本發(fā)明屬于眼科生物醫(yī)藥，具體涉及一種黑色素瘤來源的外泌體在防治角膜移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在器官和組織移植中，有效管理免疫排斥是一項巨大的挑戰(zhàn)，這主要涉及到受體對異體移植物的免疫應(yīng)答，移植后的免疫排斥引發(fā)了多方面的免疫應(yīng)答級聯(lián)反應(yīng)，其中宿主免疫細胞識別并針對移植組織中的異種抗原發(fā)起反應(yīng)。t細胞在攻擊移植組織和協(xié)調(diào)其他免疫應(yīng)答中發(fā)揮核心作用，加劇了組織損傷。因此，有效管理免疫排斥對于改善移植結(jié)果至關(guān)重要。目前，免疫排斥的管理主要依賴于長期使用免疫抑制劑。雖然這些藥物療法顯著限制了免疫排斥，但也帶來了一系列副作用，包括增加感染的易感性、代謝紊亂和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。因此，開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)策略在提高器官或組織移植的臨床效能方面具有巨大的潛力，這些策略不僅需要有效減輕免疫排斥，還應(yīng)提高長期移植物存活率，從而為患者提供更安全的治療結(jié)果，拓寬移植治療的視野。

2、近年來，外泌體作為免疫調(diào)節(jié)的有力候選者而受到關(guān)注。外泌體是由細胞釋放的納米級囊泡，攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物活性分子，促進免疫系統(tǒng)內(nèi)的細胞間信號傳遞。實際上，特定亞群的外泌體已被證實可以調(diào)節(jié)免疫細胞功能、細胞因子動態(tài)和免疫應(yīng)答，并在多種免疫相關(guān)病理條件下展示了其治療潛力。外泌體的免疫調(diào)節(jié)屬性根據(jù)其細胞來源和應(yīng)用情況顯示出依賴環(huán)境的變異性。外泌體的免疫調(diào)節(jié)活性已在角膜移植管理中得到研究。例如，源自人類誘導(dǎo)多能干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、人脂肪組織和臍帶血干細胞的外泌體顯示出對抗角膜移植排斥的潛力。

3、然而，高昂的成本限制了其廣泛應(yīng)用。盡管來自mdscs和樹突狀細胞(dcs)等其他免疫細胞的外泌體也表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，其作用傾向于促進免疫應(yīng)答或支持組織修復(fù)，而非直接的免疫抑制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種黑色素瘤來源的外泌體在防治角膜移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用，使用來自b16-f10黑色素瘤細胞的外泌體(b16-exo)作為例證，闡明腫瘤細胞外泌體在減輕移植免疫排斥中的治療潛力，采用小鼠角膜移植作為模型系統(tǒng)，證實了b16-exo在移植排斥后的免疫抑制效果，并伴隨著術(shù)后生存率的提高。角膜獨特的透明性和無血管性使其成為研究免疫排斥、新生血管形成及其調(diào)節(jié)過程的理想實驗平臺。

2、為達到上述目的，本方案首先提供了黑色素瘤來源的外泌體在防治角膜移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用。

3、作為優(yōu)選，所述黑色素瘤來源的外泌體的制備方法為：從黑色素瘤細胞系b16-f10培養(yǎng)上清中分離外泌體，細胞在dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，補充10％去除外泌體的胎牛血清，青霉素和鏈霉素，收集的上清先后經(jīng)過2000xg，10000xg離心，過濾，依次去除大囊泡、較小的凋亡體和微囊泡，然后在4℃下用100,000xg超速離心兩次，得到外泌體。

4、作為優(yōu)選，所述先后經(jīng)過2000xg，10000x?g離心的時間分別為10min，60min。

5、作為優(yōu)選，所述100,000xg超速離心的時間為90min?1次，共兩次。

6、作為優(yōu)選，所述黑色素瘤來源的外泌體在藥物中的有效劑量為1μg。

7、作為優(yōu)選，所述藥物的劑型包括注射液。

8、b16-exo在防治角膜移植免疫排斥藥物中的機理為：

9、如圖1所示，b16-exo在角膜微環(huán)境中的持續(xù)存在超過6天，并伴隨顯著的角膜混濁、新生血管和免疫浸潤減少，蛋白質(zhì)組分析和機制闡釋展示了b16-exo的免疫調(diào)節(jié)屬性，通過jak2蛋白成分介導(dǎo)，調(diào)節(jié)jak-stat信號軸，增強髓系來源抑制細胞(mdscs)的增殖和免疫抑制能力，同時有效地調(diào)節(jié)t細胞的增殖動態(tài)，b16-exo的免疫調(diào)節(jié)特性包括減輕角膜混濁、新生血管生成和免疫浸潤，并改善了術(shù)后存活率；體外和體內(nèi)實驗均揭示了jak-stat信號通路在抑制b16-exo介導(dǎo)的角膜移植排斥中的關(guān)鍵作用。

10、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

11、(1)本方案首次發(fā)現(xiàn)了b16-exo在抑制角膜移植免疫排斥中具有治療效果，為器官移植管理中免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供了新的策略。

12、(2)腫瘤源外泌體模仿并應(yīng)用腫瘤免疫調(diào)節(jié)機制于眼部微環(huán)境中，從而有效抑制免疫反應(yīng)，這種開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)為利用腫瘤細胞來源的外泌體管理眼部移植排斥奠定了基礎(chǔ)。

13、(3)b16-exo顯現(xiàn)為一種有前景的治療劑，能夠保持角膜透明度，調(diào)節(jié)局部免疥，延長異體角膜移植的存活期，凸顯其在移植醫(yī)學(xué)中的潛在應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種黑色素瘤來源的外泌體在防治角膜移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述黑色素瘤來源的外泌體的制備方法為：從黑色素瘤細胞系b16-f10培養(yǎng)上清中分離外泌體，細胞在dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，補充10％去除外泌體的胎牛血清，青霉素和鏈霉素，收集的上清先后經(jīng)過2000xg，10000xg離心，過濾，依次去除大囊泡、較小的凋亡體和微囊泡，然后在4℃下用100,000xg超速離心兩次，得到外泌體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述先后經(jīng)過2000xg，10000xg離心的時間分別為10min，60min。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述100,000xg超速離心的時間為90min?1次，共兩次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述黑色素瘤來源的外泌體在藥物中的有效劑量為1μg。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的劑型包括注射液。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種黑色素瘤來源的外泌體在防治角膜移植免疫排斥藥物中的應(yīng)用，屬于眼科生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，采用小鼠角膜移植模型，發(fā)現(xiàn)B16?Exo能抑制免疫排斥，表現(xiàn)為角膜混濁、新生血管形成和免疫失調(diào)的減輕，以及術(shù)后生存率的提高。蛋白質(zhì)組分析揭示了B16?Exo中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的差異表達，特別是在JAK?STAT信號通路中的JAK2蛋白，進一步的機制研究闡明了其在增強髓系來源抑制細胞活性和抑制T細胞增殖中的作用，這些發(fā)現(xiàn)證實了B16?Exo在移植免疫學(xué)中顯著的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，并為進一步探索腫瘤細胞外泌體作為管理器官移植中免疫排斥的有效治療劑提供了依據(jù)。

技術(shù)研發(fā)人員：周文虎,楊捷茹,何彥,康煥敏,劉穎怡
受保護的技術(shù)使用者：中南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10