本發(fā)明屬于類風濕關(guān)節(jié)炎分子生物學領(lǐng)域，具體是一種長鏈非編碼rna的甲基化修飾在治療類風濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,ra)是一種慢性、炎癥性、進展性、自身免疫性疾病，發(fā)病率高、致殘率高，累及多系統(tǒng)病變，病程纏綿難愈，患者生活質(zhì)量降低。ra全球發(fā)病率約為0.3％-1％，女性發(fā)病率高于男性，男女發(fā)病比約為1：3，其確切發(fā)病機制目前尚不完全清楚，臨床上尚缺乏特效療法。因此，探究ra的發(fā)病機制和新的潛在治療靶點，尋找ra有效藥物，具有重大的實用價值和較高的社會效益。

2、長鏈非編碼rna(longnon-codingrna,lncrna)一類長度超過200nt，且不編碼蛋白的rna，能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達，參與包括ra在內(nèi)的多種疾病的增殖、凋亡及氧化應(yīng)激等多個生物學過程。6-甲基腺嘌呤(n6-methyladenosine，m6a)修飾是指發(fā)生在堿基a第六位n原子上，是真核生物mrna和lncrna最常見的修飾之一，通過促進前體rna剪切、mrna?翻譯和增強rna穩(wěn)定性等途徑，參與ra發(fā)病，是目前rna表觀遺傳學中的研究熱點與難點，受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。肥胖相關(guān)蛋白(fto)作為m6a修飾主要的去甲基化酶，定位于細胞核，可與多種類型的rna結(jié)合并將其去甲基化，如mrna、snrna和trna等，當fto發(fā)揮去甲基化作用時，m6a修飾的原始位點不能被m6a結(jié)合蛋白識別，從而影響rna的剪接、成熟、翻譯或降解。

3、滑膜組織異常增生及炎性細胞浸潤是ra重要病理特征。成纖維樣滑膜細胞(fls)是滑膜組織重要構(gòu)成部分，是ra發(fā)病的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，具有類似于腫瘤細胞樣侵襲作用，細胞凋亡逃逸是ra發(fā)病的重要誘因，fls還能分泌大量炎癥細胞因子，破壞ra骨質(zhì)，最終導致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙。因此，探究與ra炎癥或凋亡相關(guān)的lncrna的甲基化修飾對于解釋ra的發(fā)病機制具有很大的臨床應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過實驗研究獲得lncrna即lncrnaenst00000619282的甲基化修飾的轉(zhuǎn)移酶fto，確定enst00000619282m6a修飾與細胞凋亡有關(guān)，并且通過實驗研究技術(shù)發(fā)現(xiàn)該lncrna結(jié)合蛋白有潛力成為促進ra細胞凋亡的新靶點。

2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

3、首先，本發(fā)明提出了一種長鏈非編碼rna的甲基化修飾在治療類風濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用，其中，所述長鏈非編碼rna為lncrna?enst00000619282。

4、其次，本發(fā)明還提出了一種該長鏈非編碼rna的甲基化修飾在制備治療類風濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。具體為，這種長鏈非編碼rna的甲基化修飾能夠應(yīng)用在制備治療與ra細胞凋亡的藥物，這種lncrna?enst00000619282能夠在去甲基化轉(zhuǎn)移酶fto的修飾下，與目的蛋白puf60結(jié)合，從而抑制細胞凋亡。

5、具體而言，本發(fā)明首先通過sramp(http://www.cuilab.cn/sramp)預(yù)測得到enst00000619282有2個甲基化修飾位點；通過比色法檢測出ra外周血單個核細胞(pbmcs)與fls共培養(yǎng)細胞(簡稱共培養(yǎng)細胞)中m6a水平降低；rt-qpcr檢測得出fto、enst00000619282在共培養(yǎng)細胞中的rna表達升高；wb檢測得出fto在共培養(yǎng)中的蛋白表達升高；干擾fto后，enst00000619282表達降低；merip-qpcr檢測得出enst00000619282m6a在共培養(yǎng)細胞中表達降低。同時，通過放射菌素d實驗沉默fto后lncrnaenst00000619282mrna的半衰期縮短，穩(wěn)定性下降，過表達fto后lncrnaenst00000619282具有更強的穩(wěn)定性。干擾enst00000619282，促凋亡蛋白bax表達下降、抑凋亡蛋白bcl-2表達升高；過表達enst00000619282，促凋亡蛋白bax表達升高、抑凋亡蛋白bcl-2表達下降。另外，本發(fā)明還通過rnapull?down實驗技術(shù)確定puf60為lncrnaenst00000619282的下游靶基因。

6、另外，本發(fā)明還在臨床中驗證了enst00000619282在ra患者中表達升高，通過相關(guān)性分析表明fto與enst00000619282呈正相關(guān)關(guān)系，院內(nèi)制劑中藥復(fù)方新風膠囊(xfc)干預(yù)后，enst00000619282表達下降。

7、因此，本發(fā)明研究提示lncrna?enst00000619282甲基化參與ra細胞凋亡的發(fā)病機制，有潛力成為促進ra細胞凋亡的新靶點。

技術(shù)特征：

1.一種長鏈非編碼rna的甲基化修飾在治療類風濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用，其特征在于，所述長鏈非編碼rna為lncrna?enst00000619282。

2.一種長鏈非編碼rna的甲基化修飾在制備治療類風濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述長鏈非編碼rna為lncrna?enst00000619282。

3.一種長鏈非編碼rna的甲基化修飾在制備治療與類風濕關(guān)節(jié)炎細胞凋亡的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述長鏈非編碼rna為lncrna?enst00000619282。

4.如權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述lncrna?enst00000619282在去甲基化轉(zhuǎn)移酶fto的修飾下，與目的蛋白puf60結(jié)合，抑制細胞凋亡。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種長鏈非編碼RNA的甲基化修飾在治療類風濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。該長鏈非編碼lncRNA?ENST00000619282在去甲基化轉(zhuǎn)移酶FTO的修飾下，與目的蛋白PUF60結(jié)合，抑制細胞凋亡。本發(fā)明在全轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的lncRNA?ENST00000619282的基礎(chǔ)上，證明了lncRNA?ENST00000619282與去甲基化轉(zhuǎn)移酶FTO結(jié)合發(fā)揮RNA的甲基化修飾，作用于靶基因PUF60，抑制RA細胞凋亡，從而證實可用于制備治療與RA細胞凋亡的藥物。

技術(shù)研發(fā)人員：劉健,文建庭,諶曦,萬磊,曹云祥,縱瑞凱,范海霞
受保護的技術(shù)使用者：安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（安徽省中醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10