本發(fā)明涉及基因測(cè)序分析，特別涉及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法。

背景技術(shù)：

1、在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐中，單細(xì)胞分析技術(shù)在揭示細(xì)胞異質(zhì)性，解析復(fù)雜生物過(guò)程及疾病發(fā)病機(jī)制中正在發(fā)揮越來(lái)越關(guān)鍵的作用。傳統(tǒng)的群體級(jí)分析方法掩蓋了細(xì)胞間的細(xì)微差異，這些差異對(duì)于理解疾病發(fā)展、細(xì)胞決策過(guò)程以及對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)至關(guān)重要。單細(xì)胞rna測(cè)序(scrna-seq)技術(shù)已經(jīng)極大地推動(dòng)了從單一細(xì)胞分辨成千上萬(wàn)個(gè)rna分子的檢測(cè)和量化，為深入探索生物系統(tǒng)的內(nèi)部機(jī)制提供了獨(dú)特視角。

2、盡管scrna-seq技術(shù)取得了顯著進(jìn)展，但在捕獲和分析全長(zhǎng)rna分子方面的局限性，削弱了從單細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)錄本完整信息，限制了對(duì)轉(zhuǎn)錄后修飾、可變剪接事件及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的全面理解。

3、在此背景下，oxford?nanopore?technologies(ont)的單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它通過(guò)直接測(cè)序單個(gè)細(xì)胞中的全長(zhǎng)rna分子，提供了前所未有的轉(zhuǎn)錄本完整視角。這一技術(shù)不僅揭示了5’和3’末端、編碼區(qū)、內(nèi)含子和可變剪接事件，而且極大地拓寬了對(duì)單細(xì)胞基因表達(dá)復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)，為生物學(xué)研究和臨床診斷提供了新的路徑。

4、然而，ont單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在樣本制備、數(shù)據(jù)處理和成本效益方面面臨著挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)涉及保持rna分子的完整性、提升測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和降低操作成本。因此，針對(duì)這些挑戰(zhàn)開(kāi)發(fā)新的優(yōu)化方法，對(duì)擴(kuò)大ont單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)在科研和診斷中的應(yīng)用具有至關(guān)重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，本方法利用10×genomics單細(xì)胞捕獲、標(biāo)記技術(shù)和ont測(cè)序技術(shù)，能夠更準(zhǔn)確、更全面地分析細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本和基因，深入挖掘生命過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄信息，從而為生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域提供更多有價(jià)值的數(shù)據(jù)和應(yīng)用。本發(fā)明提供的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法具體通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

2、一種基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，包括以下步驟：

3、制備、構(gòu)建待測(cè)樣品的cdna文庫(kù)，測(cè)序，獲得所述待測(cè)樣品的三代原始數(shù)據(jù)；對(duì)所述三代原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，得到所述待測(cè)樣品的三代有效數(shù)據(jù)；

4、對(duì)參考基因組的基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋；

5、結(jié)合所述三代有效數(shù)據(jù)和所述參考基因組的基因數(shù)據(jù)，使用軟件ont-sc-pipeline進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾、數(shù)據(jù)拆分、比對(duì)和定量，得到定量數(shù)據(jù)；

6、對(duì)所述定量數(shù)據(jù)進(jìn)行雙細(xì)胞識(shí)別和去除，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步的過(guò)濾；

7、對(duì)過(guò)濾后的數(shù)據(jù)依次進(jìn)行基礎(chǔ)分析、marker基因富集分析和高級(jí)分析；所述基礎(chǔ)分析包括top基因分布分析、高變基因分析、聚類分群分析、各細(xì)胞類群的相關(guān)性分析、降維分析和marker基因識(shí)別；所述高級(jí)分析包括細(xì)胞注釋分析、細(xì)胞通訊分析、細(xì)胞軌跡分析、可變剪切分析和融合基因分析。

8、進(jìn)一步地，所述質(zhì)控處理的方法為：根據(jù)測(cè)序質(zhì)量值進(jìn)行篩選，剔除長(zhǎng)度≤30bp和質(zhì)量值≤5的序列。

9、進(jìn)一步地，利用軟件ont-sc-pipeline進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分、比對(duì)和定量的方法為：使用vsearch進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分，同時(shí)使用minimap2進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，提取拆分結(jié)果和比對(duì)結(jié)果二者信息合并得到所述定量數(shù)據(jù)。

10、進(jìn)一步地，使用scdblfinder軟件識(shí)別和去除雙細(xì)胞和低活性細(xì)胞，并剔除核糖體rna比例較高、線粒體基因比例較高的細(xì)胞。

11、進(jìn)一步地，使用seuratv5軟件進(jìn)行top基因分布分析；采用函數(shù)findvariablefeatures進(jìn)行高變基因分析；使用seuratv5軟件進(jìn)行聚類分群分析、降維分析和marker基因識(shí)別。

12、更進(jìn)一步地，所述降維分析具體采用seuratv5軟件中的pca、t-sne、umap分析方法中的至少一種進(jìn)行。

13、具體地，若待測(cè)樣本為多樣本，則使用harmony軟件代替原本的pca分析方法，對(duì)過(guò)濾后的多樣本單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和整合。

14、進(jìn)一步地，采用超幾何分布算法進(jìn)行marker基因的富集分析。

15、進(jìn)一步地，結(jié)合已知marker基因和scina軟件進(jìn)行細(xì)胞注釋分析。

16、進(jìn)一步地，采用cellphonedb?v5進(jìn)行細(xì)胞通訊分析。

17、進(jìn)一步地，使用軟件monocle3進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析。

18、進(jìn)一步地，采用isoswitch軟件進(jìn)行可變剪切分析。

19、進(jìn)一步地，采用軟件jaffa進(jìn)行融合基因分析。

20、進(jìn)一步地，使用monocle3軟件進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析。

21、進(jìn)一步地，使用isoswitch軟件進(jìn)行可變剪切分析。

22、進(jìn)一步地，使用jaffa軟件進(jìn)行融合基因分析。

23、進(jìn)一步地，基于cellphonedb?v5結(jié)果，利用ggplot2和igraph方法對(duì)單通路在各個(gè)細(xì)胞亞群之間的通訊結(jié)果進(jìn)行可視化；將各亞基對(duì)配受體整體的貢獻(xiàn)度和通路中單個(gè)配受體對(duì)的亞基進(jìn)行可視化。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于：

25、1、ont測(cè)序相比于二代測(cè)序手段，無(wú)需對(duì)片段進(jìn)行打斷，能夠測(cè)到完整的轉(zhuǎn)錄本，能夠?qū)D(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。

26、2、相對(duì)于現(xiàn)有的pacbio三代測(cè)序而言更具有成本優(yōu)勢(shì)，在兼顧測(cè)序多種結(jié)果的同時(shí)具有極高的性價(jià)比。

技術(shù)特征：

1.一種基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，所述質(zhì)控處理的方法為：根據(jù)測(cè)序質(zhì)量值進(jìn)行篩選，剔除長(zhǎng)度≤30bp和質(zhì)量值≤5的序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，利用軟件ont-sc-pipeline進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分、比對(duì)和定量的方法為：使用vsearch進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分，同時(shí)使用minimap2進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，提取拆分結(jié)果和比對(duì)結(jié)果二者信息合并得到所述定量數(shù)據(jù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，使用scdblfinder軟件識(shí)別和去除雙細(xì)胞和低活性細(xì)胞，并剔除核糖體rna比例較高、線粒體基因比例較高的細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，使用seuratv5軟件進(jìn)行top基因分布分析；采用函數(shù)findvariablefeatures進(jìn)行高變基因分析；使用seuratv5軟件進(jìn)行聚類分群分析、降維分析和marker基因識(shí)別。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，所述降維分析具體采用seuratv5軟件中的pca、t-sne、umap分析方法中的至少一種進(jìn)行。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，若待測(cè)樣本為多樣本，則使用harmony軟件代替所述pca分析方法，對(duì)過(guò)濾后的多樣本單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和整合。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，采用超幾何分布算法進(jìn)行marker基因的富集分析。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，結(jié)合已知marker基因和scina軟件進(jìn)行細(xì)胞注釋分析；采用cellphonedb?v5進(jìn)行細(xì)胞通訊分析；使用軟件monocle3進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析；采用isoswitch軟件進(jìn)行可變剪切分析；采用軟件jaffa進(jìn)行融合基因分析；使用monocle3軟件進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析；使用isoswitch軟件進(jìn)行可變剪切分析；使用jaffa軟件進(jìn)行融合基因分析。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基于ont測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，其特征在于，基于cellphonedb?v5結(jié)果，利用ggplot2和igraph方法對(duì)單通路在各個(gè)細(xì)胞亞群之間的通訊結(jié)果進(jìn)行可視化；將各亞基對(duì)配受體整體的貢獻(xiàn)度和通路中單個(gè)配受體對(duì)的亞基進(jìn)行可視化。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于ONT測(cè)序的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析方法，涉及基因測(cè)序分析技術(shù)領(lǐng)域。本方法包括以下步驟：制備、構(gòu)建待測(cè)樣品的cDNA文庫(kù)，測(cè)序，獲得三代原始數(shù)據(jù)；對(duì)三代原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，得到三代有效數(shù)據(jù)；對(duì)參考基因組進(jìn)行功能注釋；使用軟件ONT?SC?pipeline進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分、比對(duì)和定量，得到定量數(shù)據(jù)；對(duì)定量數(shù)據(jù)依次進(jìn)行基礎(chǔ)分析、Marker基因富集分析和高級(jí)分析；基礎(chǔ)分析包括top基因分布分析、高變基因分析、聚類分群分析、各細(xì)胞類群的相關(guān)性分析、降維分析和Marker基因識(shí)別；高級(jí)分析包括細(xì)胞注釋分析、細(xì)胞通訊分析、細(xì)胞軌跡分析可變剪切分析和融合基因分析。

技術(shù)研發(fā)人員：冀金龍,田朝陽(yáng),宋馳,陳虎,楊路路,易欣欣
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢貝納科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10