本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種丁香乙醇提取物，還涉及所述丁香乙醇提取物的用途。

背景技術(shù)：

肥胖疾病近幾年倍受關(guān)注。現(xiàn)已報道肥胖癥與糖尿病、冠心病、高血壓以及代謝綜合癥密切相關(guān)。人體合成脂肪酸在與甘油單酯結(jié)合后生成脂肪，過量脂肪堆積最終會導(dǎo)致肥胖。在肥胖組織與脂肪細(xì)胞中脂肪酸合成酶表達(dá)量明顯高于正常組織細(xì)胞。現(xiàn)有研究表明，脂肪酸合成酶與肥胖等疾病有著密不可分的聯(lián)系，抑制脂肪酸合成對于治療肥胖及其相關(guān)疾病具有深遠(yuǎn)的意義。

迄今為止，已批準(zhǔn)上市并用于臨床治療肥胖的藥物僅有三種，5-羥色胺去甲腎上腺素重攝取抑制劑(西布曲明)、選擇I型大麻受體拮抗劑(利莫那班)和胰脂肪酶抑制劑(奧利司他)。這些藥物對肥胖癥有一定療效，但也有一些副作用。因此，人們在研制副作用小、安全性高，更符合肥胖患者需求的脂肪酸合成酶抑制劑時，越來越多地把研究方向集中于天然產(chǎn)物。

腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。近年來惡性腫瘤治療雖然取得長足進(jìn)步，但目前現(xiàn)有藥物尚不能滿足臨床需要，惡性腫瘤仍被人們視為難治疾病。人們知道，在如前列腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞中，脂肪酸合酶表達(dá)量要明顯高于正常細(xì)胞，目前已有一些化合物作為脂肪酸合成酶抑制劑用于治療腫瘤，但存在毒副作用明顯等缺陷。因此，尋找天然食品級來源脂肪酸合成酶抑制劑對于治療腫瘤有深遠(yuǎn)的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

[要解決的技術(shù)問題]

本發(fā)明的目的是提供一種丁香乙醇提取物。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述丁香乙醇提取物的用途。

[技術(shù)方案]

本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。

本發(fā)明涉及一種丁香乙醇提取物。

所述丁香乙醇提取物是由下述制備方法制備得到的：

按照以克計丁香粉與以毫升計乙醇水溶液的比1：15～25，讓干燥丁香粉與濃度為以體積計70～85％乙醇水溶液混合均勻，然后在溫度35～39℃與轉(zhuǎn)速150～250rpm的條件下震蕩提取10～15小時，過濾分離，得到的殘渣再以同樣方式重復(fù)提取2～4次，提余殘渣棄去，濾液合并；合并的濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在壓力400～600毫米汞柱與旋轉(zhuǎn)速度50～160轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到所述的丁香乙醇提取物。

本發(fā)明還涉及所述的丁香乙醇提取物在制備治療肥胖及抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物組合物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的藥物組合物由丁香乙醇提取物與在藥學(xué)上可接受的載體組成。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、潤濕劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑或矯味劑的載體。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的填充劑選自淀粉、糖類、纖維素類或無機(jī)鹽類；所述的潤濕劑選自水、乙醇、淀粉或糖漿；所述的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉；所述的粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮；所述的潤滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇；所述的矯味劑選自甜味劑、芳香劑、膠漿劑或泡騰劑。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的糖類填充劑選自淀粉、蔗糖或乳糖；所述的纖維素類填充劑選自微晶纖維素；所述無機(jī)鹽類填充劑選自硫酸鈣。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的甜味劑選自單糖漿、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖漿或櫻桃糖漿；所述的芳香劑選自檸檬、茴香、薄荷油；所述的膠漿劑選自海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；所述的泡騰劑是酒石酸與碳酸氫鈉混合物。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的藥物組合物是顆粒、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液劑型。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的肥胖是高脂營養(yǎng)性肥胖。

根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的腫瘤細(xì)胞是人前列腺癌細(xì)胞LNCaP與人肝癌細(xì)胞HepG2。

下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

本發(fā)明涉及一種丁香乙醇提取物。

所述丁香乙醇提取物是由下述制備方法制備得到的：

按照以克計丁香粉與以毫升計乙醇水溶液的比1：15～25，讓干燥丁香粉與濃度為以體積計70～85％乙醇水溶液混合均勻，然后在溫度35～39℃與轉(zhuǎn)速150～250rpm的條件下震蕩提取10～15小時，過濾分離，得到的殘渣再以同樣方式重復(fù)提取2～4次，提余殘渣棄去，濾液合并；合并的濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在壓力400～600毫米汞柱與旋轉(zhuǎn)速度50～160轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到所述的丁香乙醇提取物。

在本發(fā)明中，丁香粉粒度通常是100～150目。干燥丁香粉的水含量是以重量計5％以下。

本發(fā)明還涉及所述丁香乙醇提取物在制備治療肥胖及抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物組合物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明，所述的藥物組合物由丁香乙醇提取物與在藥學(xué)上可接受的載體組成。

在本發(fā)明中，在藥學(xué)上可接受的載體是一種或多種選自在藥學(xué)上通常使用的填充劑、潤濕劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑或矯味劑的載體。

根據(jù)本發(fā)明，所述的填充劑應(yīng)該理解是一種用來增加藥物與載體重量和體積以利用它們壓制成片劑的稀釋劑；或者應(yīng)該理解是用以吸收藥物與載體中多余液體成分的輔料吸收劑。凡是具有這種性能而又不會影響本發(fā)明丁香乙醇提取物效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。

具體地，本發(fā)明使用的填充劑選自淀粉、糖類、纖維素類與無機(jī)鹽類。所述的淀粉例如是玉米、小麥、大米淀粉、改性淀粉、復(fù)合淀粉。所述的糖類填充劑選自淀粉、蔗糖或乳糖；所述的纖維素類填充劑選自微晶纖維素；所述無機(jī)鹽類填充劑選自硫酸鈣。本發(fā)明使用的填充劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明，所述的潤濕劑應(yīng)該理解是一種在藥物本身無粘性時能夠使其藥物潤濕并誘發(fā)其具有粘性，是能夠制成顆粒的液體。凡是具有這種性能而又不會影響本發(fā)明丁香乙醇提取物效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，同時也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的潤濕劑選自水、乙醇、淀粉或糖漿。所述的糖漿例如是葡萄糖漿、麥芽糖漿或低聚糖漿。本發(fā)明使用的潤濕劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明，所述的崩解劑應(yīng)該理解是一種能夠促進(jìn)片劑在胃腸液中快速崩解成細(xì)小粒子的輔料。凡是具有所述這種性能而又不會影響本發(fā)明丁香乙醇提取物效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的崩解劑選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉，優(yōu)選地選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、瓊脂或碳酸氫鈉，更優(yōu)選地選自羧甲基淀粉鈉、羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素或碳酸氫鈉。本發(fā)明使用的崩解劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由鄭州長樂食品科技有限公司以商品名Primojel銷售的羧甲基淀粉鈉、由山東通升食品配料有限公司以商品名羥丙纖維素(HPMC)銷售的羥丙纖維素、由上海厚誠精細(xì)化工有限公司以商品名交聯(lián)CMC銷售的交聯(lián)羧甲基纖維素。

根據(jù)本發(fā)明，所述的粘合劑應(yīng)該理解是當(dāng)藥物本身無粘性或粘性不足時需要加入一種粘性物質(zhì)以便將其藥物制成顆粒劑，這種粘性物質(zhì)稱之粘合劑。凡是具有所述這種性能而又不會影響本發(fā)明丁香乙醇提取物性質(zhì)的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的粘合劑選自纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮，優(yōu)選地選自纖維素衍生物、明膠或聚乙烯吡咯烷酮，更優(yōu)選地選自明膠或聚乙烯吡咯烷酮。本發(fā)明使用的粘合劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由瀘州同益科技化工有限公司以商品名藥用輔料乙基纖維素(EC)銷售的纖維素衍生物、由西安悅來醫(yī)藥科技有限公司以商品名海藻酸鈉銷售的藻酸鹽、由上海勤聯(lián)化工有限公司以商品名明膠銷售的明膠或由濟(jì)南源茂化工有限公司以商品名聚乙烯吡咯烷酮(PVP)銷售的聚乙烯吡咯烷酮。

根據(jù)本發(fā)明，所述的潤滑劑應(yīng)該理解是一種在制粒過程中能夠提高片劑流動性，防止片劑粘附在制片機(jī)上，有利于片劑脫模的物質(zhì)。凡是具有所述這種性能而又不會影響本發(fā)明丁香乙醇提取物效果的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。具體地，本發(fā)明使用的潤滑劑選自滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇，優(yōu)選地是滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇，更優(yōu)選地是滑石粉或硬脂酸鈣。本發(fā)明使用的潤滑劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由新鄭市龍湖鎮(zhèn)富源化工公司銷售的硬脂酸鈣、由新鄭市龍湖鎮(zhèn)富源化工公司銷售的硬脂酸鎂、由蘇州捷易龍貿(mào)易有限公司銷售的微粉硅膠。

根據(jù)本發(fā)明，所述的矯味劑應(yīng)該理解是一種在藥品中用以改善或屏蔽藥物不良?xì)馕逗臀兜?例如強(qiáng)烈苦味或其他異味等)的輔料。凡是具有這種性能而又不會影響本發(fā)明丁香乙醇提取物的物質(zhì)都可以用于本發(fā)明，也都在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。

所述的矯味劑選自甜味劑、芳香劑、膠漿劑或泡騰劑。

具體地，本發(fā)明使用的甜味劑選自單糖漿、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖漿或櫻桃糖漿，優(yōu)選地選自單糖漿、蔗糖、橙皮糖漿或櫻桃糖漿；

所述的芳香劑選自檸檬、茴香或薄荷油，優(yōu)選地檸檬芳香劑；

所述的膠漿劑選自海藻酸鈉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，優(yōu)選地海藻酸鈉、阿拉伯膠膠漿劑；所述的泡騰劑是酒石酸與碳酸氫鈉混合物(重量比1:1～3)。

本發(fā)明使用的潤滑劑都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由濟(jì)南鑫碩化工有限公司銷售的橙皮糖漿、由山東通升食品配料有限公司銷售的羧甲基纖維素鈉。

在本發(fā)明中，填充劑、潤濕劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑或矯味劑的用量應(yīng)該根據(jù)實際需要進(jìn)行確定，這對于制藥技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是不存在任何技術(shù)困難的。

本發(fā)明的丁香乙醇提取物可以與在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合制成各種劑型，例如顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。可以根據(jù)不同劑型選擇在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，這些載體或賦形劑及其用量對于制藥技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員都是容易確定的，也是顯而易見的。

所述的劑型一般應(yīng)該理解是適用于人的單劑量藥物形式，單個劑型含有為達(dá)到所需藥物量的預(yù)定性物質(zhì)，例如本發(fā)明的丁香乙醇提取物。

在本發(fā)明中，所述的肥胖是高脂營養(yǎng)性肥胖。所述的腫瘤細(xì)胞是人前列腺癌細(xì)胞LNCaP與人肝癌細(xì)胞HepG2。

[有益效果]

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明丁香提取物能夠抑制小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，減輕高脂營養(yǎng)性肥胖C57BL/6小鼠的體重、肝臟和脂肪組織重量，降低血清中甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇含量。本發(fā)明丁香提取物能夠抑制人前列腺癌細(xì)胞LNCaP細(xì)胞與人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞增殖，阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)行。本發(fā)明丁香乙醇提取物作為脂肪酸合成抑制劑用于治療肥胖及腫瘤及其相關(guān)的疾病具有非常良好的應(yīng)用前景。

【附圖說明】

圖1是脂肪酸合成抑制劑初步篩選結(jié)果圖；

圖2表示丁香乙醇提取物在OP9分化為脂肪細(xì)胞過程中對脂肪酸合成酶表達(dá)的影響。其中，RSC是添加羅格列酮誘導(dǎo)分化組，RSC+CE是丁香乙醇提取物干擾羅格列酮誘導(dǎo)分化處理組，并設(shè)置Control組作為空白對照組。

圖3表示在丁香乙醇提取物作用下，OP9細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的油紅染色圖片。

圖4表示丁香乙醇提取物對OP9細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞作用下的油紅染色OD值的影響。

圖5表示普通飼料組(ND)、高脂飼料組(HFD)以及高脂飼料加丁香乙醇提取物組(HFD+CE)小鼠的體重變化：其中A表示飼養(yǎng)期間小鼠體重增加趨勢；圖B表示小鼠體重增加值。

圖6表示飼養(yǎng)過程中普通飼料組(ND)、高脂飼料組(HFD)以及高脂飼料加丁香乙醇提取物組(HFD+CE)小鼠飲食量的變化。

圖7表示丁香乙醇提取物對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟部位脂肪酸合成酶表達(dá)的影響。

圖8表示在丁香乙醇提取物處理下，高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肝臟組織的H&E染色結(jié)果。

圖9表示在丁香乙醇提取物處理下，高脂飲食誘導(dǎo)小鼠附睪脂肪組織的H&E染色結(jié)果。

圖10表示丁香乙醇提取物對高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血清中甘油三酯含量的影響。

圖11表示丁香乙醇提取物對高脂飲食誘導(dǎo)小鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇含量的影響。

圖12表示丁香乙醇提取物對高脂飲食誘導(dǎo)小鼠空腹血糖的影響。

圖13表示丁香乙醇提取物對LNCaP細(xì)胞脂肪酸合成酶表達(dá)的影響。

圖14表示丁香乙醇提取物對HepG2細(xì)胞脂肪酸合成酶表達(dá)的影響。

圖15表示丁香乙醇提取物對LNCaP細(xì)胞增值的影響結(jié)果。

圖16表示丁香乙醇提取物對HepG2細(xì)胞增殖的影響結(jié)果。

圖17表示丁香乙醇提取物與棕櫚酸共同作用對LNCaP細(xì)胞增殖的影響結(jié)果。

圖18表示丁香乙醇提取物與棕櫚酸共同作用對HepG2細(xì)胞增殖的影響結(jié)果。

圖19表示丁香乙醇提取物對LNCaP細(xì)胞周期的影響結(jié)果。

圖20表示丁香乙醇提取物對HepG2細(xì)胞周期的影響結(jié)果。

其中ns：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001；ND為普通飼料組、HFD為高脂飼料組、HFD+CE(1％g/g丁香乙醇提取物)為高脂飼料加丁香乙醇提取物組。

【具體實施方式】

通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。

實施例1：制備丁香乙醇提取物

該實施例的實施步驟如下：

按照以克計丁香粉與以毫升計乙醇水溶液的比1：15，讓干燥丁香粉與濃度為以體積計70％乙醇水溶液混合均勻，然后在溫度35℃與轉(zhuǎn)速200rpm的條件下震蕩提取12小時，過濾分離，得到的殘渣再以同樣方式重復(fù)提取2次，提余殘渣棄去，濾液合并；合并的濾液在由上海越眾儀器有限公司以商品型號為RE-52銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在壓力400毫米汞柱與旋轉(zhuǎn)速度50轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到所述的丁香乙醇提取物。

實施例2：制備丁香乙醇提取物

該實施例的實施步驟如下：

按照以克計丁香粉與以毫升計乙醇水溶液的比1：10，讓干燥丁香粉與濃度為以體積計75％乙醇水溶液混合均勻，然后在溫度39℃與轉(zhuǎn)速150rpm的條件下震蕩提取10小時，過濾分離，得到的殘渣再以同樣方式重復(fù)提取4次，提余殘渣棄去，濾液合并；合并的濾液在由上海越眾儀器有限公司以商品型號為RE-52銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在壓力600毫米汞柱與旋轉(zhuǎn)速度100轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到所述的丁香乙醇提取物。

實施例3：制備丁香乙醇提取物

該實施例的實施步驟如下：

按照以克計丁香粉與以毫升計乙醇水溶液的比1：25，讓干燥丁香粉與濃度為以體積計85％乙醇水溶液混合均勻，然后在溫度37℃與轉(zhuǎn)速250rpm的條件下震蕩提取15小時，過濾分離，得到的殘渣再以同樣方式重復(fù)提取3次，提余殘渣棄去，濾液合并；合并的濾液在由上海越眾儀器有限公司以商品型號為RE-52銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在壓力500毫米汞柱與旋轉(zhuǎn)速度160轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到所述的丁香乙醇提取物。

試驗實施例1：脂肪酸合成抑制劑的初步篩選

A、樣品處理：將高山被孢霉(株名ATCC32222)(MA)打碎，用Broth液體培養(yǎng)基(葡萄糖，20g/L；蛋白胨酵母提取物，50g/L；KH₂PO₄，1g/L；MgSO₄，0.25g/L；KNO₃，10g/L)稀釋至0.5OD(在波長600nm處)值濃度，加入96孔板，每孔100μL。

B、處理設(shè)置：空白組(MA)，對照組(MA+2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)；MA+TTC+Cerulenin)，其余孔加入200mg/L水提、醇提、乙酸乙酯丁香提取物及0.05％TTC，每種丁香提取物設(shè)置四個復(fù)孔。三種提取物的提取方法如下：按照以克計丁香粉與以毫升計乙醇(或者水、乙酸乙酯)水溶液的比1：10，讓干燥丁香粉分別與濃度為以體積計75％乙醇水溶液、純水或乙酸乙酯溶液混合均勻，然后在溫度37℃與轉(zhuǎn)速150rpm的條件下震蕩提取10小時，過濾分離，得到的殘渣再以同樣方式重復(fù)提取4次，提余殘渣棄去，濾液合并；合并的濾液在由上海越眾儀器有限公司以商品型號為RE-52銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在壓力600毫米汞柱與旋轉(zhuǎn)速度100轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，分別得到所述的丁香乙醇提取物，丁香水提物，丁香乙酸乙酯提取物。

C、實驗方法：將種有高山被孢霉，并且分別添加丁香75％乙醇提取物，丁香水提物，丁香乙酸乙酯提取物以及濃度為0.05％TTC的微型板放于暗箱，在溫度28℃下培育72小時后，觀察各個孔中紅色變化情況。

D、試驗結(jié)果：

本試驗實施例的試驗結(jié)果見附圖1。附圖1結(jié)果表明，本發(fā)明丁香乙醇提取物處理的孔中紅色變淺，說明丁香乙醇提取物具有潛在的抑制脂肪酸合成的功能，而丁香乙酸乙酯提取物及丁香水提物并沒有顯示明顯效果。

試驗實施例2：丁香乙醇提取物作為脂肪酸合成酶抑制劑對OP9細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的抑制實驗。

A、實驗材料

1、細(xì)胞株

本實驗室凍存的小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9。

2、受試藥物

細(xì)胞培養(yǎng)基MEM-α為Thermo公司產(chǎn)品。油紅Oil為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。羅格列酮(Rosiglitazone)為Sigma公司產(chǎn)品。

實施例1制備的丁香乙醇提取物用二甲亞砜(DMSO)助溶，用MEM-α培養(yǎng)基稀釋成所需要的濃度。

B、實驗方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞OP9用含20％胎牛血清及1％雙抗(青霉素和鏈霉素)的MEM-α培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。每48小時用0.25％胰酶消化，按照母代與子代1:2傳代。

2、細(xì)胞WesternBlot實驗：

用0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心后計數(shù)，以合適濃度種于12孔板，在溫度37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，以未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞作為空白對照組，陰性對照組加入1μM羅格列酮誘導(dǎo)分化，處理組加入1μM羅格列酮與100mg/L本發(fā)明丁香乙醇提取物，繼續(xù)培養(yǎng)4天，收細(xì)胞于加有蛋白酶抑制劑的Ripa裂解液中，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，離心，去上清，測定濃度后加入loadingbuffer，用漩渦振蕩器混勻，沸水煮10分鐘后用于WesternBlot實驗。配制濃度為以重量計8％的丙烯酰胺分離膠與5％的濃縮膠，點入蛋白樣品。電泳條件為：恒壓80V，待maker跑到分離膠之后將電壓調(diào)至恒壓120V。當(dāng)溴酚藍(lán)跑到蛋白膠底部時，關(guān)閉電源。在冰水浴中，用PVDF轉(zhuǎn)膜，300mA，3小時。用5％的脫脂奶粉封閉一小時。用TBST洗膜后，將膜放入配置好的脂肪酸合成酶(FSAN)一抗中，4℃孵育18小時后，洗膜，室溫孵育兔二抗兩小時，洗膜后用顯影液顯影，用蛋白成像系統(tǒng)曝光拍照，曝光后拍照。

3、細(xì)胞油紅染色：

用0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心后計數(shù)，以合適濃度種于12孔板，在溫度37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，以未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞作為空白對照組，陰性對照組組加入1μM羅格列酮誘導(dǎo)分化，處理組加入1μM羅格列酮與100mg/L本發(fā)明丁香乙醇提取物，繼續(xù)培養(yǎng)4天，用10％甲醛固定細(xì)胞，油紅染色后顯微鏡拍照，異丙醇溶解后用酶標(biāo)儀測定熒光波長510nm處的OD值。

C、試驗結(jié)果

具體試驗結(jié)果見附圖2與附圖3。由附圖2與附圖3知道，本發(fā)明丁香乙醇提取物處理的誘導(dǎo)分化的OP9細(xì)胞中的脂肪酸合成酶表達(dá)量降低，說明丁香乙醇提取物在一定程度上抑制脂肪酸合成酶表達(dá)。由油紅染色結(jié)果可得，丁香乙醇提取物處理的誘導(dǎo)分化的OP9細(xì)胞紅色變少，OD值變低，說明油滴減少。表明丁香乙醇提取物在一定程度上抑制了OP9細(xì)胞的分化。

試驗實施例3：丁香乙醇提取物的C57BL/6小鼠試驗

A、試驗材料

C57BL/6小鼠購自于蘇州普思生物科技有限公司。高脂飼料購于北京華阜康公司，其中高脂飼料45％的能量來源于脂肪。

正常對照組飼料購自于蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司，其中10％的能量來源于脂肪。

B、試驗方法

所有小鼠在恒溫恒濕環(huán)境下飼養(yǎng)，提供12小時光照12小時黑暗環(huán)境，自由飲水飲食。每組10只小鼠，分為普通飼料組(NC)，高脂飼料組(HFD)，高脂飼料與丁香乙醇提取物(1％w/w)組(HFD+CE)。試驗每三天測定1次小鼠重量，1次小鼠攝食量，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，見圖5與圖6。

試驗進(jìn)行14周后處死小鼠，在處死小鼠前12小時禁食，測定小鼠空腹血糖，見圖12。處死后采集血清，使用BS-480全自動生化分析儀(Mindray)測定血清甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)，見圖10與11。分離得到肝臟、附睪脂肪與腎周脂肪，分別稱重。不同組小鼠的脂肪濕重及肝臟重量見表1與表2，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同的上標(biāo)字母表示具有差異顯著性(p＜0.05)。

表1：DC對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂肪濕重的影響(n＝10)

表2：DC對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠肝臟濕重的影響(n＝10)

處死后小鼠肝臟組織用含有蛋白酶抑制劑的裂解液處理，用組織勻漿機(jī)勻漿，離心取上清用于Western Blot實驗。配制濃度以重量計8％的丙烯酰胺分離膠與5％濃縮膠，點入蛋白樣品。電泳條件如下：恒壓80V，待maker跑到分離膠之后將電壓調(diào)至恒壓120V。當(dāng)溴酚藍(lán)跑到蛋白膠底部時，關(guān)閉電源。在冰水浴中，用PVDF轉(zhuǎn)膜，300mA，3小時。用濃度以重量計5％的脫脂奶粉封閉一小時。用TBST洗膜后，將膜放入配制脂肪酸合成酶(FSAN)一抗中，在溫度4℃下孵育18小時后，洗膜，室溫孵育兔二抗兩小時，洗膜后用顯影液顯影，用蛋白成像系統(tǒng)曝光拍照。具體結(jié)果見附圖7。

處死小鼠肝臟、脂肪組織用4％多聚甲醛溶液固定。經(jīng)過常規(guī)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、分化、漂洗、復(fù)染、脫水、透明與封片步驟對肝臟與脂肪組織進(jìn)行H&E染色病理切片制作，在顯微鏡下觀察拍照。具體結(jié)果見附圖8與9。

C、試驗結(jié)果

由附圖5-11與表1-2列出的結(jié)果知道，本發(fā)明丁香乙醇提取物能抑制肥胖小鼠肝臟中FASN蛋白水平的表達(dá)，能夠減輕高脂營養(yǎng)性肥胖小鼠的體重、肝臟和脂肪組織重量，降低血清中甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇，從而能夠緩解肝臟、脂肪組織的病變。

試驗實施例4：丁香乙醇提取物作為脂肪酸合成酶抑制劑對腫瘤細(xì)胞增殖抑制的體外試驗

A、實驗材料

腫瘤細(xì)胞株：

本實驗室凍存的人類肝癌細(xì)胞HepG2及人前列腺癌細(xì)胞LNCaP。

細(xì)胞培養(yǎng)基MEM和RPMI1640為Thermo公司產(chǎn)品。Alamarblue為Sigma公司產(chǎn)品。

受試藥物：

實施例3制備的丁香乙醇提取物用二甲亞砜(DMSO)助溶，用RPMI1640或MEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

B、實驗方法

細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清及1％雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI1640或MEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。每72小時用0.25％胰酶消化，母代與子代比為1:2～1:3擴(kuò)瓶傳代。

I、細(xì)胞WesternBlot試驗：

用0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心后計數(shù)，以合適濃度種于12孔板，在培養(yǎng)箱中在溫度37℃、5％CO₂的條件下培養(yǎng)24小時，以未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞作為空白對照組，陰性對照組組加入1μM羅格列酮誘導(dǎo)分化，處理組加入1μM羅格列酮與100mg/L本發(fā)明丁香乙醇提取物，繼續(xù)培養(yǎng)4天，收細(xì)胞于加有蛋白酶抑制劑的Ripa裂解液中，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，離心去上清，測定濃度后加入loadingbuffer，用漩渦振蕩器混勻，沸水煮10分鐘后用于WesternBlot實驗。

配制8％的丙烯酰胺分離膠與5％的濃縮膠，點入蛋白樣品。電泳條件如下：恒壓80V，待maker跑到分離膠之后將電壓調(diào)至恒壓120V。當(dāng)溴酚藍(lán)跑到蛋白膠底部時，關(guān)閉電源。在冰水浴中，用PVDF轉(zhuǎn)膜，300mA，3小時。用5％的脫脂奶粉封閉一小時。用TBST洗膜后，將膜放入配制脂肪酸合成酶(FSAN)一抗中，在溫度4℃下孵育18小時后，洗膜，室溫孵育兔二抗兩小時，洗膜后用顯影液顯影，用蛋白成像系統(tǒng)曝光拍照，曝光后拍照。

試驗結(jié)果列于附圖13與14，這些結(jié)果表明，本發(fā)明丁香乙醇提取物對LNCaP及HepG2細(xì)胞的FASN蛋白水平的表達(dá)有一定的抑制作用。

II、細(xì)胞存活率測定試驗：

用0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心后計數(shù)，以合適的濃度接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中在溫度37℃、5％CO₂的條件下培養(yǎng)24小時，分別加入不同濃度的丁香乙醇提取物，另外以單純培養(yǎng)液和未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞作為空白對照和陰性對照，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)72小時后，按照10μl/孔加入Alamarblue試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，按照100μL/孔加入10％SDS溶解液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，用酶標(biāo)儀測定在波長570nm處的OD值。按以下公式計算細(xì)胞存活率。

III、棕櫚酸與丁香乙醇提取物共同作用腫瘤細(xì)胞試驗

用0.25％胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心后計數(shù)，以合適的濃度接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中在溫度37℃、5％CO₂的條件下培養(yǎng)24小時，分別加入不同濃度的棕櫚酸與100mg/L本發(fā)明丁香乙醇提取物，另外用添加空白溶劑的純培養(yǎng)液和未經(jīng)藥物作用的細(xì)胞作為空白對照和陰性對照，每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)72小時后，按照10μl/孔加入Alamarblue試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，再按照100μL/孔加入10％SDS溶解液繼續(xù)培養(yǎng)4小時，用酶標(biāo)儀測定在波長570nm處OD值，計算細(xì)胞存活率。

試驗結(jié)果列于附圖15與16。這些試驗結(jié)果表明，丁香乙醇提取物對HepG2與LNCaP細(xì)胞表現(xiàn)出較好的增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的提高，對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用相應(yīng)的增強(qiáng)。由附圖17與18知道，加入不同濃度的FASN產(chǎn)物棕櫚酸后，丁香乙醇提取物對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用會有一定程度的削弱，且削弱程度隨棕櫚酸添加濃度變強(qiáng)。

IV、丁香乙醇提取物對LNCaP腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期作用試驗

未處理細(xì)胞、丁香乙醇提取物處理細(xì)胞、丁香乙醇提取物與棕櫚酸共同處理的細(xì)胞在培養(yǎng)48小時后，收集細(xì)胞，用PBS清洗2次，用預(yù)冷乙醇(以體積計70％)在溫度4℃下固定過夜，PI染色重懸細(xì)胞，避光室溫孵育15min。1小時以內(nèi)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期中不同時期的細(xì)胞數(shù)，其試驗結(jié)果見附圖19與20。

這些試驗結(jié)果表明，丁香乙醇提取物的處理使得腫瘤細(xì)胞G2期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增加，表明丁香乙醇提取物在一定程度上阻礙了細(xì)胞周期的進(jìn)行。同時，F(xiàn)ASN產(chǎn)物棕櫚酸對于丁香乙醇提取物處理的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的阻礙作用有一定的削弱。