本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從藍(lán)莓葉中提取高純度多酚的方法

背景技術(shù)：

藍(lán)莓又名篤斯越橘、藍(lán)漿果等，原產(chǎn)于北美，按照植物學(xué)分類(lèi)，屬于杜鵑花科越橘亞科越橘屬多年生落葉或常綠灌木。與藍(lán)莓果實(shí)相比，藍(lán)莓葉的多酚含量更高。南京地區(qū)兔眼藍(lán)莓藍(lán)莓葉中多酚含量高達(dá)81.82mg沒(méi)食子酸當(dāng)量/g干重。藍(lán)莓葉多酚組成主要有咖啡?？崴犷?lèi)、兒茶素及其聚合物、槲皮素及其糖苷衍生物、山奈酚及其糖苷衍生物等。藍(lán)莓葉多酚是藍(lán)莓葉中的主要生理活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒以及降血壓、血脂等功效，在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

目前，研究者將研究重點(diǎn)集中在藍(lán)莓果實(shí)，對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中所含有的多糖、花色苷、黃酮以及揮發(fā)性香氣成分等的研究已經(jīng)非常成熟，然而對(duì)藍(lán)莓葉多酚的研究相對(duì)匱乏。近年來(lái)隨著我國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，藍(lán)莓葉作為藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物，其保健功能越來(lái)越受到消費(fèi)者的關(guān)注。目前，藍(lán)莓葉保健茶、藍(lán)莓葉蛋白肽營(yíng)養(yǎng)品等功能性食品均有報(bào)道。深入研究藍(lán)莓葉多酚的提取、純化工藝，對(duì)開(kāi)發(fā)藍(lán)莓葉天然藥物和保健食品、實(shí)現(xiàn)藍(lán)莓葉資源的綜合利用具有積極意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前，藍(lán)莓葉中多酚提取多采用溶劑提取法，存在著時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)溶劑用量大、提取率低等一系列缺點(diǎn)。

本技術(shù)：
采用超聲波法輔助有機(jī)溶劑溶液提取藍(lán)莓葉中多酚化合物，利用超聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用破壞植物細(xì)胞壁，使溶劑滲透到細(xì)胞中，從而縮短提取時(shí)間、提高提取效率。本發(fā)明對(duì)乙醇溶液濃度、料液比以及大孔樹(shù)脂類(lèi)型進(jìn)行了優(yōu)化或者篩選，取得了較好的提取率與提取效果。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方案如下：

1)將采摘后的藍(lán)莓葉沖洗、干燥、組織搗碎機(jī)粉碎成粉末；

2)將藍(lán)莓葉粉末加入乙醇水溶液中，經(jīng)超聲波輔助提取；

3)將步驟2)中的混合物經(jīng)8層紗布過(guò)濾去除殘?jiān)玫蕉喾哟痔嵋?；

4)將多酚粗體液1離心取上清液得到淡黃色多酚粗提液2；

5)將多酚粗體液2倒入旋蒸瓶中旋蒸，待溶液變?yōu)辄S褐色濃稠液體后停止旋蒸；

6)將步驟5)中得到的旋蒸液冷凍干燥后得到藍(lán)莓葉多酚粗提物并保存于-20℃冰箱中備用。

7)將步驟6)得到的藍(lán)莓葉多酚粗提物用去離子水配成溶液，并用稀鹽酸酸化。

8)將步驟7)得到的溶液吸附到大孔樹(shù)脂柱上；

9)將吸附多酚后的樹(shù)脂用去離子水沖洗，再用乙醇進(jìn)行洗脫，將所得洗脫液旋蒸除去乙醇，冷凍干燥后得到多酚提取粉末。

10)將步驟6)中得到的藍(lán)莓葉多酚粗提物和步驟9)中得到的藍(lán)莓葉多酚分別用95％乙醇配制成梯度濃度溶液，測(cè)定其對(duì)abts自由基和dpph自由基的清除能力。

制備得到的藍(lán)莓葉多酚呈深黃色粉末狀，該樣品對(duì)abts自由基和dpph自由基均具有較好的清除能力，并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。藍(lán)莓葉多酚對(duì)abts自由基和dpph自由基的半抑制濃度分別為90.33和7.37μg/ml。

優(yōu)選的，步驟1)，粉碎成粉末后過(guò)40-50目篩；

優(yōu)選的，步驟2)，乙醇水溶液濃度為60％，料液比為1∶30；

優(yōu)選的，步驟2)，超聲時(shí)間為20-25min，溫度為30℃，超聲波功率為500w，頻率40khz；

優(yōu)選的，步驟4)，離心力為4000-5000g，離心時(shí)間為15-20min；

優(yōu)選的，步驟7)，溶液濃度為2.5-3mg/ml，酸化后ph為2-3；

優(yōu)選的，步驟8)，大孔樹(shù)脂柱填料可以選擇為hpd400型大孔樹(shù)脂，徑高比為1∶8-1∶10；

優(yōu)選的，步驟8)，以3-4bv(樹(shù)脂床體積)/h吸附速率吸附在大孔樹(shù)脂柱上，上樣量為2-2.5bv；

優(yōu)選的，步驟8)，將吸附好的樹(shù)脂先用4-6bv的去離子水以1-2bv/h的流速洗凈樹(shù)脂，再用2-3bv40-60％濃度乙醇溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為0.5-1bv/h。

附圖說(shuō)明

圖1為乙醇濃度對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響圖；

圖2為料液比對(duì)藍(lán)莓葉多酚提取率的影響圖；

圖3為大孔樹(shù)脂類(lèi)型對(duì)藍(lán)莓葉多酚吸附率(a)與解析率(b)的影響圖；

圖4為藍(lán)莓葉多酚提取物、藍(lán)莓葉多酚以及蘆丁對(duì)abts自由基清除作用分析圖；

圖5為藍(lán)莓葉多酚提取物、藍(lán)莓葉多酚以及蘆丁對(duì)dpph自由基清除作用分析圖；

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案、積極效果更加清除明白，通過(guò)以下實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。以下對(duì)于實(shí)施具體方案的描述僅用于解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明

實(shí)施例1：

1)將采摘后的藍(lán)莓葉沖洗、干燥、粉碎成粉末后過(guò)40目篩；

2)將藍(lán)莓葉粉末加入60％乙醇水溶液中，料液比為1∶30，經(jīng)超聲波提取20min，溫度為30℃，超聲波功率為500w，頻率40khz；

3)將步驟2)中的混合物經(jīng)8層紗布過(guò)濾去除殘?jiān)玫蕉喾哟痔嵋?；

4)將多酚粗提液15000g條件下離心15min，取上清液得到淡黃色多酚粗體液2；

5)將多酚粗體液2倒入旋蒸瓶中旋蒸，待溶液變?yōu)辄S褐色濃稠液體后停止旋蒸；

6)將步驟5)中得到的旋蒸液冷凍干燥后得到藍(lán)莓葉多酚粗提物并保存于-20℃冰箱中備用。

7)將步驟6)得到的藍(lán)莓葉多酚粗提物用去離子水配成3mg/ml溶液，并用稀鹽酸調(diào)至ph2。

8)以3bv/h速度將步驟7)得到的溶液吸附到徑高比1∶8的hpd400型大孔樹(shù)脂柱上，上樣量為2bv；

9)將吸附多酚后的樹(shù)脂用4bv去離子水沖洗，流速為1.5bv/h，再用3bv50％濃度的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，將所得洗脫液旋蒸除去乙醇，冷凍干燥得到藍(lán)莓葉多酚粉末。

10)將步驟6)中得到的藍(lán)莓葉多酚粗提物和步驟9)中得到的藍(lán)莓葉多酚分別用95％乙醇溶液配制成梯度濃度溶液，測(cè)定其對(duì)abts自由基和dpph自由基的清除能力。

制備得到的藍(lán)莓葉多酚呈深黃色粉末狀，該樣品對(duì)abts自由基和dpph自由基均具有較好的清除能力，并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。藍(lán)莓葉多酚對(duì)abts自由基和dpph自由基的半抑制濃度分別為90.33和7.37μg/ml。

abts自由基清除率(％)＝[a0-(a1-a2)]/a0×100％；

a0組是水代替樣品溶液，a1組是樣品實(shí)驗(yàn)，a2組是磷酸緩沖液代替abts溶液。

dpph自由基清除率(％)＝[a0-(a1-a2)]/a0×100％；

a0組是水代替樣品溶液，a1組是樣品實(shí)驗(yàn)，a2組是95％乙醇溶液代替dpph溶液。

以上舉例僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例。本發(fā)明并不限于以上實(shí)施例，從本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容直接導(dǎo)出或者聯(lián)想變形所得的制備方法，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗氧化活性的藍(lán)莓葉多酚制備方法，該方法包括超聲波提取，過(guò)濾，離心取上層液，減壓濃縮，HPD?400型大孔樹(shù)脂柱層析純化等步驟；采用ABTS法和DPPH法評(píng)價(jià)藍(lán)莓葉多酚粗提物和HPD?400型大孔樹(shù)脂純化得到的藍(lán)莓葉多酚的自由基清除活性，并用蘆丁作為對(duì)照。本發(fā)明的藍(lán)莓葉多酚制備方法具有提取效率高、重復(fù)性好、條件溫和、無(wú)污染等特點(diǎn)，制備的藍(lán)莓葉多酚具有顯著的抗氧化活性，因此在食品工業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：李春陽(yáng);馮進(jìn);王帆;閆征;吳寒
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：2017.06.27
技術(shù)公布日：2017.09.29