專利名稱:一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
細菌性病害是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的一類主要疾病，每年給世界各國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，如何有效的防治細菌性病害是水產(chǎn)病害研究者急待解決的課題。受人體和家畜(禽)免疫防治的啟示，人們將水產(chǎn)養(yǎng)殖的動物的某些病原菌用化學(xué)或物理的方法進行滅活或者減毒，制成疫苗后接種到動物體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)疫苗同樣可以刺激水產(chǎn)養(yǎng)殖動物(魚、鱉等)產(chǎn)生免疫保護力，防止某些病原對水產(chǎn)動物的感染，最終達到防治的目的。迄今為止，人們在制作細菌疫苗時采用多種滅活方法，包括使用福爾馬林、苯酚、氯仿等試劑進行化學(xué)滅活和經(jīng)加熱、紫外線照射等進行物理滅活，但是使用化學(xué)藥劑不僅存在藥物污染和殘留，而且會破壞保護性抗原的分子結(jié)構(gòu)，降低疫苗的免疫原性，從而影響使用效果。而加熱，紫外線處理方法存在耗能大，并且也存在對保護性抗原的破壞等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的不足，提供一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌疫苗制備方法，以減少由于化學(xué)藥物處理、加熱或紫外照射引起的疫苗免疫原性降低的缺點，提高疫苗的免疫保護率。
本發(fā)明是通過滲透壓和外部高壓相結(jié)合將疫苗菌進行滅活制備水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性疫苗的方法。將發(fā)酵培養(yǎng)的疫苗菌液經(jīng)離心處理除去培養(yǎng)液加入5-20倍菌體體積的0.85％的生量鹽水洗滌沉淀，除去上清液后用高濃度鹽溶液洗滌沉淀，混均后放入菌塑料袋置于靜水壓儀中加壓處理，處理后取出菌液，再進行一次離心、去鹽和高靜水壓處量，取出后包裝或經(jīng)真空凍干成粉劑再經(jīng)包裝而成，本方法涉及多種病原細菌，可廣泛應(yīng)用于魚類或海豚等水生動物，方法簡便，經(jīng)濟實用，便于推廣。
制備的疫苗可通過注射、口服、浸泡和噴霧等各種途徑對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物進行免疫。
本發(fā)明的具體方法是將發(fā)酵培養(yǎng)的疫苗用菌液經(jīng)離心，除去培養(yǎng)液后加入5～20倍菌體體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮洗滌沉淀；再經(jīng)離心，除去上清液，加入5～20倍菌體體積的5～10％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質(zhì)的容器中，容器的容量以300～1000ml為宜，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中高壓處理，處理后取出菌液再經(jīng)離心。而后用5～20倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質(zhì)的容器中，排凈空氣，再放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中進行高壓處理。處理完畢后取出，可直接包裝以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫治療或經(jīng)真空凍干成粉劑再經(jīng)包裝，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫防治。上述離心的工藝取離心力為3000～7000rpm，離心時間為15～30min；靜水壓處理取壓力100MP～250MP，處理時間為30～60min。
具體實施方式
下面以一個最佳實施例，即海水魚類弧菌疫苗的制備進一步說明本發(fā)明。
取海水養(yǎng)殖的鱸魚、牙鲆的病原菌鰻弧菌和哈維氏弧菌發(fā)酵液，5000rpm離心30min，收集活菌體，加入10倍體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮混勻沉淀，再經(jīng)5000rpm離心，30min，除去上清液，加入10倍菌體體積的8％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質(zhì)的容器中，容器的容量以650ml為宜，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，操作壓力為225MP，處理時間為45min。處理后取出菌液經(jīng)5000rpm離心30min，之后用10倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如入無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質(zhì)的容器中，排凈空氣，放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，壓力200MP，處理時間為60min，制成相應(yīng)的疫苗。應(yīng)用時只要將滅活處理的菌液對30克左右的鱸魚和牙鲆魚進行腹腔注射107～108CFU劑量，免疫50天后檢測免疫魚血清的相應(yīng)抗體效價，其中對鰻弧菌的免疫效價達27～28。對哈維氏弧菌的免疫效價可達26～27。在免疫后60天對免疫后的魚用鰻弧菌和哈維氏弧菌攻毒，免疫保護率在70％～93％之間。
該發(fā)明應(yīng)用于除蝦、貝類以外的高等水生動物如，魚、龜鱉類以及海豚、海豹等大哺乳類動物，由于該方法是通過對活菌體進行高滲和高壓處理相結(jié)合滅活的環(huán)保高效的疫苗制備方法，涉及水生動物的多種病原菌，如多種病原弧菌、氣單胞菌、愛德華氏菌、耶爾森菌、發(fā)光桿菌、巴斯德菌、屈撓桿菌和鏈球菌等，適用范圍廣，因此本發(fā)明是應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌性病害疫苗制備的一種經(jīng)濟實用的優(yōu)良方法，便于推廣使用，
權(quán)利要求
1.一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌疫苗制備方法，將發(fā)酵培養(yǎng)的疫苗用菌液經(jīng)離心，除去培養(yǎng)液后加入5～20倍菌體體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮洗滌沉淀；再經(jīng)離心，除去上清液，加入5～20倍菌體體積的5～10％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質(zhì)的容器中，容器的容量以300～1000ml為宜，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中高壓處理，處理后取出菌液再經(jīng)離心，而后用5～20倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質(zhì)的容器中，排凈空氣，再放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中進行高壓處理，處理完畢后取出，可直接包裝以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫治療或經(jīng)真空凍干成粉劑再經(jīng)包裝而成，上述離心的工藝取離心力為3000～7000rpm，離心時間為15～30min，靜水壓處理取壓力100MP～250MP，處理時間為30～60min。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是取海水養(yǎng)殖的鱸魚、牙鲆的病原菌鰻弧菌和哈維氏弧菌發(fā)酵液，5000rpm離心30min，收集活菌體，加入10倍體積的0.85％的NaCl生理鹽水懸浮混勻沉淀，再經(jīng)5000rpm離心，30min，除去上清液，加入10倍菌體體積的8％的NaCl水溶液沖洗沉淀，混勻后放置于無菌的高強度的塑料袋或帶蓋密封性好的軟質(zhì)的容器中，排凈里面的空氣，將其放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，操作壓力為225MP，處理時間為45min，處理后取出菌液經(jīng)5000rpm離心30min，之后用10倍體積蒸餾水懸浮沖洗混勻菌體，再將菌液倒如入無菌的高強度的塑料袋排凈空氣，放入中小型靜水壓儀的超高壓腔中，壓力200MP，處理時間為60min，制成相應(yīng)的疫苗。
專利摘要
一種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌疫苗制備方法，將發(fā)酵培養(yǎng)的疫苗菌液經(jīng)離心處理除去培養(yǎng)液加入5-20倍菌體體積的0.85%的生量鹽水洗滌沉淀，除去上清液再用高鹽溶液洗滌沉淀，混均后放入菌塑料袋置于靜水壓儀中加壓處理，處理后取出菌液再時行一次離心去鹽和靜壓處量，取出后包裝或經(jīng)真空凍干成粉劑再經(jīng)包裝而成，涉及多種病原細菌，可廣泛應(yīng)用于魚或海豚等哺乳動物，方法簡便，經(jīng)濟實用，便于推廣。
文檔編號A61P31/00GKCN1160124SQ02110261
公開日2004年8月4日 申請日期2002年4月9日
發(fā)明者陳剛, 包振民, 陳 剛 申請人:青島海洋大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan