專利名稱:T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域中ー種抑制劑，特別涉及ー種T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑。
背景技術(shù)：
機(jī)體的免疫系統(tǒng)始終處在ー種復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程中。免疫調(diào)節(jié)是指免疫應(yīng)答過程中免疫系統(tǒng)內(nèi)部各細(xì)胞之間、免疫細(xì)胞與免疫分子之間以及免疫系統(tǒng)與其他系統(tǒng)之間的相互作用，構(gòu)成ー個(gè)相互協(xié)調(diào)、相互制約的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使免疫應(yīng)答維持合適的強(qiáng)度，從而保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在外來病原物入侵后，免疫系統(tǒng)可以根據(jù)病原物的特點(diǎn)激活需要的免疫反應(yīng)來抵御和清除病原物。免疫反應(yīng)又分為體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。其中體液免疫反應(yīng)是產(chǎn)生特異性抗體的反應(yīng)，而細(xì)胞免疫反應(yīng)是激活T細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)。提高機(jī)體 免疫カ的最主要的手段是接種疫苗。目前已有多種方法用來生產(chǎn)抗傳染性病原體的疫苗，如滅活疫苗，減毒活疫苗、重組疫苗，亞單位疫苗和DNA疫苗等，它們的基本作用原理是相同的，即借助病原體的抗原物質(zhì)在體內(nèi)被免疫細(xì)胞識(shí)別而激發(fā)免疫反應(yīng)，達(dá)到免疫個(gè)體不被傳染性病原體感染的目的。但是，機(jī)體免疫力過強(qiáng)，也會(huì)產(chǎn)生副作用，如自身免疫疾病等。所以在外來抗原物質(zhì)入侵時(shí)，機(jī)體會(huì)利用一整套免疫調(diào)節(jié)機(jī)制平衡免疫反應(yīng)。人為的抑制免疫反應(yīng)是用于治療自身免疫疾病的手段之一。
T細(xì)胞免疫抑制是機(jī)體免疫功能的ー個(gè)重要環(huán)節(jié)，比如限制自身免疫疾病發(fā)生和機(jī)能性下調(diào)免疫反應(yīng)。T細(xì)胞可以通過無共刺激分子存在情況下、通過T細(xì)胞為APC細(xì)胞刺激下或最近證明的胸腺來源的CD4+CD25+細(xì)胞與新生T細(xì)胞相互作用來實(shí)現(xiàn)其免疫抑制功能。多數(shù)自身免疫疾病均存在特異性的抗原受體，如系統(tǒng)紅斑狼瘡患者血液中，臨床檢查發(fā)現(xiàn)存在著抗DNA抗體，這種抗體與抗原形成了免疫復(fù)合物，沉淀在組織中引起周期性的炎癥。又如在類風(fēng)濕病(RA)患者的關(guān)節(jié)組織中，含有自身免疫反應(yīng)性T-細(xì)胞，它能與某種未知抗原發(fā)生反應(yīng)，這類T細(xì)胞通過T細(xì)胞抗原受體(TCRs)不僅可識(shí)別特定的抗原，也可識(shí)別主要組織相溶性分子(MHC)。因此，自身免疫反應(yīng)的抗原受體通過早期識(shí)別，引發(fā)炎癥，導(dǎo)致臨床上系統(tǒng)紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等嚴(yán)重的自身免疫性疾病。
實(shí)驗(yàn)研究已確定了某些自身免疫疾病的抗原受體，如小鼠和大鼠動(dòng)物模型中發(fā)生的NEB/NEW小鼠的紅斑狼瘡，實(shí)驗(yàn)性接種髓磷脂堿性蛋白(MBP)，過敏性腦脊髄炎(EAE)。
在小鼠紅班狼瘡中，采用抗特異性抗體(anti-ids)去除產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的B細(xì)胞，達(dá)到治療的目的，部分臨床病例表明抗特異性抗體能明顯緩解病癥，但有些病例表明抗特異性抗體使病情惡化。同樣在腦脊髄炎的治療中，利用免疫TCR-衍生肽類對(duì)抗自身免疫反應(yīng)的TCRs，結(jié)果有些病情得到了緩解，有些病情則進(jìn)ー步惡化。
因此，利用免疫接種來治療某些自身免疫疾病時(shí)，病人的免疫反應(yīng)直接影響治療的臨床效果。若免疫接種導(dǎo)致產(chǎn)生抗體反應(yīng)并形成抗Ids抗體，這些抗Ids可能會(huì)結(jié)合自身免疫反應(yīng)中的B細(xì)胞或T細(xì)胞，引起體外調(diào)節(jié)性的溶解反應(yīng)，達(dá)到臨床上病情緩解的效果，相反，如果免疫反應(yīng)導(dǎo)致體內(nèi)清除抗-Ids,免疫反應(yīng)物就會(huì)和自身免疫反應(yīng)中的B-細(xì)胞或T-細(xì)胞結(jié)合，同時(shí)又交叉性地與它們的抗原受體結(jié)合，進(jìn)ー步激發(fā)免疫細(xì)胞產(chǎn)生更多的自身免疫反應(yīng)抗體(Abs)或T-細(xì)胞，使臨床病情惡化。免疫接種激發(fā)和激活的大多數(shù)T-細(xì)胞，會(huì)同時(shí)引起不同類型的輔助T-細(xì)胞，如THl或TH2反應(yīng)，可能會(huì)使原潛在自身免疫疾病病情惡化，或使病情緩解。因此，有效地治療自身免疫疾病的免疫學(xué)方法尚需深入研究。
目前，在臨床上通常使用的免疫抑制劑包括化學(xué)藥品和抗體，其中，化學(xué)藥品有普樂可復(fù)(FK506),環(huán)孢素A (CsA),騎悉(MMF),硫唑嘌呤(Aza),強(qiáng)的松(Pred),早基強(qiáng)的松龍(MP)等；抗體有抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)，抗CD4單克隆抗體(0KT4)等。但以上的免疫抑制劑都有其毒副作用，若使用不當(dāng)，一方面可因過度抑制機(jī)體免疫反應(yīng)性而引發(fā)多種并發(fā)癥，另ー方面也可因其自身的毒副作用導(dǎo)致器官功能衰竭。
發(fā)明公開
本發(fā)明的目的是提供一種有選擇性地抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)的抑制劑。
本發(fā)明所提供的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑，包括針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原；或包括針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原的活性多肽；或包括滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗。
當(dāng)所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑包括獨(dú)立包裝或混合的針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原時(shí)，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑中針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原的質(zhì)量比值可為2 I至10 1，優(yōu)選為5 I。
當(dāng)所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑包括獨(dú)立包裝或混合的針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原的活性多肽時(shí)，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑中針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原的活性多肽的質(zhì)量比值為I : 5至5 : I。
當(dāng)所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑包括獨(dú)立包裝或混合的滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗時(shí)，所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑中滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗的質(zhì)量比值為I : 2至I : 10。
所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑還可包括免疫佐劑，如礦物油(注射用白油)。
所述核酸疫苗為含有蛋白質(zhì)抗原編碼基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體。
所述真核細(xì)胞表達(dá)載體中，調(diào)控蛋白質(zhì)抗原編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子可為RSV(肉瘤病毒)、CMV(巨細(xì)胞病毒)和SV40病毒的啟動(dòng)子。
所述真核細(xì)胞表達(dá)載體可為質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒或噬菌體表達(dá)載體、質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的表達(dá)載體、質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的表達(dá)載體等基因エ程領(lǐng)域中常用的表達(dá)載體。
所述蛋白質(zhì)抗原編碼基因的DNA可以是人工合成的或者通過從微生物、真核及植物細(xì)胞或組織提取而來的雙鏈DNA。
所述蛋白質(zhì)抗原為人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
所述蛋白質(zhì)抗原的活性多肽為人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)的。
所述生物體為在人工培養(yǎng)條件下可用于生產(chǎn)放大的大腸桿菌或芽孢桿菌或酵母菌或其它真核細(xì)胞生物。
所述滅活病原體是通過生物體分離和生產(chǎn)的病毒、病原菌、寄生蟲及過敏物質(zhì)經(jīng)公知的方法滅活后而得到的無感染性病原體。
所述滅活病原體可直接與核酸疫苗混合或滅活病原體經(jīng)與礦物油(注射用白油)乳化后再與核酸疫苗混合。[0024]所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑可通過注射、噴射、ロ服、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。


圖I為PCR擴(kuò)增的FMDV VPI基因的I %瓊脂糖凝膠電泳圖譜
圖2為對(duì)重組表達(dá)載體SuperY/VPl進(jìn)行酶切鑒定的電泳圖譜
圖3為VPl基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜
圖4為Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VPl蛋白的表達(dá)圖譜
圖5為檢測(cè)pcD-VPl與146S抗原混合后性質(zhì)變化情況
圖6為T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫小鼠后產(chǎn)生抗體情況的ELISA檢測(cè)結(jié)果
圖7a為針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響。
圖7b為滅活病原體疫苗和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
圖8為滅活病原體疫苗和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑共同免疫同一部位或単獨(dú)免疫不同部位對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
圖9為pcD-S2和重組こ肝表面抗原S蛋白T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
圖10為T細(xì)胞活性抑制的量效關(guān)系柱狀圖
圖11為比較T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠白細(xì)胞介素水平的影響
實(shí)施發(fā)明的最佳方式
下述實(shí)施例中所提到的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法；所提到的百分含量如無特別說明均為質(zhì)量百分含量。
DNA的制備
ー種方法是將動(dòng)物組織低溫后粉碎，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質(zhì)，雙鏈DNA經(jīng)こ醇沉淀而分離出來。
另ー種方法是從植物組織中采用CTAB法提取DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質(zhì)，雙鏈DNA經(jīng)こ醇沉淀而分離出來。
另ー種方法是從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白質(zhì)，雙鏈DNA經(jīng)こ醇沉淀而分離出來。
以上提取方法和技術(shù)的詳細(xì)描敘可在Sambrook等人的"MolecularCloning"(第二版 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press,紐約)和厲朝龍等編，《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技木》浙江大學(xué)出版社查尋。
蛋白質(zhì)和多肽的制備
蛋白質(zhì)和多肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)多肽合成儀(如ABI，433A等)合成，合成方法按儀器制造商使用方法；或從動(dòng)物組織和細(xì)胞、植物組織和細(xì)胞或微生物中，按常規(guī)的蛋白質(zhì)化學(xué)方法進(jìn)行提取，也可以從基因工程表達(dá)菌或細(xì)胞中提取。這些多肽提取方法都是公知的，在 Doonan 的"Protein Purification Protocols" (1996,Humana Press,NJ)中有詳細(xì)描敘。
病原物的制備及滅活
病原體通過生物體分離和生產(chǎn)的病毒、菌、支原體、寄生蟲及過敏物質(zhì)經(jīng)公知的滅活方法和試劑如甲醛或福爾馬林、丙內(nèi)酷、N-こ酰こ烯亞胺以及ニこ烯亞胺等，滅活后而得到的無感染性病原體，再經(jīng)分離純化后而制成。
實(shí)施例I、牛ロ蹄疫(FMDV)VPl蛋白質(zhì)抗原的制備
一、牛ロ蹄疫VPI的cDNA克隆
感染牛ロ蹄疫病毒的口腔病變組織，利用RNA提取試劑盒(購(gòu)自上海生物工程公司)采用異硫氰酸胍ー步法按照試劑盒的說明提取病毒總RNA，具體步驟如下取病變組織破碎分離細(xì)胞，加入O. 5mL異硫氰酸胍溶液,O. 5mL的苯酹/氯仿/異戍醇(25 : 24 : I) 溶液，4°C 12000rpm離心5分鐘，將上清液移至一新的I. 5毫升塑料離心管中，加等量的異丙醇，-20°C放置30分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄去上清液，沉淀用70%こ醇清洗，沉淀干燥后溶于30 μ L DEPC處理水中，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明得到病毒RNA。
在如下反應(yīng)條件下合成第一鏈cDNA :2yg牛ロ蹄疫病毒RNA, 50mmol/LTris-HCl(ρΗ8· 3)，75mmol/L KCl，10mmol/L DTT，3mmol/L MgCl2,500 μ mol/L dNTPs,100 μ g隨機(jī)六聚體引物，500單位MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，總體積20 μ L，37°C保溫lh。以第一鏈cDNA 產(chǎn)物為模板，在引物 I :5’ -AAGAATTCGGAGGTACCACCTCTGCGGGTGAG-3’ 和引物 2 :5’ -AATCTAGACCTCCGGAACCCAGAAGCTGTTTTGCGGG-3 ’，(在引物 I 和引物 2，分別引入 EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)和XbaI識(shí)別位點(diǎn))的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增牛ロ蹄疫病毒VPl的cDNA。反應(yīng)體系5 μ L第一鏈 cDNA產(chǎn)物，引物 I 和引物 2 各 10pmol，500mM KCl, IOOmM Tris-HCl (pH8. 4), I. 5mM MgCl2,100 μ g/mLBSA, ImM dNTPs, 2. 5U Taq DNA聚合酶，總體積為50 μし反應(yīng)條件為94°C變性30秒，54V復(fù)性30秒，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增的FMDV VPI基因的I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖I所示(泳道M為DNA Marker ;泳道I為PCR產(chǎn)物)，圖中箭頭所指為目的條帶的位置，表明目的片段的大小為639bp，與VPl基因片段大小一致，用低熔點(diǎn)膠回收該擴(kuò)增片段。
ニ、表達(dá)載體SuperY/VPl的構(gòu)建與鑒定
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切步驟ー獲得的ロ蹄疫VPl cDNA片段，電泳，回收后，將VPl基因片段克隆入穿梭質(zhì)粒SuperY(在購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司的質(zhì)粒pGAPZa的SphI和HpaI位點(diǎn)上加入卡那霉素抗性基因(Kanlr)得到SuperY)的EcoRI和XbaI酶切位點(diǎn)之間，再用EcoRI和XbaI限制性內(nèi)切酶對(duì)重組載體進(jìn)行酶切鑒定，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(泳道M為DNA Marker;泳道I為酶切產(chǎn)物)，其中的小片段大小為639bp，與VPl基因片段大小一致，表明VPl已正確克隆至SuperY上，并將該重組載體命名為SuperY/VPl，然后將SuperY/VPl轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO F'感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列與VPl基因一致，并已成功克隆至SuperY質(zhì)粒中。
三、VPl基因在酵母中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)
將步驟ニ構(gòu)建的重組表達(dá)載體SuperY/VPl采用電擊法轉(zhuǎn)化酵母SMD1168，篩選鑒定陽(yáng)性克隆，挑取單菌落30°C搖瓶培養(yǎng)48-96小時(shí)后(同時(shí)設(shè)酵母SMD1168和轉(zhuǎn)化有SuperY的酵母SMD1168為對(duì)照)，取上清變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250染色后，用凝膠成像系統(tǒng)照相，結(jié)果如圖3所示(泳道I :酵母SMD1168上清；泳道2 :轉(zhuǎn)化有SuperY的酵母SMD1168的表達(dá)上清；泳道3 :轉(zhuǎn)化有SuperY/VPl的酵母SMD1168表達(dá)上清；泳道M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn))，由泳道3可知VPl的表達(dá)產(chǎn)物為兩種，分子量分別為66kD和43kD，表明SuperY/VPl中的VPl基因在酵母細(xì)胞中獲得表達(dá)。再將該重組表達(dá)載體SuperY/VPl的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting分析,具體方法為將表達(dá)的蛋白變性后，用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，再將其電轉(zhuǎn)移至NC膜，用5%脫脂牛奶作封閉劑，然后依次用?？攻硖阋卟《靖呙庋?購(gòu)于新疆建設(shè)兵團(tuán)獸醫(yī)總站)、羊抗牛IgG-HRP酶標(biāo)抗體(美國(guó)Sigma公司購(gòu)買處)孵育，最后在DAB/H202下顯色，結(jié)果如圖4所示(泳道M :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；泳道I :轉(zhuǎn)化有SuperY/VPl的酵母SMDl 168表達(dá)上清；泳道3 :酵母SMDl 168上清；泳道4 :轉(zhuǎn)化有SuperY的酵母SMDl 168的表達(dá)上清)，泳道I在66kD和43kD附近出現(xiàn)了特異性的顯色帯，而泳道2和3均未出現(xiàn)條帯，表明表達(dá)的蛋白能與抗FMDV血清反應(yīng)產(chǎn)生特異性反應(yīng)帶，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物具有FMDV的免疫原性。表達(dá)的上清經(jīng)脫鹽純化后保存在_20°C，可作為牛ロ蹄疫VPl蛋白疫苗，用于以下實(shí)施例。
實(shí)施例2、測(cè)定針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原組合物 性質(zhì)實(shí)驗(yàn)
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切實(shí)施例I中的步驟ー獲得的ロ蹄疫VPl cDNA片段，回收VPl基因，將真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3同樣以EcoRI和XbaI酶切，用T4 DNA連接酶將VPl基因片段連接到pcDNA3 (購(gòu)自Invitrogen公司)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在平板上篩選具有氨芐青霉素(50yg/mL)抗性的菌落，提取質(zhì)粒，酶切篩選鑒定正確克隆，得到含有VPl基因的重組質(zhì)粒pcD-VPl。
為證明針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原在混合后各自無性質(zhì)上的改變，將等質(zhì)量的pcD-VPl與146S抗原(去除牛ロ蹄疫O型滅活疫苗(購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所)中的礦物油，得到146S抗原)混合后置于37°C孵育24小時(shí)，經(jīng)I %瓊脂糖電泳，比較變化情況。結(jié)果如圖5所示，表明pcD-VPl與146S抗原混合前后性質(zhì)無變化。圖中，泳道I和2是混合前的pcD-VPl，3和4是混合的pcD-VPl與146s的樣品電泳后的情況，泳道5、6是混合的pcD-VPl和146s的樣品經(jīng)37°C孵育24小時(shí)后的情況，泳道7、8是混合的pcD-VPl和146s的樣品并加入10單位DNA酶I (Sigma公司)經(jīng)37°C孵育24小時(shí)后的情況，9是DNA Marker。
實(shí)施例3、T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫小鼠后產(chǎn)生抗體情況的ELISA檢測(cè)
為驗(yàn)證由針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑、由滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫小鼠后對(duì)免疫系統(tǒng)中抗體免疫水平的影響，進(jìn)行以下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
將54只6-8周齡BALB/c (H_2d)雌性小鼠分為9組，每組6只。第一組肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗(購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所)100微升，第14天再以相同注射劑量加強(qiáng)免疫一次；第二組肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，第14天再以相同注射劑量加強(qiáng)免疫一次；第三組肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，第14天再以相同注射劑量加強(qiáng)免疫一次；第四組第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，在第一次免疫后第14天注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗100微升；第五組第一次肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗100微升，在第一次免疫后第14天注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第六組第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，在第一次免疫后第14天注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升；第七組第一次肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，在第一次免疫后第14天注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第八組第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl和20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，第14天再以相同注射劑量加強(qiáng)免疫一次；第九組第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl和含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗的混合溶液100微升，第14天再以相同注射劑量加強(qiáng)免疫一次。在第二次免疫后第15、35、50和72天取血清用ELISA法測(cè)定其抗體滴度，檢測(cè)方法為將96孔酶標(biāo)板用8ug/ml抗原包被，4°C過夜，3%小牛血清37°C封閉Ih ；PBST (O. 05% Tween20溶于PBS)洗滌3次，每次5分鐘；加入不低于系列稀釋的免疫動(dòng)物(小鼠)血清，以未免疫的小鼠血清作對(duì)照，37°C孵育2小時(shí)；PBST洗板三次后，每孔辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(ニ抗，Sigma, St. Louis) 100μ 1，37°C孵育I小時(shí)后棄去，PBST洗滌3次，每次5分鐘；PBST洗三次，加入底物TMB液100 μ 1，室溫顯色反應(yīng)30分鐘，2Μ硫酸中止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD45cia52ci光密度值，實(shí)驗(yàn)孔的OD值達(dá)到對(duì)照孔OD值的兩倍時(shí)認(rèn)為是陽(yáng)性。結(jié)果如圖6所示，表明由核酸疫苗pcD-VPl和pcD-VPl所表 達(dá)的蛋白質(zhì)抗原VPl組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑、由牛ロ蹄疫O型滅活疫苗和pcD-VPl組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫小鼠時(shí)，特異性抗體水平與其它組比較無明顯變化。說明針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑、由滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫動(dòng)物，在激活特異性抗體水平是無特別變化。圖6中，每組從左至右依次為第二次免疫后第15、35、50和72天血清的ELISA結(jié)果。(圖6中的橫坐標(biāo)具體表示免疫組)
實(shí)施例4、針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
將30只6-8周齡BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分三組，第一組肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升；第二組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的0.9% NaCl水溶液100微升；第三組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾臟T細(xì)胞測(cè)定其T細(xì)胞擴(kuò)增活性，具體方法為在無菌條件下，取脾制成單個(gè)細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，然后用PBS液洗三次，離心并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到I X IO6個(gè)/ml，將每組細(xì)胞懸液分4份加入96孔培養(yǎng)板中。其中ー份加入100 μ I Con A (有絲分裂原)至終濃度為5 μ g/ml，ー份加入相應(yīng)的特異性抗原(VPl)作為刺激物至終濃度為2 μ g/ml，一份不加刺激物，ー份加入100 μ I BSA至終濃度為2 μ g/ml作為無關(guān)抗原，24小時(shí)后，每孔加入100 μ I MTT至終濃度為5mg/ml，48h后，姆孔加入100 μ I SDS-DMSO (20 % SDS溶于50 % DMSO, ρΗ2. O)，使其完全溶解，孵育4h后，在酶標(biāo)儀上讀取570nm處的OD值，計(jì)算刺激指數(shù)(SI =實(shí)驗(yàn)刺激數(shù)+非刺激數(shù))。結(jié)果如圖7a所示，表明含有核酸疫苗pcD-VPl和VPl的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫動(dòng)物，其T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于核酸疫苗組和VPl組，說明含有核酸疫苗pcD-VPl和VPl的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑可以特異性的降低T細(xì)胞免疫水平。圖7a中，ConA表示陽(yáng)性對(duì)照；BSA表示陰性對(duì)照，VPl表示第一組，pcD-VPl表示第二組；VPl+pcD-VPl表示第三組。[0064]實(shí)施例5、滅活病原體疫苗和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
將50只6-8周齡BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分五組，第一組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克146S抗原(去油的牛ロ蹄疫O型滅活疫苗，購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所)的O. 9% NaCl水溶液100微升；第二組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗(購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所)的混合溶液100微升；第三組肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗100微升；第四組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第五組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和含20微克豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)滅活病毒疫苗(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所)的混合溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾臟T細(xì)胞測(cè)定其T細(xì)胞擴(kuò)增活性，具體方法為在無菌條件下，取脾制成單個(gè)細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，然后用PBS液洗三次，離心并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到I X IO6個(gè)/ml，將每組細(xì)胞懸液分4份加入96孔培養(yǎng)板中。其中ー份加入IOOyl ConA(有絲分裂原)至終濃度為5 μ g/ml，ー份加入相應(yīng)的特異性抗原(146S抗原)作為刺激物至終濃度 為2 μ g/ml，一份不加刺激物，ー份加入100 μ I BSA至終濃度為2 μ g/ml作為無關(guān)抗原，24小時(shí)后，每孔加入100μ I ] 1'1'至終濃度為511^/1111，4811后，每孔加入10(^1 SDS-DMSO(20%SDS溶于50% DMS0，pH2. O)，使其完全溶解，孵育4h后，在酶標(biāo)儀上讀取570nm處的OD值，計(jì)算刺激指數(shù)(SI =實(shí)驗(yàn)刺激數(shù)+非刺激數(shù))。結(jié)果如圖7b所示，表明含有核酸疫苗PcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑和含有pcD-VPl核酸疫苗和146S抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫動(dòng)物，其T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于核酸疫苗組或牛ロ蹄疫O型滅活疫苗組以及核酸疫苗pcD-VPl和滅活豬生殖呼吸綜合癥病毒疫苗組。說明其抑制T細(xì)胞擴(kuò)增活性是抗原專ー性的。圖7b中，1，為ConA表示陽(yáng)性對(duì)照；2，為BSA非特異性抗原組；3，為pcD-VPl核酸疫苗和146S抗原疫苗共同免疫組；4，為pcD-VPl核酸疫苗和牛ロ蹄疫O型滅活疫苗共同免疫組；5，為牛ロ蹄疫O型滅活疫苗組；6，為核酸疫苗PcD-VPl免疫組；7，為pcD-VPl核酸疫苗和滅活豬生殖呼吸綜合癥病毒疫苗共同免疫組。
實(shí)施例6、滅活病原體疫苗和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑共同免疫同一部位或単獨(dú)免疫不同部位對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
滅活病原體疫苗和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
將60只6-8周齡BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分為六組，第一組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克146S抗原(除去油的牛ロ蹄疫O型滅活疫苗抗原)的O. 9%NaCl水溶液組合物100微升；第二組在左腿肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗的0.9% NaCl水溶液50微升，右腿肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液50微升；第三組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗的O. 9% NaCl水溶液100微升；第四組肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗100微升；第五組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升 ’第六組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和含20微克豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)滅活病毒疫苗(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所)的O. 9% NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾臟T細(xì)胞測(cè)定其T細(xì)胞擴(kuò)增活性，具體方法同實(shí)施例5。結(jié)果如圖8所示，表明不管T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制中是否有油佐劑，含有核酸疫苗pcD-VPl和ロ蹄疫146S抗原的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫動(dòng)物，其T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于核酸疫苗組或牛ロ蹄疫O型滅活疫苗組以及核酸疫苗pcD-VPl和滅活豬生殖呼吸綜合癥病毒疫苗組。說明此抑制T細(xì)胞擴(kuò)增活性是抗原專ー性的，同時(shí)還證明，不管是核酸疫苗pcD-VPl和ロ蹄疫146S抗原共同免疫同一部位，還是單獨(dú)免疫不同部位，都能抑制T細(xì)胞活性。圖8中，1，為ConA表示陽(yáng)性對(duì)照；2，為BSA非特異性抗原組；3，為pcD-VPl核酸疫苗和146S抗原共同免疫組；4，為左腿肌肉注射146S抗原，右腿肌肉注射pcD-VPl核酸疫苗組；5，為pcD-VPl核酸疫苗和牛ロ蹄疫O型滅活疫苗共同免疫組；6，為牛ロ蹄疫O型滅活疫苗免疫組；7，為核酸疫苗pcD-VPl免疫組；8，為pcD-VPl核酸疫苗和滅活豬生殖呼吸綜合癥病毒疫苗共同免疫組。
實(shí)施例7、病原體抗原和針對(duì)該病原體抗原的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑對(duì)免疫小鼠T細(xì)胞特異性擴(kuò)增的影響
pADR 質(zhì)粒(Gan RB, Cu MJ, Li ZP, et al. The complete nucleotide sequence ofthe cloned DNA of hepatitis B virus subtype adr inpADR-1. Sci Sin(B),1987,30(5)507-521)中含有全長(zhǎng)的HBV基因組。以其為樽板，在引物I :5’-CGGATCCATTAAGCCATGCAGTGGAACTCC-3’ ；和引物 2 :5’ -GTCCTTGGGTATACATTTGAACCCCGGATCCA-3，,(在引物 I 和引物 2，都引入BamHI識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)在引物I引入起始位點(diǎn)ATG，引物2引入終止位點(diǎn)TGA)的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增HBV S2抗原的DNA片段。反應(yīng)體系5 μ LpADR質(zhì)粒(IOng)，引物I和引物2各 10pmol，500mM KCl,IOOmM Tris-HCl(pH8. 4),I. 5mM MgCl2,100 μ g/mL BSA，ImM dNTPs,
2.5U Taq DNA聚合酶，總體積為50 μし反應(yīng)條件為94°C變性30秒，54°C復(fù)性30秒，72°C延伸I分鐘，共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增的DNA片段產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamHI進(jìn)行酶切，回收HBV S2抗原的DNA片段，將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3同樣以BamHI酶切，用T4 DNA連接酶將S2基因片段連接到pcDNA3 (購(gòu)自invitrogen公司)上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在平板上篩選具有氨芐青霉素(50yg/mL)抗性的菌落，提取質(zhì)粒，酶切篩選鑒定正確克隆，得到含有S2基因的重組質(zhì)粒pcD-S2。
將30只6-8周齡BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分三組，第一組肌肉注射含有100微克重組こ肝表面抗原S基因的核酸疫苗pcD-S2的0. 9% NaCl水溶液100微升；第ニ組肌肉注射含有20微克重組こ肝表面抗原S蛋白(購(gòu)自于北京天壇生物制品所)疫苗的0.9%NaCl水溶液100微升；第三組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD_S2和20微克重組こ肝表面抗原S蛋白疫苗的0.9% NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾臟T細(xì)胞測(cè)定其T細(xì)胞擴(kuò)增活性，具體方法除刺激物為重組こ肝表面抗原S蛋白外，其它與實(shí)施例5相同。結(jié)果如圖9所示，表明核酸疫苗pcD-S2和20微克重組こ肝表面抗原S蛋白疫苗T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫動(dòng)物，其T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于核酸疫苗組和蛋白疫苗組。圖9中，I為ConA表示陽(yáng)性對(duì)照；2為核酸疫苗pcD-S2免疫組；3為重組こ肝表面抗原S蛋白疫苗免疫組；4為核酸疫苗pcD-S2和重組こ肝表面抗原S蛋白疫苗免疫組；5為BSA非特異性抗原組。
實(shí)施例8、T細(xì)胞活性抑制的量效關(guān)系實(shí)驗(yàn)
將70只6-8周齡BALB/c (H_2d)雌性小鼠均分七組，第一組肌肉注射含100微克ロ蹄疫VPl基因的核酸疫苗PcD-VPl的0. 9% NaCl水溶液100微升；第二組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫滅活病毒疫苗(購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所，含50%注射用白油)的O. 9% NaCl水溶液100微升；第三組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克ロ蹄疫VPl蛋白疫苗的O. 9 % NaCl水溶液100微升；第四組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和200微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽(序列為NH2-LRGDLQVLAQKVARTL-COOH)疫苗的的O. 9% NaCl水溶液100微升；第五組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和50微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽疫苗的0.9% NaCl水溶液100微升；第六組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和12. 5微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽的O. 9% NaCl水溶液100微升；第七組肌肉注射含100微克核酸疫苗pcD-VPl和20微克豬瘟病毒E2抗原中小肽疫苗(序列為NH2-CTAVSPTTLRT-COOH)的O. 9%NaCl水溶液100微升。第一次免疫后第14天再以同等劑量加強(qiáng)免疫一次，并于第二次免疫后第14天取脾臟T細(xì)胞測(cè)定其T細(xì)胞擴(kuò)增活性，具體方法除刺激物為VPl蛋白或豬瘟E2小肽(第七組)タト，其它與實(shí)施例5相同。結(jié)果如圖10所示，表明核酸疫苗pcD-VPl和重組VPl蛋白疫苗共同免疫動(dòng)物，其T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于核酸疫苗單獨(dú)免疫的第二組；同時(shí)也表明 核酸疫苗pcD-VPl和VPl蛋白中的RGD小肽疫苗在不同濃度下形成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑共同免疫動(dòng)物，其T細(xì)胞擴(kuò)增活性明顯低于核酸疫苗單獨(dú)免疫組，并且呈現(xiàn)出量效關(guān)系，既RGD小肽的濃度越高，T細(xì)胞擴(kuò)增活性抑制越明顯。圖10中，1，為ConA表示陽(yáng)性對(duì)照；2，為核酸疫苗pcD-VPl免疫組；3，pcD-VPl和ロ蹄疫滅活病毒疫苗免疫組；4，pcD-VPl和ロ蹄疫VPl蛋白疫苗免疫組；5，為pcD-VPl和200微克ロ蹄疫VPl蛋白中的RGD小肽疫苗組合物免疫組；6，為pcD-VPl和50微克RGD小肽疫苗組合物免疫組；7，為pcD-VPl和12. 5微克RGD小肽疫苗組合物免疫組；8，pcD-VPl和20微克豬瘟E2抗原小肽疫苗的組合物；9，為BSA非特異性抗原組。
實(shí)施例9、細(xì)胞因子水平測(cè)定
將60只6-8周齡BALB/c (H_2d)雌性小鼠分為10組，每組6只。第一組肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升兩次，兩次之間間隔14天；第二組肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗(購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所)100微升兩次，兩次之間間隔14天；第三組第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，間隔14天后第二次注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗100微升；第四組第一次肌肉注射含20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗100微升，間隔14天后第二次注射含100微克pcD-VPl的0.9% NaCl水溶液100微升；第五組肌肉注射含100微克pcD-VPl和20微克牛ロ蹄疫O型滅活疫苗的混合溶液100微升兩次，兩次之間間隔14天；第六組肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升兩次，兩次之間間隔14天；第七組第一次肌肉注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升，間隔14天后第二次注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升；第八組第一次肌肉注射含100微克pcD-VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升，間隔14天后第二次注射含20微克VPl蛋白的O. 9% NaCl水溶液100微升；第九組肌肉注射含100微克pcD-VPl和20微克VPl的O. 9% NaCl水溶液100微升兩次，兩次之間間隔14天；第十組肌肉注射O. 9% NaCl水溶液100微升為對(duì)照。
利用競(jìng)爭(zhēng)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的水平，其關(guān)鍵在于引入ー個(gè)內(nèi)標(biāo)模板PQRS，它含有IL-2，IL-4，IL-10, IFN-Y，HRPT等基因的部分序列(pQRS質(zhì)粒在每個(gè)基因中加入一段50-60bp的核苷酸，使其基因比野生型的IL-2，IL-4，IL-10, IFN- y , HRPT等基因大。在使用同樣引物擴(kuò)增后，從大小上可以判斷出內(nèi)標(biāo)模板與野生模板的區(qū)別，同時(shí)由于是競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，所以可以判斷出野生模板與內(nèi)標(biāo)模板量的關(guān)系。其具體制備方法見參考3CSKjournal of Immunological Methods，1993，165 :37，“Constructing polycompetitorcDNAs for quantitativePCR”)，因此以pQRS為內(nèi)標(biāo)模板可以檢測(cè)免疫動(dòng)物中相應(yīng)細(xì)胞因子的含量(金華利等在2004年Vaccine雜志第22卷，第2925頁(yè)發(fā)表的文章Effect ofChemical Adjuvants on DNA vaccinationノ。
取免疫后的小鼠斷頸處死后取出脾臟，提取總RNA(TRIZ0L，鼎國(guó)生物公司)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄依照大連寶生物公司RNA RT-PCR操作指南，取純化的I μ g總RNA置250 μ L離心管中，然后依次加入相關(guān)試劑4 μ I MgCl2,2y I 10X緩沖液，8·5μ1 DEPC水，2 μ I dNTP 混合物，0. 5 μ I RNase inhibitor, 0. 5 μ I M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(Promage 公司)，0. 5yL 01igo(dT)12 引物;反應(yīng)條件為 42°C 30min,99°C 5min，5°C 5min。用看家基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)為內(nèi)源表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，將各組cDNA濃度調(diào)為一致，然后在IOOng 恒定量的PQRS管中加入2μ I的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于有pQRS的競(jìng)爭(zhēng)，以下四種細(xì)胞因子IL-2基因，IFN- Y基因，IL-4基因和IL-10基因擴(kuò)增的量將相對(duì)于pQRS擴(kuò)增的量表現(xiàn)出相對(duì)不同而反映在電泳膠中的濃度差別。其中，反應(yīng)所需引物和PCR反應(yīng)條件如表I所示。
表I. HPRT, IL-2，IFN- y，IL-4和IL-10的引物序列及PCR反應(yīng)參數(shù)
目的基因~Flm反應(yīng)條件
HPRT5' GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG94°C 30sec,60°C 30sec and
3' GAGGGTAGGCTGGCCTATGGCT72°C 40sec
IL-25' TCCACTTCMGCTCTACAG94°C 30sec,55°C 30sec and
3' GAGTCAAATCCAGAACATGCC72°C 40sec
IFN-y5' CATTGAAAGCCTAGAAAGTCTG94°C 30sec,58°C 30sec and
3' CTCATGGAATGCATCCTTTTTCG72°C 40sec
IL-45' GAAAGAGACCTTGACACAGCTG94°C 30sec,54°C 30sec and
3' GAACTCTTGCAGGTAATCCAGG72°C 40sec
IL-105' CCAGTTTTACCTGGTAGMGTGATG94°C 30sec,56°C 30sec and
3' TGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA72°C 40sec
電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物結(jié)果如圖11所示，表明由核酸疫苗pcD-VPl和pcD_VPl所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原VPl組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑，或由牛ロ蹄疫O型滅活疫苗(購(gòu)自蘭州獸醫(yī)研究所)和pcD-VPl組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫小鼠時(shí)(第三，第四，第五，第七，第八和第九組)，其動(dòng)物體內(nèi)的IL-4和IL-10上升,而IL-2和IFN-Y下降。說明針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑、由滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗組成的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑免疫動(dòng)物，激活了起免疫抑制活性的細(xì)胞介素IL-4和IL-IO水平，由此證明其組合物抑制T細(xì)胞活性是通過IL-4和IL-10完成的。圖11中，橫坐標(biāo)為第一至第十免疫組。
エ業(yè)應(yīng)用
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、本發(fā)明的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑比化學(xué)藥品如普樂可復(fù)(FK506)，環(huán)孢素A(CsA)，驍悉(MMF)，硫唑嘌呤(Aza)，強(qiáng)的松(Pred)，早基強(qiáng)的松龍(MP)，和抗體如0KT4等更為安全，有選擇性的抑制機(jī)體T細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而可以有效的應(yīng)用于自身免疫疾病、器官移植、控制T細(xì)胞水平的治療等方面。
2、本發(fā)明的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生正常的特異性抗體免疫反應(yīng)，抑制特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是Thl型免疫反應(yīng)；該特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)是通過增強(qiáng)白介素10水平和抑制干擾素IFN-Y水平介導(dǎo)的。增強(qiáng)白介素10水平是機(jī)體免疫系統(tǒng)抑制過強(qiáng)的免疫反應(yīng)而進(jìn)行的有效調(diào)節(jié)作用，是防止機(jī)體中不必要的免疫損傷而重要手段之一。 所以本發(fā)明的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑可以特異性地用于抑制特定病原物引起的免疫損傷，能有效地克服免疫抑制方法不特異的不足。
3、本發(fā)明的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑不要求特殊的反應(yīng)條件，一般生物制品藥廠的設(shè)備即可生產(chǎn)，生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，易于ェ業(yè)化生產(chǎn)；
4、本發(fā)明的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑可用于治療以下自身免疫疾病系統(tǒng)紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、慢性淋巴性(橋本氏)甲狀腺炎、毒性甲狀腺腫(Grave’s病)，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、胰島素依賴型糖尿病、重癥肌無力、慢性活動(dòng)性肝炎、慢性潰瘍性結(jié)腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、變態(tài)反應(yīng)性腦脊髄膜炎、肺出血腎炎綜合征、硬皮病、尋常天皰瘡、類天皰瘡、腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、多發(fā)性腦脊髄硬化癥、急性多發(fā)性多神經(jīng)炎等嚴(yán)重的自身免疫性疾??；可以用于抑制器官移植中的免疫排斥反應(yīng)。
5、本發(fā)明的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑可用于治療以下由于ー些常見的過敏原如塵螨、跳蚤、蟑螂、動(dòng)物皮毛、花粉、霉菌、細(xì)菌、病毒及煙草煙霧導(dǎo)致的皮膚、呼吸道等受損害，而出現(xiàn)過敏反應(yīng)或免疫過激而引起的過敏性免疫疾病接觸性皮炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、哮喘、腎炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、病毒性肝炎免疫超敏反應(yīng)等。
權(quán)利要求
1.獨(dú)立包裝或混合的質(zhì)量比為2: I至10 : I的針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原 或獨(dú)立包裝或混合的質(zhì)量比為I : 2至I : 10的滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗 在制備T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的應(yīng)用，其特征在于所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑中針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原的質(zhì)量比值為5 I。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑還包括免疫佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述核酸疫苗為含有蛋白質(zhì)抗原編碼基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的應(yīng)用，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)載體中，調(diào)控蛋白質(zhì)抗原編碼基因表達(dá)的啟動(dòng)子為RSV、CMV或SV40病毒的啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的應(yīng)用，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)載體為質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒或噬菌體表達(dá)載體、質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的表達(dá)載體或質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)抗原編碼基因的DNA是人工合成的或者通過從微生物、真核及植物細(xì)胞或組織提取而來的雙鏈DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)抗原為人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)抗原的活性多肽為人工合成的或者通過生物體生產(chǎn)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物體為在人工培養(yǎng)條件下可用于生產(chǎn)放大的大腸桿菌、芽孢桿菌或酵母菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述滅活病原體是通過生物體分離和生產(chǎn)的病毒、病原菌、寄生蟲及過敏物質(zhì)經(jīng)公知的方法滅活后而得到的無感染性病原體。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的應(yīng)用，其特征在于所述滅活病原體直接與核酸疫苗混合或經(jīng)與礦物油乳化后再與核酸疫苗混合。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑。本發(fā)明所提供的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑包括針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原；或包括針對(duì)病原體的核酸疫苗和該核酸疫苗所表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原的活性多肽；或包括滅活病原體和針對(duì)該病原體的核酸疫苗。本發(fā)明的T細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制劑可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生正常的特異性抗體免疫反應(yīng)，抑制特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，特別是Th1型免疫反應(yīng)，從而可以有效的應(yīng)用于自身免疫疾病、器官移植、過敏、控制T細(xì)胞水平的治療等方面。
文檔編號(hào)A61P37/02GKCN1909918 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200580002701
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2005年1月31日
發(fā)明者俞慶齡, 康友敏, 王賓, 金華利 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1),