PH值至0.9-1.5 ； C.加入氯化鈉飽和溶液，調(diào)節(jié)溶液密度至1.006-1.009g/ml，以保證所述仿生胃液的滲透壓等同于人體胃液；
d.加入營養(yǎng)平衡劑，營養(yǎng)平衡劑中山藥粉和黃原膠的濃度均為0.5-2g/100ml ；
e.加入胃蛋白酶，濃度為0.5-2g/100ml ；
f.加入穩(wěn)定調(diào)節(jié)劑，其中枸櫞酸鈉濃度為l_3g/100ml，葡萄糖濃度為2-4g/100ml；
2)制備仿生腸液:
a.取濃度為5X106-107cfu/ml的芽孢桿菌菌液；
b.向芽孢桿菌菌液中加入高濃度K2PO4S液，使混合液中的K#04的濃度為
0.8-1.5g/100ml ；
c.加入濃度為5%的胰酶水溶液，調(diào)節(jié)到胰酶的濃度為0.25-0.5% ；
d.用濃度為0.1-0.3mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8-10 ；
3)將大型海藻干燥粉碎并過50-80目篩；
4)將過篩后海藻粉末加入上述仿生胃液，使仿生胃液浸沒海藻粉末，然后發(fā)酵20-50h ；
5)發(fā)酵后的藥物采用孔徑為0.005-0.0lum的超濾膜過濾；
6)向超濾液中加入仿生腸液，調(diào)節(jié)PH為6.5-7.5，得大型海藻活性素提取物。
[0009]本發(fā)明的大型海藻活性素的生物提取方法中:
A菌植入培養(yǎng)基，在37°C、厭氧條件下培養(yǎng)20-40h，得A菌菌液。
[0010]A菌培養(yǎng)基:酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺 2.0g, Tween 80 1.0g，磷酸氫二鉀 2.0g, MgS04.7H20 0.2g，MnS04.H20
0.05g，CaC03 20.0g，瓊脂 15.0g，蒸餾水 1.0L，pH6.8。
[0011]釀酒酵母菌植入培養(yǎng)基，在25-28°C、厭氧條件下培養(yǎng)20-40h，得釀酒酵母菌菌液。
[0012]釀酒酵母菌培養(yǎng)基:5° Β?麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g。
[0013]嗜堿性枯草芽孢桿菌植入培養(yǎng)基，在28_28°C、有氧條件下培養(yǎng)20_40h，得嗜堿性芽孢桿菌菌液。
[0014]枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基:氯化鈉0.5克，瓊脂2克，牛肉膏I克，蛋白胨I克，水100 毫升，PH 7.2。
[0015]本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明的大型海藻活性素的生物提取方法，將海藻一般性粉碎后，用仿生胃液對海藻粉進(jìn)行仿生學(xué)生物活性發(fā)酵，再采用膜分離法進(jìn)行大型海藻活性素的提取。然后采用仿生腸液將所提取的大型海藻活性素溶液的PH調(diào)節(jié)6.5-7.5，使活性素溶液呈弱堿性、中性或弱酸性，適合服用，同時仿生腸液調(diào)節(jié)PH，可以提高大型海藻活性素的吸收速度。
[0016]本發(fā)明大型海藻活性素的生物提取方法中未使用對海藻中的有效成分產(chǎn)生破壞性的手段，所提取的大型海藻活性素有效成分的結(jié)構(gòu)或組成不變；本發(fā)明方法對海藻的大型海藻活性素的提取率高，另外，采用本發(fā)明的大型海藻活性素的生物提取方法所提取的大型海藻活性素不需要胃、腸液消化分解，能夠直接進(jìn)入病灶，提高中藥有效成分的吸收速度。
[0017]下面結(jié)合一臨床病例進(jìn)一步說明本發(fā)明: 周某，女，46歲，山東安丘人，2013年10月初診，胃脘隱痛2年，胃部不舒，近兩個月加重，胃痛喜溫喜按，偶有呃逆，無泄瀉。精神萎靡，四肢怕冷，喜熱惡涼，睡覺時兩腳怕冷加重。平素血壓偏低(105/60mmHg)，常覺頭暈、眼花。舌質(zhì)淡紅苔中部薄白，邊有齒痕，左寸關(guān)脈弦細(xì)，右關(guān)脈沉弦略弱。鏡檢所見:胃底粘膜粗糙，充血，胃體皺襞排列整齊，粘膜彌漫性充血水腫，密集斑點(diǎn)樣糜爛有出血點(diǎn)，胃角形態(tài)正常粘膜充血，胃竇粘膜彌漫性充血水腫，散在斑片樣糜爛，幽門粘膜充血。結(jié)論:非萎縮性胃炎。
[0018]采用本發(fā)明的大型海藻活性素的生物提取方法制得的藥物治療，經(jīng)本發(fā)明提取方法提取得到微黃色大型海藻活性素液，每次50ml，一日服用三次。服用后即痛疼見輕，共服用10天，以后患者自述已無胃痛至今。
[0019]注意事項(xiàng):在應(yīng)用本生物藥品時，不得與其它抗生素共同使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為采用本發(fā)明的大型海藻活性素的生物提取方法制備含大型海藻活性素藥物的工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021]下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022]本發(fā)明的大型海藻活性素的生物提取方法中用到的菌種由中國食品工業(yè)發(fā)酵研宄院提供。
[0023]實(shí)施例1
本發(fā)明的大型海藻活性素的生物提取方法包括以下步驟:
(O制備仿生胃液:
取600mlA菌液和200ml釀酒酵母菌菌液混合，取濃度為3mol/L的稀鹽酸，調(diào)節(jié)混合菌液的PH至1.3，加入氯化鈉固體，調(diào)節(jié)溶液的密度至1.006-1.009g/ml，WA8g山藥粉，加入Sg黃原膠，山藥粉和黃原膠作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，加入Sg胃蛋白酶，加入16g枸櫞酸鈉，加入24g葡萄糖，枸櫞酸鈉和葡萄糖作為穩(wěn)定調(diào)節(jié)劑，制得仿生胃液。
[0024](2)制備仿生腸液
取嗜堿性芽孢桿菌濃度為5X 106-107cfu/ml的菌液500ml，加入6g磷酸二氫鉀固體進(jìn)行溶解，然后加入到菌液中。取3.0g胰酶，加入300ml水使之溶解。將步驟上市所得的混合菌液與胰酶溶液混合，并稀釋至1000ml。
[0025](3)取Ikg海藻粉，向中藥粉末中加入仿生胃液，仿生胃液浸沒中藥粉末，發(fā)酵36ho發(fā)酵完成后，將發(fā)酵后的藥物采用0.005um的超濾膜過濾。向超濾膜過濾后所得的透過液中加入仿生腸液，采用仿生腸液調(diào)節(jié)PH至7，得大型海藻活性素提取物。向大型海藻活性素提取物中加入口服液復(fù)配制劑，制得含大型海藻活性素的口服液。
[0026]實(shí)施例2
(O制備仿生胃液: 取900mlA菌液和300ml釀酒酵母菌菌液混合，取濃度為3mol/L的稀鹽酸，調(diào)節(jié)混合菌液的PH至1.0，加入氯化鈉固體，調(diào)節(jié)溶液的密度至1.008g/ml，加入18g山藥粉，加入18g黃原膠，山藥粉和黃原膠作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，加入18g胃蛋白酶，加入32g枸櫞酸鈉，加入32g葡萄糖，枸櫞酸鈉和葡萄糖作為穩(wěn)定調(diào)節(jié)劑，制得仿生胃液。
[0027](2)制備仿生腸液
取嗜堿性芽孢桿菌濃度為5X 106-107cfu/ml的菌液500ml，加入6g磷酸二氫鉀固體進(jìn)行溶解，然后加入到菌液中。取5.0g胰酶，加入300ml水使之溶解。將步驟上市所得的混合菌液與胰酶溶液混合，并稀釋至1000ml。
[0028](3)取Ikg海藻粉，向中藥粉末中加入仿生胃液，仿生胃液浸沒中藥粉末，發(fā)酵48ho發(fā)酵完成后，將發(fā)酵后的藥物采用0.0lum的超濾膜過濾。向超濾膜過濾后所得的透過液中加入仿生腸液，采用仿生腸液調(diào)節(jié)PH至7，得大型海藻活性素提取物。向大型海藻活性素提取物中加入口服液復(fù)配制劑，制得含大型海藻活性素的口服液。將制得的發(fā)酵含大型海藻活性素口服液經(jīng)負(fù)壓濃縮并干燥后進(jìn)行超微粉碎，制成膠囊制劑，得含大型海藻活性素的膠囊。
[0029]實(shí)施例3
取900mlA菌液和300ml釀酒酵母菌菌液混合，取濃度為3mol/L的稀鹽酸，調(diào)節(jié)混合菌液的PH至1.5，加入氯化鈉固體，調(diào)節(jié)溶液的密度至1.006g/ml，加入24g山藥粉，加入24g黃原膠，山藥粉和黃原膠作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑，加入18g胃蛋白酶，加入32g枸櫞酸鈉，加入48g葡萄糖，枸櫞酸鈉和葡萄糖作為穩(wěn)定調(diào)節(jié)劑，制得仿生胃液。取嗜堿性芽孢桿菌濃度為5X 106-107cfu/ml的菌液500ml，加入6g磷酸二氫鉀固體進(jìn)行溶解，然后加入到菌液中。取5.0g胰酶，加入300ml水使之溶解。將步驟上市所得的混合菌液與胰酶溶液混合，并稀釋至100ml。取Ikg海藻粉，向中藥粉末中加入仿生胃液，仿生胃液浸沒中藥粉末，發(fā)酵36h。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵后的藥物采用0.005um的超濾膜過濾。向超濾膜過濾后所得的透過液中加入仿生腸液，采用仿生腸液調(diào)節(jié)PH至7，得大型海藻活性素提取物。向大型海藻活性素提取物中加入口服液復(fù)配制劑，制得含大型海藻活性素的口服液。將制得的發(fā)酵含大型海藻活性素口服液經(jīng)負(fù)壓濃縮并干燥后進(jìn)行超微粉碎，制成膠囊制劑，得含大型海藻活性素的膠囊。
[0030]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種大型海藻活性素的生物提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)制備仿生胃液: a.取濃度為17-1O8cfu /ml的乳桿菌菌和濃度為106-107cfu/ml的酵母菌按體積3:1進(jìn)行混合； b.向混合菌液中加入濃度為3mol/L的稀鹽酸，調(diào)節(jié)混合液PH值至0.9-1.5 ； c.加入氯化鈉飽和溶液，調(diào)節(jié)溶液密度至1.006-1.009g/ml，以保證所述仿生胃液的滲透壓等同于人體胃液； d.加入營養(yǎng)平衡劑，營養(yǎng)平衡劑中山藥粉和黃原膠的濃度均為0.5-2g/100ml ； e.加入胃蛋白酶，濃度為0.5-2g/100ml ； f.加入穩(wěn)定調(diào)節(jié)劑，其中枸櫞酸鈉濃度為l_3g/100ml，葡萄糖濃度為2-4g/100ml； 2)制備仿生腸液: a.取濃度為5X106-107cfu/ml的芽孢桿菌菌液； b.向芽孢桿菌菌液中加入￥04飽和溶液使混合液中的K2P04W濃度為0.5-1.2g/100ml ； c.加入濃度為5%的胰酶水溶液，調(diào)節(jié)到胰酶的濃度為0.25-0.5% ； d.用濃度為0.1-0.3mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8-10 ； 3)將大型海藻干燥粉碎并過50-80目篩； 4)將過篩后海藻粉末加入上述仿生胃液，使仿生胃液浸沒海藻粉末，然后發(fā)酵20-50h ； 5)發(fā)酵后的藥物采用孔徑為0.005-0.0lum的超濾膜過濾； 6)向超濾液中加入仿生腸液，調(diào)節(jié)PH為6.5-7.5，得大型海藻活性素提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻活性素的生物提取方法，其特征在于:所述乳酸桿菌為開A菌，所述酵母菌為釀酒酵母菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻活性素的生物提取方法，其特征在于:所述仿生胃液中山藥粉和黃原膠的濃度均為0.5-2g/100ml、胃蛋白酶的濃度為0.5_2g /100ml、枸櫞酸鈉的濃度為l_3g/100ml、所述葡萄糖的濃度為2-4g/100ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻活性素的生物提取方法，其特征在于:所述芽孢桿菌為嗜堿性枯草芽孢桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大型海藻活性素的生物提取方法，其特征在于:所述仿生腸液中 1(2?04的濃度為 0.5-1.2g/100ml、胰酶的濃度為 0.25-0.5g/100ml。
【文檔編號】A61K36/03GK104490940SQ201510006265
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月7日
【發(fā)明者】郭建東 申請人:山東科技職業(yè)學(xué)院