本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gbm)是高惡性、高侵襲性的原發(fā)瘤，術(shù)中難以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞100％的切除，而殘余膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(gic)和膠質(zhì)瘤細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的根本原因，因此，尋找能同時(shí)靶向殺傷殘余gic和膠質(zhì)瘤細(xì)胞的方法，是抑制腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。gbm臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)方案是手術(shù)切除并輔以術(shù)后的放療和化療。目前治療腦膠質(zhì)瘤還有一些比較成熟的方案包括替莫唑胺(temozolomid，tmz)，丙卡嗪、洛莫司汀和長(zhǎng)春新堿(procarbazine?lomustine?vincristine，pcv)和mtor(mammalian?target?of?rapamycin，mtor)抑制劑。替莫唑胺是治療膠質(zhì)瘤的一線化療藥物，它是一種小分子烷基化劑，2005年一項(xiàng)研究表明tmz聯(lián)合放療較單純放療顯著延長(zhǎng)了膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的中位生存期，但由于其耐藥性的出現(xiàn)，膠質(zhì)瘤患者的中位生存率仍然很低。pcv是化療藥物的組合，由于其具有緩解臨床癥狀的潛力，在低級(jí)別膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)治療中具有良好的治療作用。mtor抑制劑是通過(guò)直接作用于mtor靶點(diǎn)，抑制活化mtor及其下游蛋白質(zhì)的活性，干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝。temsirolimus和everolimus是一種小分子抑制劑，可以阻斷哺乳動(dòng)物的mtor，從而調(diào)控膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展，但由于其耐藥機(jī)制的發(fā)展，mtor抑制劑的臨床試驗(yàn)顯示對(duì)膠質(zhì)瘤的療效非常有限。除上述較成熟的治療策略以外，還開(kāi)發(fā)了一些有前景的治療策略包括腫瘤治療場(chǎng)、免疫療法、酪氨酸激酶抑制劑等新興的治療策略，但都尚未在臨床試驗(yàn)中取得較好的治療效果。米托蒽醌(mit)對(duì)gic及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的殺傷作用，通過(guò)干擾核酸合成和雙鏈斷裂修復(fù)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，且notch?1通路在gic中高度激活并在調(diào)控gic的增殖、干性維持等行為中發(fā)揮著重要作用?？拱┧幬锶缍嗳岜刃恰⒆仙即嫉却嬖谠S多局限性，包括在水溶液中的溶解度差，全身非特異性分布以及癌細(xì)胞耐藥性等，因此，基于單一藥物的癌癥治療策略是不完善的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系的制備及應(yīng)用。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種負(fù)載米托蒽醌和sirna的外泌體遞藥體系，dvap靶向肽修飾的外泌體，其內(nèi)包載sirna和米托蒽醌(mitoxantrone,mit)。

3、優(yōu)選地，sirna序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。

4、負(fù)載米托蒽醌和sirna的外泌體遞藥體系的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

5、步驟一：dvap靶向肽修飾外泌體得到dvap-exo；

6、步驟二：將sirna和mit包載到dvap-exo中，得到dvap-exo/mit/sirna。

7、優(yōu)選地，步驟一中，先將dbco連接在外泌體外表面，得到dbco-exo，再將dvap-n3與dbco-exo混合孵育后，得到dvap靶向肽修飾的外泌體dvap-exo。

8、優(yōu)選地，將10μm的dbco-sulfo-nhs溶解于dmso，加入重懸于pbs中的外泌體，在25℃、120rpm的條件下反應(yīng)4h，除去多余的dbco-sulfo-nhs得到dbco-exo；

9、將疊氮基團(tuán)修飾的dvap-n3與dbco-exo在4℃、搖床100rpm的條件下孵育，消除游離的肽，制備得到dvap-exo。

10、優(yōu)選地，步驟二中，采用共孵育和轉(zhuǎn)染試劑合并法，將sirna和mit包載到修飾后的外泌體中。

11、優(yōu)選地，具體包括：

12、步驟1：按照dvap-exo：mit：sirna＝10：8：1的比例將mit、dvap-exo和sirna混勻，加入exo-fect轉(zhuǎn)染試劑在37℃孵育20min，之后加入exoquick-tc試劑，冰上靜置30min；

13、步驟2：在4℃、13000rpm的條件下離心3min，棄去上清保留沉淀，加適量pbs重懸，將得到的體系在透析袋中透析10h，得到dvap-exo/mit/sirna。

14、負(fù)載米托蒽醌和sirna的外泌體遞藥體系在制備抗膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。

15、優(yōu)選地，負(fù)載米托蒽醌和sirna的外泌體遞藥體系能夠作用于殘余膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞和或膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

16、本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：利用靶向修飾的外泌體共載米托蒽醌和sirna，米托蒽醌為可觸發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡的化療藥，形成的遞藥體系對(duì)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞有強(qiáng)殺傷作用，sirna為可降低膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞干性的小干擾核酸(sinotch?1)，實(shí)現(xiàn)對(duì)殘余的膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的靶向追蹤與殺傷，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療提供了一種新策略。

技術(shù)特征：

1.一種高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系，其特征在于：dvap靶向肽修飾的外泌體，其內(nèi)包載sirna和米托蒽醌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系，其特征在于：sirna序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示，dvap靶向肽序列如seq?id?no.3所示。

3.權(quán)利要求1或2所述的高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系的構(gòu)建方法，其特征在于：包括如下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟一中，先將dbco連接在外泌體外表面，得到dbco-exo，再將dvap-n3與dbco-exo混合孵育后，得到dvap靶向肽修飾的外泌體dvap-exo。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系的構(gòu)建方法，其特征在于：將10μm的dbco-sulfo-nhs溶解于dmso，加入重懸于pbs中的外泌體，在25℃、120rpm的條件下反應(yīng)4h，除去多余的dbco-sulfo-nhs得到dbco-exo；

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟二中，采用共孵育和轉(zhuǎn)染試劑合并法，將sirna和mit包載到dvap-exo中。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系的構(gòu)建方法，其特征在于：具體包括：

8.權(quán)利要求1或2所述的高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的sirna共遞藥體系在制備抗膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：負(fù)載米托蒽醌和sirna的外泌體遞藥體系能夠作用于膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞和或膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種高效靶向膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的siRNA共遞藥體系的制備及應(yīng)用，采用點(diǎn)擊化學(xué)的方法對(duì)外泌體進(jìn)行了<supgt;D</supgt;VAP靶向肽的修飾，再將siRNA和米托蒽醌包載到外泌體中，構(gòu)建得到靶向修飾的載藥外泌體<supgt;D</supgt;VAP?Exo/siRNA/MIT。靶向修飾的外泌體共載對(duì)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞有強(qiáng)殺傷作用，并可觸發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡的化療藥米托蒽醌和可降低膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞干性的小干擾核酸(siNotch?1)，實(shí)現(xiàn)對(duì)殘余的膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的靶向追蹤與殺傷，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療提供了一種新策略。

技術(shù)研發(fā)人員：賀慧寧,楊孟亭,朱夢(mèng)璽,于飛,孫璐,王建新
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津鍵凱科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10