本發(fā)明涉及凝結(jié)芽孢桿菌在制備預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征制劑中的應(yīng)用，具體是用凝結(jié)芽孢桿菌預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征。
背景技術(shù)：
：慢性疲勞綜合征(cfs)是機(jī)體軀體及精神上長期過度消耗不能緩解，以反復(fù)出現(xiàn)、不易消除的嚴(yán)重功能紊亂為特征的疾病。該病對患者的記憶力、注意力、工作、教育和個人活動帶來嚴(yán)重的影響。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，cfs的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。據(jù)美國疾病控制中心(cdc)預(yù)測：慢性疲勞已成為21世紀(jì)影響人類健康的主要疾病之一，我國該病的發(fā)病率也正逐年上升，涉及我國城市人口的10％—25％，且女性高于男性，高發(fā)年齡段為31-50歲，嚴(yán)重危害著國人的健康。由于cfs病因不明，目前尚無特效治療方法。目前，慢性疲勞綜合征的藥物治療以緩解臨床癥狀為主。由于患者對很多藥物都表現(xiàn)出高度敏感性，特別是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，因此，一般治療策略是從小劑量開始，逐步加量，此外還需慎用可引起疲勞副反應(yīng)的藥物。藥物治療僅緩解癥狀，并不能有效的治療疾病，且所用藥物長期服用會產(chǎn)生多種毒副作用。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌能夠有效預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征，安全沒有任何毒副作用，效果優(yōu)于雙歧桿菌，且未見相關(guān)研究報道，特申請此發(fā)明專利。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的制劑，該制劑由凝結(jié)芽孢桿菌制成。本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過下述步驟實(shí)施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實(shí)現(xiàn)的制備工藝均可以：采取可能含凝結(jié)芽孢桿菌的樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內(nèi)，研究時從中取一定量的樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7三個稀釋梯度，分別涂布于凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱，37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》、相關(guān)細(xì)菌鑒定文獻(xiàn)或16srrna序列對比分析進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌鑒定和毒性試驗(yàn)，將無毒性的凝結(jié)芽孢桿菌干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協(xié)同作用。凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，酵母粉5g，葡萄糖5g，磷酸二氫鉀2g，吐溫801.0ml，碳酸鈣20g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂15g，調(diào)ph6.2-6.5，115℃高壓滅菌20min。凝結(jié)芽孢桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物3g，氯化鈉5g，葡萄糖5g，調(diào)ph7，115℃高壓滅菌20min。為進(jìn)一步具體說明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無毒性的凝結(jié)芽孢桿菌，本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌并不局限于為說明本發(fā)明所述的菌，只要無毒性的凝結(jié)芽孢桿菌均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌優(yōu)選但不限于凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmccno.1207或凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmccno.1.2407。本發(fā)明實(shí)施說明中優(yōu)選使用的凝結(jié)芽孢桿菌的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)：1、為說明本發(fā)明，本發(fā)明利用上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmccno.1207。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察：桿狀，革蘭氏染色陽性。平板形態(tài)：菌落呈白色、圓形、邊緣整齊、大小2-3mm。3、生理生化鑒定明膠液化：－；過氧化氫酶：+；vp試驗(yàn)：+；苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)－。4、糖酵解實(shí)驗(yàn)鑒定葡萄糖：+；麥芽糖：+；蔗糖：+；木糖：－；果糖：+；鼠李糖：－；乳糖：+；菊粉：+；半乳糖：+；糊精：+。5、分離的菌進(jìn)行16srrna基因測序，測得序列用blast與genbank和rdp數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行相似性分析，確定分離的菌為凝結(jié)芽孢桿菌。本發(fā)明所述的凝結(jié)芽孢桿菌指活的生物個體。本發(fā)明是以有效劑量按上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌作為主要活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、粉劑等劑型。本發(fā)明所述凝結(jié)芽孢桿菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的凝結(jié)芽孢桿菌根據(jù)上面所述單獨(dú)或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。本發(fā)明所述制劑包括凝結(jié)芽孢桿菌單獨(dú)應(yīng)用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，尤其包括凝結(jié)芽孢桿菌單獨(dú)應(yīng)用或與雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明所述雙歧桿菌指活的生物個體。本發(fā)明所述雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用的制劑中，固體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上；或液體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達(dá)到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。由于本發(fā)明首次公開了凝結(jié)芽孢桿菌作為主要活性成份制成制劑在預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征中的應(yīng)用，因此含上述凝結(jié)芽孢桿菌的制劑在預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征制劑中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所述的凝結(jié)芽孢桿菌在制成任何一種劑型時，均具有預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的作用。如果其組份中含有凝結(jié)芽孢桿菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標(biāo)識上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的作用，則落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的凝結(jié)芽孢桿菌可以制成藥品、保健食品、食品或飲品等。具體實(shí)施方式制備例說明：上述已經(jīng)對凝結(jié)芽孢桿菌制劑的制備進(jìn)行說明，這里通過凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmccno.1207或凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmccno.1.2407(凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmccno.1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)為例進(jìn)行具體說明，其他凝結(jié)芽孢桿菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實(shí)施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實(shí)施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發(fā)明實(shí)施例所述，公知的能夠達(dá)到制備目的的方法均可以，實(shí)施例的制備說明只是對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。制備實(shí)施例1凝結(jié)芽孢桿菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取人的糞便、土壤、草垛底物等樣品，然后將樣品置于滅菌瓶內(nèi)，從中取2克樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個稀釋梯度，涂布于凝結(jié)芽孢桿菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱，37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落接種到凝結(jié)芽孢桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為1×109cfu/g以上，然后進(jìn)行菌種鑒定，經(jīng)生理生化和16srrna序列對比分析鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌，為凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmccno.1207。凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmccno.1.2407菌粉制備，將凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmcc1.2407接種到凝結(jié)芽孢桿菌液體擴(kuò)增培養(yǎng)基中，37℃下擴(kuò)增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為1×109cfu/g以上。2毒性試驗(yàn)2.1動物及分組取30只spf級別小鼠，6-8周齡，體重14-18g，隨機(jī)分凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207組、凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1.2407組和未給藥組，每組10只。2.2制備菌液將上述不同的凝結(jié)芽孢桿菌菌粉分別用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為1×109cfu/ml的菌液。2.3方法各凝結(jié)芽孢桿菌組和未給藥組均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，各凝結(jié)芽孢桿菌組每天灌服凝結(jié)芽孢桿菌菌液0.5ml，未給藥組每天灌服純化水0.5ml，飼喂14天，觀察體重及毒性反應(yīng)。2.4結(jié)果各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運(yùn)動失調(diào)、姿態(tài)異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，未見中毒反應(yīng)。3制備成粉劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)無毒性，就可將凝結(jié)芽孢桿菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)凝結(jié)芽孢桿菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數(shù)不低于1×107cfu/g，然后裝袋。應(yīng)用效果實(shí)施例說明：本發(fā)明以凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmccno.1207或凝結(jié)芽孢桿菌保藏編號cgmccno.1.2407為代表說明凝結(jié)芽孢桿菌的應(yīng)用效果。本發(fā)明中使用的雙歧桿菌來自于市場銷售產(chǎn)品，公眾能夠購買到的雙歧桿菌活菌均可。應(yīng)用效果實(shí)施例1：凝結(jié)芽孢桿菌在治療慢性疲勞綜合征中的應(yīng)用1模型組制備：1.1實(shí)驗(yàn)動物健康雄性wistar大鼠，體重(180±20)g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)飼養(yǎng)一周：按晝夜節(jié)律采光12h，控制溫度、濕度，自由攝取食物和水，每日定時更換飼料，通風(fēng)良好，排除其它應(yīng)激因素干擾。1.2制備方式采用強(qiáng)制冷水游泳法(1d)+慢性束縛法(2d)的方式建立大鼠慢性疲勞綜合征模型，共計造模21d。游泳水溫為(10±1)℃，每次游泳持續(xù)時間為6～8min，慢性束縛持續(xù)時間為3h，每次造模時間隨機(jī)。1.3模型組制備結(jié)果造模成功。2藥物治療實(shí)驗(yàn)：2.1實(shí)驗(yàn)方法選取體重(180±20)g的健康雄性wistar大鼠50只，隨機(jī)分為正常對照組(n＝10)、凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207組(n＝10)、凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1.2407組(n＝10)、雙歧桿菌組(n＝10)、模型對照組(n＝10)。所有對象均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致。正常對照組不做任何處理，各治療組和模型對照組按1.2所述方式建立小鼠慢性疲勞綜合征模型，并于模型建立的第1天起，凝結(jié)芽孢桿菌(cgmccno.1207、cgmccno.1.2407)和雙歧桿菌治療組使用含菌數(shù)為1×106cfu/ml(用0.9％生理鹽水調(diào)制菌粉)的菌液灌服0.5ml，模型對照組和正常對照組每天灌服0.9％生理鹽水0.5ml，直至第21天結(jié)束。觀察凝結(jié)芽孢桿菌對慢性疲勞綜合征大鼠行為學(xué)的影響，并與雙歧桿菌進(jìn)行比較。2.2行為學(xué)評估對實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行行為學(xué)評估，包括體力和精神疲勞檢測(鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn))和學(xué)習(xí)記憶測試(moirrs水迷宮測試)。數(shù)據(jù)使用spss21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。3結(jié)果3.1體力和精神疲勞評估與對照組相比較，慢性疲勞綜合征模型大鼠鼠尾懸掛不動時間增加(p＜0.01)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。與慢性疲勞綜合征模型大鼠相比，凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治療后，大鼠鼠尾懸掛不動時間降低(p＜0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與雙歧桿菌治療組大鼠相比，凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治療組鼠尾懸掛不動時間降低(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207組和cgmccno.1.2407組之間，大鼠鼠尾懸掛不動時間無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。凝結(jié)芽孢桿菌對慢性疲勞綜合征大鼠的體力和精神疲勞有顯著改善作用，并顯著高于雙歧桿菌治療組。見表1。表1不同組別大鼠鼠尾懸掛行為變化統(tǒng)計分析組別例數(shù)鼠尾懸掛不動時間(s)正常對照組10144.20±11.17模型對照組10193.25±14.69雙歧桿菌治療組10174.22±12.58凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207組10157.71±12.62凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1.2407組10154.41±12.443.2學(xué)習(xí)記憶能力評估與對照組相比較，慢性疲勞綜合征模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力差(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與慢性疲勞綜合征模型大鼠相比，凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治療后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與雙歧桿菌治療組大鼠相比，凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207組和cgmccno.1.2407組之間，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。凝結(jié)芽孢桿菌能顯著提高慢性疲勞綜合征大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其效果顯著高于雙歧桿菌。見表2。表2不同組別大鼠學(xué)習(xí)記憶能力統(tǒng)計分析組別例數(shù)學(xué)習(xí)記憶能力(s)正常對照組1023.78±10.83模型對照組1068.25±14.58雙歧桿菌治療組1052.24±12.30凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1207組1036.85±12.11凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1.2407組1038.52±11.624討論慢性疲勞綜合征模型組和正常對照組相比大鼠的體力和精神疲勞顯著增加(p＜0.01)，學(xué)習(xí)記憶能力顯著變差(p＜0.01)，而經(jīng)凝結(jié)芽孢桿菌治療后，體力和精神疲勞降低(p＜0.01)，學(xué)習(xí)記憶能力提高(p＜0.01)，且療效顯著好于雙歧桿菌治療組。表明凝結(jié)芽孢桿菌干預(yù)能顯著減少慢性疲勞綜合征大鼠的慢性疲勞綜合征癥狀。凝結(jié)芽孢桿菌制劑能夠有效預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征，明顯減少慢性疲勞綜合征癥狀，且無任何毒副作用，應(yīng)用依從性好，是預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的新方法、新突破。本發(fā)明在實(shí)施過程中所使用的微生物菌種已于2004年8月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所郵編100101)保藏。分類命名：凝結(jié)芽孢桿菌bacilluscoagulans,保藏編號cgmccno.1207。凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmccno.1207由本發(fā)明申請單位自行分離獲得，已在商業(yè)渠道銷售，并且已經(jīng)授權(quán)專利保護(hù)(專利號200410098660.4)，按照專利審查指南的規(guī)定，公眾能夠從商業(yè)渠道買到或已經(jīng)授權(quán)，不用保藏，即不用提供保藏證明，因此，本發(fā)明未提供凝結(jié)芽孢桿菌tbc169保藏編號cgmccno.1207保藏證明。凝結(jié)芽孢桿菌cgmccno.1.2407購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。當(dāng)前第1頁12