本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料中的組織修復(fù)領(lǐng)域，涉及一種梯度礦化的膠原纖維膜，本發(fā)明還包括其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、附著點(diǎn)是肌腱和骨骼連接的組織，其復(fù)雜的梯度形貌結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成與理化特性對(duì)肌腱－骨生理功能的執(zhí)行至關(guān)重要。近年來(lái)，隨著全民健身運(yùn)動(dòng)的大力推廣，肌腱－骨損傷的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。天然的肌腱－骨界面由分層纖維軟骨組成的過(guò)渡組織構(gòu)成，確保肌腱與骨骼之間的牢固連接，并有效地傳遞應(yīng)力；根據(jù)與骨表面的接近程度由低至高，肌腱－骨界面分為肌腱纖維區(qū)、未礦化纖維軟骨區(qū)、礦化纖維軟骨區(qū)和骨骼區(qū)。肌腱損傷在臨床上非常普遍，肌腱－骨界面的重建是治療過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，康復(fù)周期長(zhǎng)、應(yīng)變依賴性瘢痕形成以及血管形成不良等問(wèn)題導(dǎo)致術(shù)后恢復(fù)自然肌腱－骨(附著點(diǎn)組織)仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。

2、基于生物學(xué)手段的促進(jìn)肌腱－骨界面再生的策略主要包括將生物活性材料、合適的種子細(xì)胞或干細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和基因遞送等應(yīng)用于重建的界面。然而，迄今為止，這些替代方案中很少有提供成功的長(zhǎng)期解決方案。傳統(tǒng)的肌腱植入材料，如基于聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)的韌帶增強(qiáng)和重建系統(tǒng)和gore-tex，雖然具有優(yōu)異的機(jī)械性能，但卻存在缺乏生物活性的問(wèn)題，無(wú)法促進(jìn)適當(dāng)?shù)男陆M織生長(zhǎng)和與宿主組織的有效整合，從而導(dǎo)致肌腱－骨界面愈合效果不佳，甚至出現(xiàn)并發(fā)癥。此外，盡管同種異體移植物和自體移植物保留了天然肌腱的結(jié)構(gòu)和成分，以及生物活性分子，但供體部位發(fā)病率、不良免疫應(yīng)答和滑膜炎等負(fù)面影響限制了其臨床應(yīng)用。

3、目前的肌腱替代品有以下常見(jiàn)問(wèn)題：

4、a.大多數(shù)肌腱替代品不能發(fā)揮良好的生物活性：由不可降解聚合物制成的人工韌帶，如基于聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)的韌帶增強(qiáng)和重建系統(tǒng)雖然具有優(yōu)異的機(jī)械性能，但是缺乏令人滿意的生物活性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)新組織向內(nèi)生長(zhǎng)并與宿主組織良好整合，導(dǎo)致肌腱－骨界面愈合不良，甚至出現(xiàn)滑膜炎和長(zhǎng)期植入物失效等并發(fā)癥。

5、b.開(kāi)發(fā)具有相似異質(zhì)過(guò)渡區(qū)域的局限：?jiǎn)蜗嘀Ъ艿慕Y(jié)構(gòu)和組成均勻，通常不可能完全重建軟組織和硬組織及其界面。雙相支架具有兩相層狀結(jié)構(gòu)，每一層的成分、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能通常不同，可以同時(shí)滿足軟骨和軟骨下骨植入和修復(fù)的要求，但雙相支架在受損肌腱－骨界面上的整合力較差，力學(xué)穩(wěn)定性較弱，不利于缺損的修復(fù)。在多相支架設(shè)計(jì)中，支架被隔離成三層或多層，層之間表現(xiàn)出突然過(guò)渡的性質(zhì)，重建功能性天然附著點(diǎn)仍具挑戰(zhàn)性。

6、c.傳統(tǒng)的保守治療或手術(shù)修復(fù)主要側(cè)重于重建附著點(diǎn)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，而忽略了附著點(diǎn)組織再生：傳統(tǒng)手術(shù)治療主要是利用斷裂的肌腱末端來(lái)重建附著點(diǎn)：首先將斷裂的肌腱直接插入骨隧道，然后使用縫合線或螺釘對(duì)重建組織進(jìn)行機(jī)械錨定，并最大限度地減少外部載荷，以避免手術(shù)后意外松動(dòng)或再次撕裂。然而，重建的附著點(diǎn)可能會(huì)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)保持與骨骼的弱連接，導(dǎo)致斷裂處形成疤痕組織而不是所需的健康附著點(diǎn)組織，其缺乏肌腱和骨骼之間復(fù)雜過(guò)渡的重構(gòu)，因此傳統(tǒng)的保守治療或手術(shù)修復(fù)在肌腱－骨損傷修復(fù)方面的療效有限。

7、因此，迫切需要一種新型肌腱替代品，具有優(yōu)異的生物相容性、生物活性和力學(xué)性能，能夠促進(jìn)天然肌腱－骨界面的再生。仿生天然肌腱－骨界面的生物材料可為受損界面組織再生提供有利的環(huán)境，并誘導(dǎo)損傷處原位再生附著點(diǎn)組織。膠原蛋白是人體肌腱細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的主要成分，具有優(yōu)異的生物相容性和生物活性。模擬肌腱生理ecm的排列有序的膠原纖維材料被認(rèn)為是肌腱組織工程的理想材料。為了確保肌腱－骨界面支架具有高度仿生性，需要精心設(shè)計(jì)附著點(diǎn)支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)?？紤]到肌腱－骨界面的結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能、化學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞表型的梯度特征，設(shè)計(jì)具有結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能和生化梯度的仿生材料有助于促進(jìn)腱－骨界面的再生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有梯度礦化層的肌腱修復(fù)材料，以更好模擬天然肌腱－骨連接結(jié)構(gòu)，促進(jìn)肌腱-骨界面愈合。

2、本發(fā)明提供了一種梯度礦化的(高取向)膠原纖維膜，包括梯度礦化層與未礦化層。

3、所述梯度礦化層包括ⅰ型膠原蛋白組分和空間梯度分布的hap(羥基磷灰石)組分，

4、所述未礦化層由ⅰ型膠原蛋白組分組成。

5、優(yōu)選地，所述的ⅰ型膠原蛋白組分具有高度取向的纖維結(jié)構(gòu)，纖維結(jié)構(gòu)的herman取向因子分布在0.92-0.99。

6、一般來(lái)說(shuō)，由于礦化，所述梯度礦化層的厚度、寬度略大于所述未礦化層的厚度、寬度，但厚度、寬度之差可忽略不計(jì)。優(yōu)選地，所述梯度礦化層的寬度可以是所述未礦化層寬度的1-1.5倍，所述梯度礦化層的厚度可以是所述未礦化層厚度的1-1.5倍。較好的，所述梯度礦化層的寬度與厚度相同。

7、優(yōu)選地，所述梯度礦化層與所述未礦化層的長(zhǎng)度比為(1-9)：(1-9)，更選為(7-8)：(2-3)。

8、另一方面，本發(fā)明提供了上述梯度礦化的膠原纖維膜的制備方法。將膠原纖維膜沿著纖維取向方向豎直于容器底部放置，然后以0.3-0.7ml/h的速度將礦物質(zhì)溶液連續(xù)注入容器中，在35℃-39℃恒溫條件下礦化，礦化完成后去除表面多余的礦化液，然后使其在35℃-39℃恒溫條件干燥。

9、優(yōu)選地，將高取向膠原纖維膜豎直于容器底部放置后，以0.5-0.6ml/h的速度將礦物質(zhì)溶液連續(xù)注入容器中。然后，進(jìn)行恒溫礦化和/或干燥，溫度優(yōu)選為36℃-38℃)，更優(yōu)選地，溫度設(shè)定為37℃。

10、優(yōu)選地，所述礦物質(zhì)溶液ph值為7.37-7.49，其包括混合均勻的等體積的溶液a組分和溶液b組分。礦物質(zhì)溶液ph值優(yōu)選為7.40-7.42。

11、其中，溶液a組分為0.1m?cacl2·2h2o與0.02-0.04g/ml聚天冬氨酸固體粉末的混合溶液；優(yōu)選地，溶液a組分中聚天冬氨酸固體粉末的含量為0.03-0.04g/ml；更優(yōu)選地，溶液a組分中聚天冬氨酸固體粉末的含量為0.03g/ml。溶液b組分選自0.1m?na2hpo4與0.04-0.08g/ml聚丙烯酸固體粉末的混合溶液或0.1m?k2hpo4與0.04-0.08g/ml聚丙烯酸固體粉末的混合溶液中的至少任一種。優(yōu)選地，溶液b組分中聚丙烯酸固體粉末含量為0.06-0.08g/ml；更優(yōu)選地，溶液b組分中聚丙烯酸固體粉末含量為0.06g/ml。溶液a組分中聚天冬氨酸固體粉末的含量：溶液b組分中聚丙烯酸固體粉末含量為1：(1.5-2.5)，優(yōu)選地，為1：2。

12、優(yōu)選地，所述聚天冬氨酸固體粉末的分子量為10-11kda，所述聚丙烯酸固體粉末的分子量不小于2000da；所述聚天冬氨酸固體粉末與所述聚丙烯酸固體粉末的質(zhì)量濃度比為1：2。

13、優(yōu)選地，礦物質(zhì)溶液選自以下配方中的任意一種：

14、?。?mm?cacl2·2h2o+4.2mm?k2hpo4+50μg/ml?pasp；

15、ⅱ：10.0mm?cacl2·2h2o+6.0mm?na2hpo4+90mm?nacl+350μg/ml?paa+10mm?l-glutamic?acid；

16、ⅲ：1.67mm?cacl2·2h2o+9.5mm?na2hpo4+150mm?nacl+240μg/ml?pasp+sodiumcitrate；

17、ⅳ：sbf+180μg/ml?paa+2.5wt％tpp；或者，

18、ⅴ：solution?a:0.1m?cacl2·2h2o+0.03g/ml?pasp；solution?b:0.1m?na2hpo4+0.06g/ml?paa。

19、本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)配方的礦物質(zhì)含量依次升高，ii、ⅳ、v配方的hap特征晶體衍射峰顯著高于另兩組，v配方表現(xiàn)出最強(qiáng)的hap特征晶體衍射峰。

20、本發(fā)明中，所述高取向膠原纖維膜的制備方法包括以下步驟：

21、將拉伸至100％—200％應(yīng)變的膠原凝膠膜浸泡在0.1m?pbs溶液中1—4小時(shí)(優(yōu)選2—3小時(shí))，同時(shí)向膜的兩端連續(xù)加載以保持取向結(jié)構(gòu)；

22、浸泡后，將膠原凝膠膜置于nh3氣氛中12—36小時(shí)(優(yōu)選24—30小時(shí))，并同時(shí)在膠原凝膠膜兩端連續(xù)施加外力。

23、再一方面，本發(fā)明提供了所述的梯度礦化的高取向膠原纖維膜的應(yīng)用，所述的梯度礦化的高取向膠原纖維膜的在肌腱－骨修復(fù)中的應(yīng)用。

24、優(yōu)選地，所述的應(yīng)用包括下列中的一項(xiàng)或者若干項(xiàng)：

25、(1)具有對(duì)齊的分層纖維狀結(jié)構(gòu)，在對(duì)齊方向上增強(qiáng)機(jī)械性能：

26、(2)支持與肌腱和骨骼愈合相關(guān)的細(xì)胞的粘附和持續(xù)增殖；

27、(3)允許提供不同的局部理化環(huán)境，選擇性地促進(jìn)細(xì)胞向肌腱、軟骨或骨骼的分化，從而可能重建肌腱與骨骼界面組織的梯度細(xì)胞表型；

28、(4)增強(qiáng)愈合損傷部位的機(jī)械性能和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

29、本發(fā)明中，ahf-col是指經(jīng)過(guò)拉伸后獲得的高取向結(jié)構(gòu)膠原纖維膜。ahf-col在圖1之后的圖(如圖8)中是指電化學(xué)組裝膠原蛋白凝膠膜e-col經(jīng)過(guò)拉伸200％應(yīng)變后并通過(guò)生理離子溶液浸泡、nh3氣氛孵育24小時(shí)得到的高取向結(jié)構(gòu)膠原纖維膜。

30、如圖1所示，圖1中的ahf-cols是指電化學(xué)組裝膠原蛋白凝膠膜e-col經(jīng)過(guò)拉伸不同應(yīng)變(50％、100％、150％、200％)后并通過(guò)生理離子溶液浸泡、nh3氣氛孵育24小時(shí)得到的不同程度取向結(jié)構(gòu)膠原纖維膜，rf-col是電化學(xué)組裝膠原蛋白凝膠膜e-col不拉伸，但通過(guò)生理離子溶液浸泡、nh3氣氛孵育24小時(shí)得到的近似無(wú)取向結(jié)構(gòu)膠原纖維膜。ahf-col在圖1之后的圖(如圖8)中是特指電化學(xué)組裝膠原蛋白凝膠膜e-col經(jīng)過(guò)拉伸200％應(yīng)變后并通過(guò)生理離子溶液浸泡、nh3氣氛孵育24小時(shí)得到的高取向結(jié)構(gòu)膠原纖維膜。

31、gma-col是指梯度礦化后獲得的高取向/梯度礦化膠原纖維膜，是指對(duì)ahf-col(200％應(yīng)變的高取向結(jié)構(gòu)膠原纖維膜)采用礦化方案ⅴ進(jìn)行梯度礦化后獲得的高取向/梯度礦化膠原纖維膜。

32、mahf-col是礦化/高取向膠原纖維膜。mahf-cols是對(duì)上述200％應(yīng)變的高取向結(jié)構(gòu)膠原纖維膜ahf-col進(jìn)行礦化后獲得的高取向/礦化膠原纖維膜(此處礦化方式不是梯度礦化，而是礦化整個(gè)ahf-col(200％應(yīng)變)材料)；加上s是因?yàn)樘骄苛宋宸N礦化方案(ⅰ-ⅴ)對(duì)于ahf-col的礦化效果，并比較五種礦化方案(ⅰ-ⅴ)的礦化效果(圖8c-d、圖9)選取最好的礦化方案ⅴ，然后探究了采用礦化方案ⅴ礦化的ahf-col(200％應(yīng)變)后得到的高取向/礦化膠原纖維膜mahf-col(v)的相關(guān)理化性能(圖8e-n)。

33、本發(fā)明的有益效果如下：

34、(1)ahf-col具有對(duì)齊的分層纖維狀結(jié)構(gòu)，在對(duì)齊方向上表現(xiàn)出增強(qiáng)的機(jī)械性能：ahf-col的力學(xué)性能隨取向程度的提高而顯著提高，在200％應(yīng)變條件下制備的ahf-col在干燥狀態(tài)下最高的拉伸強(qiáng)度(95.97±1.6mpa)和楊氏模量(5.06±0.07gpa)。(來(lái)自不同動(dòng)物的天然肌腱組織的強(qiáng)度在55到120mpa之間變化)。

35、(2)梯度礦物含量利于機(jī)械剛度的空間連續(xù)變化：梯度礦物含量對(duì)于肌腱到骨骼的自然整合至關(guān)重要，為機(jī)械剛度的空間連續(xù)變化提供了一種機(jī)制，從而消除了界面處的高應(yīng)力，有效地將機(jī)械負(fù)荷從肌腱傳遞到骨骼。在植入物中構(gòu)建礦物質(zhì)含量梯度不僅可以更好地適應(yīng)體內(nèi)從肌腱到骨骼的機(jī)械剛度過(guò)渡，而且有可能為空間細(xì)胞表型提供異質(zhì)的物理化學(xué)線索(例如，剛度、成分)，促進(jìn)肌腱到骨骼的重建。控制礦化溶液在空間和時(shí)間上滲透到支架中，為在ahf-col上產(chǎn)生礦物梯度提供了一種潛在的方法。材料中纖維內(nèi)和纖維間hap的梯度分布可以模擬骨骼中礦物質(zhì)的分層空間分布，確保機(jī)械性能從相對(duì)柔韌的軟組織平穩(wěn)過(guò)渡到堅(jiān)硬的硬組織。

36、(3)gma-col上局部區(qū)域的分化表面形態(tài)、礦物質(zhì)含量、剛度和潤(rùn)濕性在一定程度上會(huì)影響細(xì)胞的粘附、增殖和分化：gma-col的不同區(qū)域表現(xiàn)出良好的生物相容性，支持與肌腱和骨骼愈合相關(guān)的細(xì)胞的粘附和持續(xù)增殖。此外，這些結(jié)果可能表明，gma-col允許提供不同的局部理化環(huán)境，可以在空間上選擇性地促進(jìn)細(xì)胞向肌腱、軟骨或骨骼的分化，從而可能重建肌腱與骨骼界面組織的梯度細(xì)胞表型。

37、(4)gma-col的植入顯著增強(qiáng)了愈合損傷部位的機(jī)械性能和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)：新形成的肌腱組織表現(xiàn)出成熟的膠原表達(dá)和組織排列，而重建的附著點(diǎn)組織則形成成熟的纖維軟骨，表現(xiàn)出與再生骨組織具有滲透性和緊密的連接。更令人鼓舞的是，這種材料的植入顯著增強(qiáng)了愈合損傷部位的機(jī)械性能和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)?？傮w而言，這種仿生植入物/貼片材料具有優(yōu)異的機(jī)械性能和梯度生物學(xué)功能，顯示出從肌腱到骨骼全面再生的巨大潛力。