本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，尤其涉及促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、缺血性心臟病發(fā)生過程中，梗死周圍邊界區(qū)的殘余缺血會導(dǎo)致心肌細(xì)胞進(jìn)一步受損，導(dǎo)致收縮功能進(jìn)行性下降，因此心肌梗死后的促血管新生治療具有重大的臨床治療意義。

2、目前心梗治療主要圍繞及時恢復(fù)血供、改善缺血缺氧以減少心肌壞死，治療手段主要包括藥物溶栓、血管支架介入、冠脈旁路移植術(shù)和心臟移植等。然而，這些治療手段均無法逆轉(zhuǎn)心肌梗死和心功能的進(jìn)一步惡化。此外，還存在心臟移植供體來源短缺、術(shù)后易出現(xiàn)免疫排斥等問題。近年來，利用組織工程原理構(gòu)建的工程化心臟貼片具有重建心肌再生微環(huán)境和修復(fù)心肌梗死的潛力。

3、作為搭載組織工程學(xué)心臟貼片的核心治療部件，以外泌體為代表的無細(xì)胞療法以其高效力，低免疫原性被廣泛認(rèn)可。使用不同類型細(xì)胞的外泌體均展現(xiàn)出不同程度的療效，目前涉及治療效力的外泌體如干細(xì)胞外泌體，內(nèi)皮細(xì)胞外泌體，均存在治療覆蓋范圍廣，但對心肌梗死后促血管新生的療效不確切不深入的問題，且現(xiàn)有外泌體所來源的細(xì)胞系培育難度大，提取效率低，無法應(yīng)對應(yīng)用轉(zhuǎn)化的批量生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有心臟貼片搭載的外泌體促血管新生療效不確切，培育難度大無法應(yīng)對批量生產(chǎn)的問題，本發(fā)明提供了促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案：

3、一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應(yīng)用。

4、進(jìn)一步的，所述心臟貼片中腫瘤源外泌體的質(zhì)量百分含量為0.5％。

5、進(jìn)一步的，所述腫瘤源外泌體包括卵巢癌caov-3細(xì)胞系來源的外泌體和/或卵巢癌ov-90細(xì)胞系來源的外泌體。

6、一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，步驟如下：

7、步驟一、腫瘤細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代：

8、將腫瘤細(xì)胞接種于復(fù)蘇培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到傳代要求后，用胰蛋白酶消化所得腫瘤細(xì)胞后進(jìn)行傳代擴(kuò)增；

9、步驟二、腫瘤細(xì)胞的無外泌體血清培養(yǎng)：

10、以去除外泌體的胎牛血清配置無外泌體血清專用培養(yǎng)基，將步驟一擴(kuò)增所得腫瘤細(xì)胞接入所述無外泌體血清專用培養(yǎng)基進(jìn)行72h無外泌體血清培養(yǎng)；

11、步驟三、收集腫瘤細(xì)胞：

12、收集步驟二已培養(yǎng)72h的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，通過兩步離心去除死細(xì)胞、雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞上清液；

13、步驟四、收集腫瘤源外泌體：

14、將步驟三收集的細(xì)胞上清液進(jìn)行超速離心沉降外泌體，用緩沖液重懸所得外泌體并離心提純，得到腫瘤源外泌體。

15、進(jìn)一步的，步驟一所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌caov-3細(xì)胞或卵巢癌ov-90細(xì)胞。

16、進(jìn)一步的，步驟一所述復(fù)蘇培養(yǎng)基為1640ripm+10％v/v胎牛血清+1％v/v雙抗；所述復(fù)蘇培養(yǎng)是在37℃、co2體積百分含量為5％的條件下培養(yǎng)。

17、進(jìn)一步的，步驟一所述細(xì)胞融合度為75～85％，所述胰酶為0.25％w/v胰蛋白酶溶液，消化時間為1min；所述傳代擴(kuò)增的傳代比例為1:3。

18、進(jìn)一步的，步驟二所述去除外泌體的胎牛血清是將胎牛血清于4℃，120000g超速離心16h，去除血清中富含的外泌體獲得的；所述無外泌體血清專用培養(yǎng)基為1640ripm+5％v/v去除外泌體的胎牛血清+1％v/v雙抗；所述無外泌體血清培養(yǎng)的傳代比例為1:5，培養(yǎng)條件為co2體積百分含量為5％的條件下，37℃溫度下培養(yǎng)。

19、進(jìn)一步的，步驟三所述兩步離心為先以300g離心10min去除死細(xì)胞及雜質(zhì)，再以2000g離心10min去除細(xì)胞碎片。

20、進(jìn)一步的，步驟四所述超速離心為120000g離心90min，所述離心提純?yōu)?20000g離心90min。

21、本發(fā)明的有益效果：

22、本發(fā)明創(chuàng)造性的將腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的促血管生成的病理機(jī)制反向整合到促進(jìn)梗死部位血管生成的治療機(jī)制，將腫瘤細(xì)胞強(qiáng)大、刺激、持久刺激新生血管生成的能力進(jìn)行有效利用。

23、本發(fā)明通過試驗證實，腫瘤源外泌體中se-cad蛋白(可溶性e-鈣黏蛋白)能與內(nèi)皮細(xì)胞的vegfr2位點結(jié)合發(fā)揮類vegf的作用，此種外泌體還具有促進(jìn)vegfr2表達(dá)的能力，這兩種能力使腫瘤源外泌體促內(nèi)皮細(xì)胞成管能力大于已知促血管生成的最高效力經(jīng)典因子vegf，具有促血管生成的確切療效。而且腫瘤細(xì)胞具有培育簡單、擴(kuò)增迅速、腫瘤源外泌體收集率突出的特點，能夠滿足轉(zhuǎn)化應(yīng)用和批量生產(chǎn)的要求。

24、本發(fā)明利用腫瘤源外泌體具有促血管生成的特點，將其提取轉(zhuǎn)化為治療缺血性心臟病的關(guān)鍵治療因子，通過搭載組織工程學(xué)心臟貼片的方式，能夠有效解決心肌梗死治療中不完全血管化及微循環(huán)障礙而導(dǎo)致的頑固性心衰、心肌梗死復(fù)發(fā)等問題，降低缺血性心臟病的復(fù)發(fā)率和病死率。

技術(shù)特征：

1.一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應(yīng)用，其特征在于，所述心臟貼片中腫瘤源外泌體的質(zhì)量百分含量為0.5％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體在制備用于缺血性心臟病再血管化治療的心臟貼片中的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤源外泌體包括卵巢癌caov-3細(xì)胞系來源的外泌體和/或卵巢癌ov-90細(xì)胞系來源的外泌體。

4.一種權(quán)利要求1-3任一所述的促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟如下：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述腫瘤細(xì)胞為卵巢癌caov-3細(xì)胞或卵巢癌ov-90細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述復(fù)蘇培養(yǎng)基為1640ripm+10％v/v胎牛血清+1％v/v雙抗；所述復(fù)蘇培養(yǎng)是在37℃、co2體積百分含量為5％的條件下培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟一所述細(xì)胞融合度為75～85％，所述胰酶為0.25％w/v胰蛋白酶溶液，消化時間為1min；所述傳代擴(kuò)增的傳代比例為1:3。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟二所述去除外泌體的胎牛血清是將胎牛血清于4℃，120000g超速離心16h，去除血清中富含的外泌體獲得的；所述無外泌體血清專用培養(yǎng)基為1640ripm+5％v/v去除外泌體的胎牛血清+1％v/v雙抗；所述無外泌體血清培養(yǎng)的傳代比例為1:5，培養(yǎng)條件為co2體積百分含量為5％的條件下，37℃溫度下培養(yǎng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟三所述兩步離心為先以300g離心10min去除死細(xì)胞及雜質(zhì)，再以2000g離心10min去除細(xì)胞碎片。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法，其特征在于，步驟四所述超速離心為120000g離心90min，所述離心提純?yōu)?20000g離心90min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法及應(yīng)用，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。為解決現(xiàn)有心臟貼片搭載的外泌體促血管新生療效不確切，培育難度大無法應(yīng)對批量生產(chǎn)的問題，本發(fā)明提供了促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體的制備方法及應(yīng)用，將促心梗后心肌再血管化的腫瘤源外泌體應(yīng)用于制備治療缺血性心臟病的心臟貼片中。本發(fā)明證實腫瘤源外泌體具有促血管生成的確切療效，且能夠滿足轉(zhuǎn)化應(yīng)用和批量生產(chǎn)的要求。本發(fā)明利用腫瘤源外泌體具有促血管生成的特點，通過搭載組織工程學(xué)心臟貼片的方式能夠有效解決心肌梗死治療中不完全血管化及微循環(huán)障礙而導(dǎo)致的頑固性心衰、心肌梗死復(fù)發(fā)等問題，降低缺血性心臟病的復(fù)發(fā)率和病死率。

技術(shù)研發(fā)人員：康凱,孫昊博,展旭,解萬東,秦思達(dá),靳元,孫哲,張金鳳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10