rhEGF在制備預(yù)防、治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了rhEGF的一種新的醫(yī)藥用途，具體而言，是將rhEGF用于制備預(yù)防治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥物或保健品中的新用途。藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rhEGF可使內(nèi)源性VEGF表達(dá)增加，改善腦神經(jīng)功能，增加腦部微血管密度，說明藥物可能通過復(fù)雜的信號通路，如調(diào)控炎性因子釋放、NO和氧自由基的釋放和微血管再生等，修復(fù)受損腦組織，改善TBI大鼠的神經(jīng)功能等，達(dá)到治療TBI，改善癥狀的目的。
【專利說明】rhEGF在制備預(yù)防、治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及rhEGF在預(yù)防、治療腦血管疾病中的用途，尤其涉及rhEGF用于預(yù)防、 治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥物制備中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦血管疾病是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類生命健康的主要疾病之一，是我國的常見 病、多發(fā)病。創(chuàng)傷性腦損傷（traumaitc brain injury，TBI)是神經(jīng)外科領(lǐng)域常見的急癥之 一，尤其是重型TBI，死亡率達(dá)到30% -50%;即便存活下來，其中輕度損傷患者中的10% 會遺留永久殘疾，中度和重度患者可達(dá)到66%和100%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，TBI目前已成為全世界 35歲以下青壯年人群第一位死亡和致殘?jiān)?。在我國，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，交通運(yùn)輸業(yè)、 建筑業(yè)、體育事業(yè)發(fā)展十分迅速，交通事故、建筑工傷、運(yùn)動意外事故等意外傷害大大增 力口，由此造成腦外傷的發(fā)病率逐年增高,對社會和病人家庭造成極大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。近 20年來，有興奮性氨基酸學(xué)說、Ca2+超載學(xué)說、血管損傷學(xué)說等，但依據(jù)這些理論設(shè)計(jì)和 制造的許多神經(jīng)保護(hù)劑，療效不佳。深入研究TBI具體的病理機(jī)制及保護(hù)機(jī)制，開拓有效 治療TBI的藥物已成為不容忽視的社會性問題，研發(fā)理想的TBI保護(hù)劑和治療策略顯得十 分緊迫和必要。
[0003] 基因重組人表皮生長因子（recombinant human Epidermal Growth Factor, rhEGF)在醫(yī)學(xué)上有顯著的創(chuàng)傷修復(fù)、愈合傷口等功效。近年來發(fā)現(xiàn)，rhEGF在美容 產(chǎn)品領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景，具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞更新、防止皮膚衰老等功能。本發(fā)明研 究發(fā)現(xiàn)，rhEGF對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠有治療作用，從而為創(chuàng)傷性腦損傷的治療提供了新思 路，其作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供rhEGF的一種新的醫(yī)藥用途，具體而言，是將rhEGF用于制 備預(yù)防治療腦部疾病的藥物或保健品中的新用途，更進(jìn)一步的，所述腦部疾病為TBI。所述 的TBI疾病包括：由作用于腦底或脊柱的物理力，局部缺血，中風(fēng)，呼吸停止，心跳停止，腦 血檢形成或檢塞，AIDS所致神經(jīng)障礙，和大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術(shù)后事件，腦感染，震 蕩或顱內(nèi)壓升高所引起的創(chuàng)傷性腦損傷，和/或上述病癥的后遺癥。
[0005] 本發(fā)明還提供rhEGF作為VEGF表達(dá)調(diào)節(jié)劑的用途，可使內(nèi)源性VEGF表達(dá)增加，可 用于制備調(diào)節(jié)VEGF的藥物或保健品中。
[0006] 本發(fā)明還提供rhEGF在制備改善腦神經(jīng)功能的藥物或保健品中的用途。
[0007] 本發(fā)明還提供rhEGF在制備增加腦部微血管密度的藥物或保健品中的用途。
[0008] 本發(fā)明的目的還在用提供一種用于治療TBI的藥物組合物，其中包括活性成分 rhEGF和藥學(xué)可接受載體。
[0009] 本發(fā)明的藥物組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于：甘露醇、山 梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨 酸、維生素 A、維生素 C、維生素 E、維生素 D、氮酮、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸 鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木 糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維 素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司班-80、 蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿素、尿囊 素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、 滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂，植物油：大豆油、中鏈油、橄欖油、茶油、棕櫚油、當(dāng)歸油、沙棘 油、莪術(shù)油、川芎油、薏米仁油、紅花油、花椒油、大蒜油；磷脂：蛋黃卵磷脂、大豆磷脂、氫化 蛋黃卵磷脂、氫化大豆磷脂、人工合成磷脂；聚乙二醇磷脂或其衍生物，選自：聚乙二醇-腦磷脂或其衍生物、聚乙二醇-膽固醇或其衍生物、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油酯或其衍 生物、聚乙二醇-脂肪酸酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪胺或其衍生物、聚乙二醇-脂肪醇 或其衍生物、以及含有脂溶性高分子片段的聚乙二醇磷脂衍生物；油酸或油酸鹽，選自：油 酸、油酸鉀鹽、油酸鈉鹽；抗氧化劑：維生素 E ;亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、維生素 C ;控制陽 離子濃度的絡(luò)合劑，選自=EDTA或其它離子絡(luò)合劑。
[0010] 本發(fā)明所述的藥物組合物，可以以藥物制劑的形式存在，可以是任何一種可服用 的藥物制劑形式，如：片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊 齊?、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟 膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、滴丸或貼劑。
[0011] 本發(fā)明的藥物組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，如一日2-3次。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 創(chuàng)傷性腦損傷藥理實(shí)驗(yàn) 1動物分組和模型的建立 140只SPF級健康雄性Wistar大鼠，體重250-280g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué) 院提供。隨機(jī)分成正常組、模型組、藥物組和溶劑組。每組又分為術(shù)后l、4、7d和14d亞組， 每亞組8只（實(shí)驗(yàn)共140只大鼠，模型制作死亡12只，剔除)。參考Feeney's落體法，用1% 戊巴比妥鈉（40mg/kg)腹腔麻醉，將大鼠俯臥位并固定。頭頂部剪毛、消毒、鋪巾。沿頭皮 正中切開頭皮，在右側(cè)頂骨開骨窗，直徑〇. 5cm，暴露硬腦膜。以25g重錘自32cm處自由落 下(在圓形套管內(nèi)），擊中骨窗下硬腦膜，造成右頂葉腦挫傷。藥物組在制模后立即經(jīng)靜脈注 入藥物100 μ m/kg ;溶劑組在靜脈注入與藥物組等量的溶劑，排除溶劑的影響；模型組用等 量生理鹽水建立模型；正常組僅麻醉與手術(shù)。 2標(biāo)本的收集與處理 實(shí)驗(yàn)動物在TBI后各個時間點(diǎn)經(jīng)觀察神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后，1%戊巴比妥鈉（40mg/kg)腹腔 麻醉、迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管后，先用IOOml生理鹽水快速沖洗，隨后用40g/ L多聚甲醛磷酸緩沖液心臟灌注約30min，灌畢立即取腦浸入上述緩沖液中固定ld，常規(guī)脫 水、浸蠟、包埋。予正中隆起水平行4 μ m連續(xù)冠狀切片，備免疫組化使用。另外4只1%戊巴 比妥鈉（40mg/kg)腹腔麻醉，迅速斷頭后取新鮮腦組織，液氮冷存，備Western blot和real time RT-PCR 使用。 3神經(jīng)行為評分 采用Menzies等大鼠走橫木試驗(yàn)方法評價大鼠精細(xì)運(yùn)動功能恢復(fù)情況。于TBI前1周 及TBI后l、4、7d和14d由2人同時測試評分。 4免疫組織化學(xué)檢測微血管密度 取上述切片，在2g/L Triton X 2100液中孵育40min (室溫)，將切片分別浸入兔抗大鼠 VIII因子相關(guān)抗原抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），4°C孵育48h，PBS洗滌3次，然 后利用SABC試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)，最后使用DAB顯 色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行顯色反應(yīng)30min，充分水洗，酒精脫水，二甲苯 透明，封片。光鏡(德國Leica公司）下觀察。
[0013] 5Westem_blot 檢測 VEGF 蛋白表達(dá) 取50mg標(biāo)本組織，制成勻漿，冰浴下加入300 μ 1預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（50mm/L的Tris-HCl pH7. 6 ,200mmol/L, NaCl,2 mmol/LEDTA,1% (V/V) Tritonx-100,0. Olmm/LPMSF),以 12000rpm/min 4°C離心15min。抽提蛋白(凱基全蛋白提取試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有 限公司），用BCA試劑盒以570nm于酶標(biāo)儀上測定蛋白含量。制備12%十二基甲酸鈉一聚丙 烯酰胺凝膠（8%分離膠，6%濃縮膠)，每孔加入60 μ g蛋白質(zhì)，恒壓120V電泳I. 5h，轉(zhuǎn)移到硝 酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2h后，分別加入兔抗大鼠 VEGF抗體和抗β-actin單抗(美 國Santa Cruz Biotechnology), 37°C搖床lh，PBST洗漆3次，IOmin/次，然后加入與結(jié)合含 有辣根過氧化物酶標(biāo)記大鼠 IGg (北京中山生物技術(shù)有限公司)，37°C搖床lh，PBST洗滌3次 IOmin/次，采用化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司）反應(yīng)，X膠片顯色， 暗室，曝光。用Image master VDS成像系統(tǒng)攝影，圖像分析件（Total lab V101)行灰度掃描 分析。以目的蛋白VEGF與β -actin的蛋白產(chǎn)物條帶灰度的比值表示。 6實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測VEGFmRNA表達(dá) 取50mg標(biāo)本組織，制成勻漿，提取總RNA (凱基總RNA提取試劑盒，南京凱基生物科技 發(fā)展有限公司），用GeneQuant RNA/DNA定量儀(美國Bio-Rad公司)進(jìn)行RNA純度測定和定 量。保證A260/A280值在1. 8-2. 0之間，否則重新提取RNA。轉(zhuǎn)錄cDNA (Takana反轉(zhuǎn)錄試 劑盒，日本Takana公司），然后樣品在iCycler iQ熒光PCR儀(美國Bio-Rad公司）上進(jìn)行 擴(kuò)增。采用相對定量法，在測定目的基因 VEGF的同時測定內(nèi)源性看家基因 GAPDH，兩者比值 表示最終結(jié)果。大鼠 VEGF PCR引物：上游引物：5'-AGG AGG AGG GCA GAA TCA TCA-3';下 游引物：5'_ CTC GAT TGG ATG GCA GTA GCT-3'。GAPDH PCR 引物：上游引物：5'-GCA CCG TCA AGG CTG ACA AC-3'；下游引物：5' -ATG GTG GTG AAG ACG CCA GT-3'。以上 3 對引物 均由北京奧科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。 7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12. 0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示；不同組之間的比較采用完全 隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，不同時間之間比較采用重復(fù)測量的方差分析，組問兩兩比較 采用q檢驗(yàn)。P < 〇. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1藥物對神經(jīng)功能評分的影響 與正常組神經(jīng)功能評分相比，模型組和溶劑組在TBI后ld，評分顯著降低（P < 0. 01)， 4d后開始升高（P < 0. 05)至Hd基本恢復(fù)正常；而藥物組，在TBI后Id評分開始下降（P < 0. 05)，4d后顯著升高并一直到14d (表1 )。而藥物組和模型組比較，神經(jīng)功能評分在 TBI后Id和4d比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0. 05)。 2藥物對VEGF的影響 Westem-blot結(jié)果顯示，與正常組VEGF蛋白灰度值相比，模型組和溶劑組VEGF先升高 (P < 0.05)，7d后又下降（P > 0.05)，兩組比較無顯著性差異（P > 0.05);藥物組VEGF從 Id (P < 0. 05)開始明顯升高并維持至14d (P < 0. 01)。 實(shí)時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，各組VEGF的mRNA表達(dá)變化與VEGF蛋白的表達(dá)變化 一致。 3藥物對血管密度的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與正常組大鼠微血管密度比較，TBI后l-7d，模型組和溶劑組微 血管密度明顯降低（P > 〇. 01)，14d時基本恢復(fù)正常；TBI后l-7d，藥物組微血管密度降低 (P > 0.05)，第4d表現(xiàn)很明顯，14d時恢復(fù)正常。 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較(i=s , n=8)

【權(quán)利要求】
1. rhEGF在制備預(yù)防、治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥物或保健品中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述創(chuàng)傷性腦損傷包括：由作用于腦底或脊 柱的物理力，局部缺血，中風(fēng)，呼吸停止，心跳停止，腦血檢形成或檢塞，AIDS所致神經(jīng)障礙， 和大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術(shù)后事件，腦感染，震蕩或顱內(nèi)壓升高所引起的創(chuàng)傷性腦損 傷，和/或上述病癥的后遺癥。 3. rhEGF作為VEGF表達(dá)調(diào)節(jié)劑的用途，用于制備調(diào)節(jié)VEGF的藥物或保健品中。 4. rhEGF在制備改善腦神經(jīng)功能的藥物或保健品中的用途。 5. rhEGF在制備增加腦部微血管密度的藥物或保健品中的用途。
6. -種用于治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥物組合物，其中包括活性成分rhEGF和藥學(xué)可接受 載體。
【文檔編號】A61P25/00GK104491842SQ201510025292
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月19日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月19日
【發(fā)明者】梁青, 梁蘭, 鄒慶薇, 郝瑞雪, 聞家興, 王菁, 于琪, 顧久瑩, 田雪, 李姣, 劉建強(qiáng) 申請人:天津冠勤生物科技有限公司