一種磁靶向納米鉆石藥物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及靶向納米藥物，具體涉及一種納米鉆石表面修飾后負(fù)載磁性四氧化三鐵和化療藥物阿霉素的磁靶向納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]如今，癌癥已成為人類健康的第二大殺手，其僅次于心血管疾病。惡性腫瘤的生存率很低，其中最主要的原因是腫瘤患者發(fā)現(xiàn)病情時已是中、晚期，錯過了手術(shù)和放、化療的最佳治愈時間。除此之外，傳統(tǒng)的化療藥物缺乏藥理單一性，對正常組織細(xì)胞毒副作用很大，這也是導(dǎo)致癌癥治療效率低的主要原因。由此可見，提高腫瘤治療效果的有效途徑是早期診斷，革G向治療。
[0003]近年來大多關(guān)注都放在碳基納米材料上，如碳納米管，量子點(diǎn)等。但是，這些納米材料生物相容性差和具有低毒性，嚴(yán)重影響了其作為載藥載體。其納米鉆石因其優(yōu)異的光化學(xué)性質(zhì)、良好的生物相容性、低毒性和表面易被修飾等特點(diǎn)引起了公眾的關(guān)注。此外磁性四氧化三鐵納米顆粒也由于其對人體的低毒性即可以通過正常的鐵代謝生化途徑被細(xì)胞再利用或循環(huán)和突出的磁性即可作為磁靶向，且易于修飾特點(diǎn)，成為新型材料研究的熱點(diǎn)。
[0004]鑒于此，我們將納米鉆石作為載體，將其表面修飾后負(fù)載磁性Fe3O4納米粒子和阿霉素后，形成一種磁靶向納米鉆石藥物體系，并研究其在外加磁場作用下，在體外對腫瘤細(xì)胞活性、凋亡等的影響和在體內(nèi)的磁靶向抑制腫瘤效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種磁靶向納米鉆石藥物及其制備方法，以及該藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的一種納米鉆石表面修飾負(fù)載磁性Fe3O4納米粒子和阿霉素的復(fù)合藥物的制備方法，包括如下步驟:
[0007](I)按 n(Fe2+):n(Fe3+) = l:2 的 FeCl2.4出0 和 FeCl3.6H2O 混合溶液中，加入物質(zhì)的量為0.1-1倍的!!(Fe2+)的二水合檸檬酸鈉溶液;在劇烈攪拌下，用0.1M NaOH調(diào)節(jié)溶液pH =11，并持續(xù)攪拌30min ；然后將混合溶液在80 °C油浴中反應(yīng)2h，沉淀用去離子水洗滌到中性，然后干燥得到羧基化的磁性Fe3O4納米顆粒；
[0008](2)將干燥的羧基化的磁性Fe3O4顆粒，按每Img羧基化的磁性Fe3O4顆粒加入1-1.5mL濃度為0.1Μ、ρΗ5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每Img羧基化的磁性Fe3O4顆粒中加入8mg EDC與12mg NHS，室溫攪拌反應(yīng)6h，再加入420μ1 (lmg/ml)聚賴氨酸(PLL)溶液，劇烈攪拌反應(yīng)6h，用去離子水洗滌若干次，至上清液無色為止，干燥得到磁性Fe3O4-PLL納米顆粒；
[0009](3)稱取干燥的羧基化的納米鉆石ND，按每Img羧基化的納米鉆石加入1-1.5mL濃度為0.1Μ、ρΗ5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每Img羧基化的納米鉆石中加入0.2mg EDC與0.3mg NHS，室溫攪拌反應(yīng)6h，然后以15000rpm離心5min，棄去上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物；
[0010](4)稱取干燥的磁性Fe3O4-PLL納米顆粒，按每Img磁性Fe3O4-PLL納米顆粒，加入1-1.5mL的roS(pH 7.4)溶液，超聲分散，接著按Fe3O4-PLL與ND質(zhì)量比為1:1-9加入活化好的ND，劇烈攪拌反應(yīng)6h;用去離子水洗滌3次，干燥，得到磁性Fe3O4-PLL-ND納米顆粒；
[0011 ] (5)稱取干燥的磁性Fe3O4-PLL-ND納米顆粒，按每Img磁性Fe3O4-PLL-ND納米顆粒加入l-1.5mL BBS (pH 8.0)溶液，超聲分散，接著按每Img磁性Fe3OfPLL-ND加入10yg D0X,室溫?fù)u勻反應(yīng)3h，然后以15000rpm離心5min，用BBS洗至上清液無色，得到磁靶向納米鉆石藥物 Fe3O4-PLL-ND-DOX。
[0012]所述步驟(1)中恥3(^.2出0的加入量為11收2+)的0.1倍。
[0013]所述步驟⑷中Fe3O4-PLL與ND質(zhì)量比為1:1。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明制得的納米復(fù)合藥物體系集磁性與熒光于一體，既具有磁靶向性，在體內(nèi)外又易于檢測。在體外，通過與人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)作用，表明磁性納米鉆石載體Fe3O4-PLL-ND具有生物相容性;在外加磁場作用下，將Fe3O4-PLL-ND-DOX經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗表明，其藥效強(qiáng)于單獨(dú)阿霉素D0X;在體內(nèi)，通過活體成像儀檢測，F(xiàn)e3O4-PLL-ND-DOX藥物具有磁靶向性。
【附圖說明】
[0015]圖1用X射線衍射儀測得磁靶向納米鉆石藥物載體的XRD圖
[0016]AiFe3O4 B:Fe3OrPLL CiFe3O4-PLL-ND D:ND
[0017]圖2用磁共振強(qiáng)度計測得磁靶向納米鉆石藥物載體的VSM圖
[0018]AiFe3O4 B:Fe3OrPLL CiFe3O4-PLL-ND D:ND
[0019]圖3不同pH環(huán)境下Fe3O4-PLL-ND-DOX的體外釋藥曲線
[0020]圖4 Fe3O4-PLL-ND-DOX與對照作用于細(xì)胞48h的細(xì)胞形態(tài)圖
[0021]A:空白對照組 B:Fe3O4-PLL-ND 組C:DOX組 D:Fe3OfPLL-ND-DOX組E:Fe3OfPLL-ND-DOX+Magnet組
[0022]圖5各實(shí)驗組不同處理時間對細(xì)胞凋亡影響的柱狀圖
[0023]圖6 Fe3O4-PLL-ND-DOX體內(nèi)實(shí)驗圖及注射藥Oh、3h、7h、24h活體成像圖
[0024]圖7Fe3O4-PLL-ND-DOX對小鼠各器官及腫瘤的熒光強(qiáng)度對比圖
[0025]圖8Fe3O4-PLL-ND-DOX對小鼠各器官及腫瘤的平均熒光強(qiáng)度柱形圖
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下為實(shí)施例中使用的材料
[0027]FeCb.4H20(Mw= 198.71 ,Aladdin Chemistry C0.Ltd)
[0028]FeCb.6H20(Mw = 270.29,Aladdin Chemistry C0.Ltd)
[0029]納米鉆石(ND，元素六，直徑大約140nm, Ireland)
[0030]阿霉素(DOX，分子量543.52，山西普德藥業(yè)有限公司)
[0031]實(shí)施例1:
[0032](I)磁性Fe304納米顆粒的制備
[0033]準(zhǔn)確稱取0.1987gFeCl2.4H20和0.5406g FeCl3.6H2O，溶于10ml去離子水中，加入1.0ml0.1M的檸檬酸鈉溶液混合均勻，劇烈攪拌下用0.1M NaOH調(diào)節(jié)溶液，使其pH= 11，并持續(xù)攪拌30min，然后將混合溶液在80°C油浴中反應(yīng)2h，得到沉淀，抽濾后，用去離子水洗滌5
次后，真空干燥備用。
[0034](2)磁性Fe3OfPLL納米顆粒的制備
[0035]準(zhǔn)確稱取磁性3mg Fe3O4溶于3ml MES(0.1Μ)ρΗ5.8緩沖溶液中，超聲分散；稱1mgNHS，9mg EDC加入上述溶液中，超聲分散30min，加入420ul (lyg/μ? )PLL，搖勻反應(yīng)6h，用去離子水洗滌3次，真空干燥備用。
[0036](3)磁性Fe3OfPLL-ND納米顆粒的制備
[0037]準(zhǔn)確稱取4mg表面羧基化的ND，用0.7668mg EDC和1.1509mg NHS活化30min;準(zhǔn)確稱取4mg磁性Fe3O4-PLL納米顆粒，加入到4ml PBS(pH7.4)緩沖溶液中，超聲分散。然后將活化好的ND離心后加入到含分散好的磁性Fe3O4-PLL的PBS溶液中，反應(yīng)過夜。用去離子水洗滌3次，真空干燥備用。
[0038](4)磁靶向納米鉆石藥物體系Fe3O4-PLL-ND-DOX的制備
[0039]準(zhǔn)確稱取Img Fe3OfPLL-ND納米顆粒，加入Iml BBS (pH 8.0)的緩沖溶液，超聲分散，然后加入50ml 2ygAU的DOX溶液，然后搖勻儀避光反應(yīng)3h。離心，BBS(pH8.0)洗，直至上清液為無色，收集沉淀物，真空干燥即可。
[0040]實(shí)施例2:
[0041 ] ⑴磁性Fe304納米顆粒的制備
[0042]準(zhǔn)確稱取0.1987gFeCl2.4H20和0.5406g FeCl3.6H2O，溶于10ml去離子水中，加入5.0ml0.1M的檸檬酸鈉溶液混合均勻，劇烈攪拌下用0.1M NaOH調(diào)節(jié)溶液，使其pH= 11，并持續(xù)攪拌30min，然后將混合溶液在80°C油浴中反應(yīng)2h，得到沉淀，抽濾后，用去離子水洗滌5次后，真空干燥備用。
[0043](2)-(4)的步驟，同實(shí)施案例I。
[0044]實(shí)施例3
[0045](I)磁性Fe3O4納米顆粒的制備
[0046]準(zhǔn)確稱取0.1987gFeCl2.4H20和0.5406g FeCl3.6H2O，溶于10ml去離子水中，加入
10.0ml0.1M的檸檬酸鈉溶液混合均勻，劇烈攪拌下用0.1M NaOH調(diào)節(jié)溶液，使其pH= 11，并持續(xù)攪拌30min，然后將混合溶液在80 V油浴中反應(yīng)2h，得到沉淀，抽濾后，用去離子水洗滌5次后，真空干燥備用。
[0047](2)-(4)的步驟，同實(shí)施案例I。
[0048]實(shí)施例4
[0049]細(xì)胞形態(tài)法檢測磁性納米材料的細(xì)胞毒性
[0050]為了觀察納米載體Fe3O4-PLL-ND和納米藥物Fe3O4-PLL-ND-DOX未加磁場Fe3O4-PLL-ND-DOX+Magnet(加磁場)對HeLa細(xì)胞的影響，本實(shí)驗采用倒置顯微鏡對不同處理組的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，并拍照記錄。在五個35mm培養(yǎng)皿中接種生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，密度為
1.5 X 15/盤，待細(xì)胞完全貼壁后，依次向培養(yǎng)皿中加入Fe3O4-PLL-ND、Fe304-PLL-ND-D0X、Fe304-PLL-ND-D0X+Magnet 和 DOX，使藥物 DOX 的終濃度為 5yg/mL，取 Fe3O4-PLL-ND 的量與含相應(yīng)DOX的Fe3O4-PLL-ND-DOX的量一致，以未做任何處理的細(xì)胞作為對照。培養(yǎng)48h后，棄除舊培養(yǎng)液后用PBS清洗兩次，最后懸于Iml PBS緩沖溶液中，觀察各組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化，拍照記錄。
[0051 ]圖4A為正常細(xì)胞，可以看出未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞大小均一、狀態(tài)飽滿透亮、排列緊密，生長狀態(tài)良好；圖4B為納米載體，其HeLa細(xì)胞與A相比，基本無明顯差異，由此可看出納米載體對細(xì)胞無毒副作用。與此相比，藥物處理組C，D，E三組的細(xì)胞生長明顯受到影響，其中單獨(dú)DOX處理后的細(xì)胞輪廓模糊、數(shù)量大幅減少，這與DOX可直接作用于DNA，插入DNA的雙螺旋鏈，使其解開，改變DNA的模板性質(zhì)，抑制DNA聚合酶，從而既可以抑ffjijDNA，又可以抑制RNA的合成的藥理作用一致；
[0052]實(shí)施例5
[0053]納米藥物Fe3O4-PLL-ND-DOX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)驗
[0054]為了研究有無外加磁場作用下，F(xiàn)e3O4-PLL-ND-DOX對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)情況，本文設(shè)計了三個不同培養(yǎng)時間對其誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行定量檢測。同樣，將對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞以2.0 XlOVdish的密度接種于35mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后分別用D0X、Fe304_PLL-ND、Fe304-PLL-M)-D0X、Fe304-PLL-ND-D0X+Magnet 進(jìn)行處理(各組藥物劑量同3.2.6.1),平行設(shè)置三組，分別培養(yǎng)24h、36h、48h后，棄去舊液，PBS洗滌3次，用無EDTA的胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞解離后收集于新鮮培養(yǎng)液中，上機(jī)前用PBS洗滌，然后加入含Ca2+的緩沖溶液(Binding buffer)，再向其中加入新鮮配制的雙染料(PI+Annexin-V)染色20min，上機(jī)測試。
[0055]圖5表示不同處理時間的各實(shí)驗組細(xì)胞凋亡的情況，均以未做任何處理的HeLa細(xì)胞作為對照。由圖可發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，納米載體Fe3O4-PLL-ND處理組的細(xì)胞凋亡與對照組相差不大，說明材料具有良好的生物相容性；而納米藥物Fe3O4-PLL-ND-DOX和Fe3O4-PLL-ND-DOX+Magnet和游離DOX與細(xì)胞作用均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，SAMtFe3OfPLL-ND-DOX+Magnet組對細(xì)胞的殺傷力已經(jīng)超過游離DOX的效果，這一現(xiàn)象表明我們所制備的磁靶向納米鉆石藥物在24h內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的抑制作用很強(qiáng)，時間延長后，與單獨(dú)DOX效果差不多，無明顯的優(yōu)越性。
[0056]實(shí)施例6
[0057]磁靶向納米鉆石藥物體內(nèi)靶向效應(yīng)
[0058]所有的動物實(shí)驗，按照中國輻射防護(hù)研究院藥物安全評價中心(生產(chǎn)許可證號:SYXK(晉)2013-0002)的協(xié)議進(jìn)行的。取8_9周齡雄性裸鼠，體重約20克，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗室提供(北京)。
[0059](I)裸鼠移植性人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞的接種
[0060](a)接種量:細(xì)胞懸液調(diào)整為1.0XlOVmL人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞，接種量為0.1mL/鼠，接種于右腋部皮下(每只動物的接種量為1.0X 15)
[0061 ] (b)給藥方法及劑量:接種后1天通過腹腔注射給藥，取實(shí)施例1制得的Fe3O4-PLL-ND-DOX給予小鼠注射2mg含150yg DOX。此后，將永磁鐵置于小鼠腫瘤部位，Oh、3h、7h、24h，進(jìn)行活體成像(圖6)，直到24h后，對小鼠進(jìn)行安樂死。然后進(jìn)行解剖，取腎、脾、心臟、肝、肺和腫瘤，觀察腫瘤及各器官的熒光差異(圖7)，由圖7可見小鼠的腎、心和脾并無熒光，而肝、肺和腫瘤均發(fā)熒光，從圖8各器官和腫瘤的平均熒光強(qiáng)度可知，腎、心和脾平均熒光強(qiáng)度值為0，而肝、肺和腫瘤平均熒光強(qiáng)度值分別為16、85、408，可見腫瘤熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于肝和脾，說明我們的藥物體系在外加磁場作用下具有靶向性，這與前期凋亡實(shí)驗的結(jié)果也相吻入口 O
【主權(quán)項】
1.一種磁靶向納米鉆石藥物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)按n(Fe2+):n(Fe3+)= l:2的FeCl2.4H20和FeCl3.6H20混合溶液中，加入物質(zhì)的量為0.1-1倍的!!(Fe2+)的二水合檸檬酸鈉溶液;在劇烈攪拌下，用0.1M NaOH調(diào)節(jié)溶液pH= 11，并持續(xù)攪拌30min ；然后將混合溶液在80 °C油浴中反應(yīng)2h，沉淀用去離子水洗滌到中性，然后干燥得到羧基化的磁性Fe304納米顆粒； (2)將干燥的羧基化的磁性Fe3O4顆粒，按每Img羧基化的磁性Fe3O4顆粒加入I_1.5mL濃度為0.1Μ、ρΗ5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每Img羧基化的磁性Fe3O4顆粒中加入8mg EDC與12mg NHS，室溫攪拌反應(yīng)6h，再加入420μ1濃度為lmg/ml的聚賴氨酸溶液，劇烈攪拌反應(yīng)6h，用去離子水洗滌若干次，至上清液無色為止，干燥得到磁性Fe304_PLL納米顆粒； (3)稱取干燥的羧基化的納米鉆石ND，按每Img羧基化的納米鉆石加入1-1.5mL濃度為0.1Μ、ρΗ5.8的MES緩沖溶液中，超聲分散30min形成懸濁液，再按每Img羧基化的納米鉆石中加入0.2mg EDC與0.3mg NHS，室溫攪拌反應(yīng)6h，然后以15000rpm離心5min，棄去上清液，得到活化羧基的納米鉆石沉淀物； ⑷稱取干燥的磁性Fe304_PLL納米顆粒，按每Img磁性Fe304_PLL納米顆粒，加入1-1.5mL的pH 7.4的PBS溶液，超聲分散，接著按Fe3O4-PLL與ND質(zhì)量比為1:卜9加入活化好的ND，劇烈攪拌反應(yīng)6h;用去離子水洗滌3次，干燥，得到磁性Fe3O4-PLL-ND納米顆粒； (5)稱取干燥的磁性Fe3O4-PLL-ND納米顆粒，按每Img磁性Fe3O4-PLL-ND納米顆粒加入1-1.5mL的pH 8.0的BBS溶液，超聲分散，接著按每Img磁性Fe3O4-PLL-ND加入10yg DOX，室溫?fù)u勾反應(yīng)3h，然后以15000rpm離心5min，用BBS洗至上清液無色，得到磁革El向納米鉆石藥物Fe3OfPLL-ND-DOX。2.如權(quán)利要求1所述的一種磁性納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中恥3以12出0的加入量為11(卩62+)的0.1倍。3.如權(quán)利要求1所述的一種磁性納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中Fe3O4-PLL與ND質(zhì)量比為1:1。4.如權(quán)利要求1、2或3所述方法制備的磁靶向納米鉆石藥物。5.如權(quán)利要求4所述的磁靶向納米鉆石藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種磁靶向納米鉆石藥物及其制備方法和應(yīng)用。即將羧基化的磁性Fe3O4和納米鉆石(ND)在偶聯(lián)劑聚賴氨酸(PLL)的作用下，形成磁納米鉆石復(fù)合材料(Fe3O4?PLL?ND)；然后物理吸附抗癌藥物阿霉素(DOX)，得到磁靶向納米鉆石藥物(Fe3O4?PLL?ND?DOX)；在外加磁場作用下，將該磁靶向藥物與人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞作用，表明其能靶向抑制腫瘤增長，以荷瘤小鼠為模型，研究其在體內(nèi)的磁靶向效應(yīng)，表明其能靶向定位到腫瘤部位。該磁靶向納米鉆石藥物可在制備磁靶向抗腫瘤藥物中應(yīng)用。
【IPC分類】A61K31/704, A61P35/00, A61K47/04, A61K47/34, A61K41/00
【公開號】CN105709233
【申請?zhí)枴緾N201610067837
【發(fā)明人】李英奇, 趙文靜, 王志琴
【申請人】山西大學(xué)