本發(fā)明涉及鼓膜修復生物材料，具體涉及一種負載外泌體的pla生物修復材料及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、鼓膜位于中耳和外耳道之間，是一層薄而柔韌的膜，其厚度小于100μm。組織學上，鼓膜由3層結(jié)構(gòu)組成，外層為上皮層，由角質(zhì)形成細胞組成；內(nèi)層為黏膜層，由非角化黏膜上皮組成；中間層為彈力纖維層，由外呈放射狀、內(nèi)呈環(huán)形的膠原蛋白組成，膠原蛋白的這種特殊排列方式賦予了鼓膜聽力傳導的能力。掌擊、碰撞、炮震、爆炸、異物刺入、外耳道沖洗和熾熱異物濺入等原因均會造成鼓膜穿孔，該病為耳鼻喉科常見疾病。患者常表現(xiàn)為聽力下降等不適，嚴重者甚至會影響其生活、學習和工作。

2、一般情況下鼓膜穿孔能自然愈合，患者如果3個月后仍不能夠自然愈合，需要進一步手術(shù)治療，以防止發(fā)生中耳感染、膽脂瘤等并發(fā)癥。其治療目前包括鼓膜貼片修補、局部涂藥及鼓膜成形術(shù)等。目前，傳統(tǒng)手術(shù)主要采用自體顳肌筋膜、軟骨膜等作為修補材料，雖然鼓膜愈合率較高，但仍存在許多缺陷，如供體部位術(shù)后出現(xiàn)疼痛及手術(shù)瘢痕、手術(shù)時間過長增加麻醉風險，且選取自體材料就需二次切口，這無形中就增加了取材部位感染的機會并增加了修補失敗的幾乎，因此，我們急需尋找無切口、安全性高且價格適中的新型非自體材料進行替代修復。

3、組織工程材料的出現(xiàn)可以有效避免上述問題，組織工程材料是組織再生的支架與模板，是由在組織中具有誘導組織再生、調(diào)節(jié)細胞生長和功能分化的聚合物材料。近年來出現(xiàn)許多新穎的鼓膜修補材料，包括貼片、3d打印支架等，鼓膜穿孔修復主要是靠上皮細胞的擴增和遷移，鼓膜修補材料充當支架的作用，即誘導穿孔邊緣的細胞向中央生長修補穿孔。目前雖有多種修補材料可供選擇，但大多材料只能提供機械支撐作用，缺乏促進血管生成或細胞增殖的作用，會導致新生血管生成能力弱，和生長因子分泌不足，再加上細胞外基質(zhì)的缺乏會造成細胞對新膜黏附力減弱，進一步影響鼓膜修復的效果。因此，選擇合適的支架材料與生物活性物質(zhì)相結(jié)合的修補材料也成為近年來新的研究方向。本發(fā)明旨在提供一種具有良好生物相容性、無排異反應(yīng)，與鼓膜相似的生物力學結(jié)構(gòu)和震動特性的新型生物鼓膜修復材料。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種負載外泌體的pla生物修復材料及其制備方法。所述生物修復材料以pla生物膜為支撐支架材料，并負載有可促進細胞增殖遷移的干細胞外泌體制備得到。

3、(二)技術(shù)方案

4、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

5、首先本發(fā)明提供了一種負載外泌體的pla生物修復材料，所述生物修復材料是以pla為支撐支架材料，并負載有可促進細胞增殖遷移的干細胞外泌體制備得到。

6、本發(fā)明還提供了一種負載外泌體的pla生物修復材料的制備方法，所述生物修復材料按照以下步驟制備：

7、(1)制備外泌體

8、將捐贈的脂肪干細胞(adscs)(sigma)培養(yǎng)至p3代，待細胞傳代并貼壁后使用不含血清的干細胞專用培養(yǎng)基(corning中國)替換完全培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細胞培養(yǎng)基并更換新鮮的無血清干細胞培養(yǎng)基；細胞培養(yǎng)基通過離心和過濾進行外泌體的收集；

9、具體地，細胞培養(yǎng)基通過離心和收集外泌體按照以下步驟：使用超速離心機在4℃下以300xg沉淀10min，然后以2000xg沉淀30min，以去除死細胞；剩余的純化培養(yǎng)基以10000xg離心30min，并通過0.22μm過濾器過濾上清液，以去除多余的蛋白質(zhì)；接著，將上清液以100000xg離心70min，使用pbs洗滌沉淀，并將溶液轉(zhuǎn)移至新管內(nèi)再次100000xg離心70min，即可得到外泌體，備用；

10、(2)制備紡絲液

11、將pla在二氯甲烷中溶解，制備成含有質(zhì)量分數(shù)為2％的pla紡絲液；

12、(3)制備pla生物膜

13、將步驟(2)得到的pla紡絲液通過靜電紡絲法獲得pla生物膜；靜電紡絲打印時，使用自制支架收集器，針與自制支架收集器之間的距離為15cm，電紡液擠出速度為1ml/h，針與自制支架收集器之間的電壓為18kv，收集時間為2h；pla膜沉積在自制支架收集器上，隨后得到pla生物膜，并用紫外線殺毒滅菌3h后，之后用pbs溶液清洗3遍以上，隨后干燥并剪成橢圓形的pla生物膜備用；

14、(4)制備exo-pla生物修復材料

15、取甲基丙烯酸明膠(gelma)配置成質(zhì)量分數(shù)為1-5％的水溶液，得到gelma水凝膠溶液，隨后加入步驟(1)制備得到的外泌體，與gelma水凝膠溶液充分混合，得到含有外泌體的gelma水凝膠溶液；將上述水凝膠溶液添加到有pla生物膜的模具中，并用紫外光照射進行光固化成膠，即得exo-pla生物修復材料。

16、其中，gelma水凝膠溶液中含有0.1-0.5％的光引發(fā)劑；

17、其中，外泌體在gelma水凝膠溶液中濃度為200μg/ml-500ug/ml；優(yōu)選地，外泌體在在gelma水凝膠溶液中濃度為350ug/ml。

18、(三)有益效果

19、本發(fā)明以靜電紡絲技術(shù)先制備pla生物膜，并負載了具有促進細胞增殖和遷移的間充干細胞來源的外泌體，最終得到exo-pla生物修復膜材料。本發(fā)明制備的exo-pla生物修復膜材料具有較高孔徑結(jié)構(gòu)和較好機械強度，能夠為細胞的附著、生長和增殖提供較大的表面積和較高的強度；同時具備優(yōu)異的生物相容性，且能夠增加細胞活性，對細胞增殖具有促進作用。

20、本發(fā)明exo-pla生物修復膜材料在治療鼓膜穿孔大鼠14天后就能實現(xiàn)將穿孔尺寸減少81.27％的治療效果，要遠遠高于睿膜的孔尺寸減少18.73％；在治療鼓膜穿孔大鼠28天后，能夠?qū)崿F(xiàn)將穿孔尺寸減少97.46％的治療效果，可實現(xiàn)對鼓膜穿孔大鼠的完全治愈效果。

21、本發(fā)明exo-pla生物修復膜材料能夠加快鼓膜愈合的時間，提高鼓膜愈合效率，相比睿膜具有顯著的治療優(yōu)勢。

技術(shù)特征：

1.一種負載外泌體的pla生物修復材料，其特征在于，所述生物修復材料以pla生物膜為支撐支架材料，并負載有可促進細胞增殖遷移的干細胞外泌體制備得到。

2.如權(quán)利要求1所述的一種負載外泌體的pla生物修復材料的制備方法，其特征在于，所述生物修復材料按照以下步驟制備：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種負載外泌體的pla生物修復材料的制備方法，其特征在于，gelma水凝膠溶液中含有0.1-0.5％的光引發(fā)劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種負載外泌體的pla生物修復材料的制備方法，其特征在于，外泌體在gelma水凝膠溶液中濃度為200μg/ml-500ug/ml。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種負載外泌體的pla生物修復材料的制備方法，其特征在于，外泌體在在gelma水凝膠溶液中濃度為350ug/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種負載外泌體的PLA生物修復膜材料及其制備方法，涉及鼓膜修復生物材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以靜電紡絲技術(shù)先制備PLA生物膜，并負載了具有促進細胞增殖和遷移的間充干細胞來源的外泌體，最終得到Exo?PLA生物修復膜材料。本發(fā)明生物修復膜材料具有較高孔徑結(jié)構(gòu)和較好機械強度，能夠為細胞的附著、生長和增殖提供較大的表面積和較高的強度；同時具備優(yōu)異的生物相容性，且能夠增加細胞活性，對細胞增殖具有促進作用。本發(fā)明Exo?PLA生物修復膜材料能夠加快鼓膜愈合的時間，提高鼓膜愈合效率，具有顯著的治療優(yōu)勢。

技術(shù)研發(fā)人員：胡浩磊,李誼,楊杰,邢培梅,張素娜,麻文來,岳瑋,關(guān)泰紅
受保護的技術(shù)使用者：中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10