專利名稱:一種人胎盤組織液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有其有不明結(jié)構(gòu)的原材料的醫(yī)用配制品及其制備方，特別涉及一種胎盤的生物制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
胎盤中藥名為紫河車，具有調(diào)節(jié)人體機能，增強抵抗力，大補元氣精血的作用。性溫，味甘、咸，歸心、肺、腎經(jīng)。具有溫腎補精，益氣養(yǎng)血的功效，用于虛勞羸瘦，骨蒸盜汗，咳嗽氣喘，食少氣短，陽痿遺精，不孕少乳。
人胎盤被譽為保健品之王，還能治療多種疾病。現(xiàn)代科技研究表明人胎盤是內(nèi)源性生物活性物質(zhì)中重要的優(yōu)良的人源性藥物，是最符合人體生物學(xué)調(diào)節(jié)的藥物。人體胎盤無化學(xué)和激素等添加成分，在修復(fù)重建人體各個系統(tǒng)生理功能的同時，沒有任何毒、副作用、過敏反應(yīng)和依賴性，不良反應(yīng)少。
人胎盤的成分較復(fù)雜，功效多樣。它含有多種抗體蛋白，具有功能多樣并且高效的免疫作用；含有干擾素，有抑制病毒對人體細胞的侵襲作用；含有與血液凝固有關(guān)的成分， 有類似凝血因子XII的纖維蛋白穩(wěn)定因子；含有尿激酶抑制物(能抑制尿激酶活化纖維蛋白溶酶原的作用)和纖維蛋白溶酶原活化物。人胎盤中還含有多種激素促性腺激素A和 B，催乳素，促甲狀腺激素，催產(chǎn)素樣物質(zhì)，多種留體激素和雌酮，雌二醇，雌三醇，孕留酮，睪丸甾酮，去氧皮質(zhì)甾酮，11-去氫此質(zhì)甾酮，可的松，17-羥皮質(zhì)甾酮，四氫皮質(zhì)甾酮，4-孕烯-20，21-二醇-3，11-二酮，絨毛膜促腺激素(一種蛋白質(zhì)的多肽激素)等及促腎上腺皮質(zhì)激素等；還含有多種酶，如溶菌酶，激肽酶，組胺酶，催產(chǎn)素酶，清蛋白酶，α -球蛋白酶， β _球蛋白酶，Y-球蛋白酶等；含有紅胞生成素，磷脂，β -內(nèi)啡肽，氨基多糖體(由8分子乙酰氨葡萄糖、6分子甘露糖所組成)。胎盤乳原(多肽化合物)含多種氨基酸，并含微量維生素Β12，乙酰膽堿及碘等。
從人胎盤的酸性抽提物中還可得到較多量的松弛大鼠十二指腸和降大鼠血壓的成分，其性質(zhì)同前列腺素Ε1。催乳素與垂體生長激素的化學(xué)機構(gòu)上相關(guān)，有免疫交叉反應(yīng)， 在垂體切除的大鼠中人胎盤催乳素與生長激素有明顯的協(xié)同作用，促進生長。
人胎盤制品在臨床上應(yīng)用廣泛，中醫(yī)學(xué)認為人胎盤具有滋補強壯、養(yǎng)血填精、滋腎壯陽、益氣健脾的功能，可用于營養(yǎng)不良、食欲不振、神經(jīng)衰弱、血少體虛、神虛陽痿、雀斑、 面暗皮黑及一切內(nèi)分泌失調(diào)等方面的治療。人胎盤制品多用于皮膚科、婦科、外科，以及更年期綜合癥和多種慢性疾病。
人胎盤組織液是人胎盤制品中應(yīng)用最廣泛的藥物，它含有人體生理必須的多種活性物質(zhì)和人體生理必須的酶類物質(zhì)，對維持人體內(nèi)分泌的正常功能起到重要的調(diào)節(jié)作用。 它可以保證人體處于健康的狀態(tài)，改善各個器官的功能低下，延緩生理機能的衰退，延緩衰老；其中富含的多種氨基酸、礦物質(zhì)，補充人體后天需要的各種養(yǎng)分，激活人體細胞；含有的拮抗黑色素因子、透明質(zhì)酸保濕因子，具有強大的養(yǎng)顏、美白、保濕效果，從根本上延緩衰老；含有的免疫調(diào)節(jié)因子、干擾素I干擾素β、促紅細胞生長素、神經(jīng)生長因子、白介素、類胰島素生長因子、血小板衍生因子、轉(zhuǎn)化生長因子、集落刺激因子等具有促進細胞分化、增值作用，能有效加強免疫修復(fù)；含有的豐富的蛋白質(zhì)，如白蛋白、球蛋白、巨球蛋白和多種胎盤球蛋白抗體，能顯著提高人體免疫力，有效地預(yù)防疾病發(fā)生，把疾病扼殺在萌芽狀態(tài)；含有各種維生素和超氧化物歧化酶，有效維持人體各種功能的正常，保證正常的新陳代謝，及時清除衰老細胞和隨時產(chǎn)生的變異細胞，消除自由基對人體的損害，防治癌變，有效預(yù)防癌癥的發(fā)生。
人胎盤組織液等制品的生物療法調(diào)控人體的作用活躍，針對異常細胞的靶向作用準確，調(diào)整和加強人體組織細胞的新陳代謝、調(diào)節(jié)人體免疫力和內(nèi)分泌、消除自由基、修復(fù)人體基因，創(chuàng)建優(yōu)良的人體內(nèi)環(huán)境，提高集體抵抗風(fēng)、寒、暑、濕和病原微生物侵襲，廣泛用于癌癥、術(shù)后、婦科疾病、皮膚疾病、內(nèi)分泌紊亂、更年期、不孕不育等領(lǐng)域。由于人胎盤及其制品的巨大的藥用價值，對胎盤及其制品的研究眾多，但是目前，人胎盤組織液的提取多采用煎煮濃縮方法，這種方法不但提取出的藥用成分含量低，而且能耗大、成本高，并且胎盤中的一些活性基因調(diào)控因子和部分代謝調(diào)控酶會因高溫作用而失活，使得胎盤組織液的利用價值明顯降低。
例如，授權(quán)公告號為CN1030528C的發(fā)明專利公開了一種制備人胎盤膠原的方法， 該制備人胎盤膠原的方法利用健康產(chǎn)婦的胎盤無胎糞污染的周邊部分胎盤組織，經(jīng)清洗、 打碎、加胃蛋白酶消化、提取、混勻等處理后，可以制得無菌無副作用的人胎盤膠原。該方法采用胃蛋白酶進行消化作用，使得人胎盤中的蛋白含量降低，使得人胎盤制品的藥理作用范圍縮小，藥效降低。
授權(quán)公告號為CN1289164C的發(fā)明專利公開了一種胎盤素二氧化碳超臨界萃取方法，該萃取方法依次包括如下步驟將胎盤在_5°C -6°C條件下經(jīng)過冷凍干燥5 6h，研成粉末；將胎盤粉末裝入萃取釜中，通入30 40Mpa的二氧化碳，在30 40°C條件下萃??； 進行二級減壓分離，獲得胎盤素，一級減壓分離條件為8 12Mpa，溫度為30 35°C ；二級減壓分離條件為6Mpa以下，溫度為15 25°C。該發(fā)明方法提取胎盤素工藝復(fù)雜，制備工藝條件苛刻，需要特殊的提取設(shè)備，制備的胎盤制品的生產(chǎn)成本高，而且容易降低產(chǎn)品活性， 產(chǎn)品中的有些病毒不能被去除或滅活，致使產(chǎn)品的安全性降低。
授權(quán)公告號為CN100475841C的發(fā)明專利申請公開了一種注射用胎盤多肽的制備方法，該方法包括原料收集、研磨、破碎、病毒滅活、酸化水解、離心分離、澄清過濾、超濾、除菌過濾和凍干等步驟。該發(fā)明方法需要反復(fù)的低溫冷凍和高溫融合交替處理，以及在PH為 2-4的條件下長時間保溫處理，不僅制備工藝繁雜，而且在酸性條件下胎盤中的活性物質(zhì)的生物活性降低。
公開號CN101306018A的發(fā)明專利申請公開了一種超濃縮胎盤素組織液凍干膠囊的生產(chǎn)方法，包括a)將胎盤組織原液經(jīng)過二氧化碳超臨界流體萃取，得到胎盤素萃取物； b)利用生物酶處理所述胎盤素萃取物，將分子量降低到6000道爾頓以下；c)將步驟b)中得到的小分子萃取物冷凍干燥，得到凍干粉；以及d)采用脂質(zhì)體制備方法將所述凍干粉制成超濃縮胎盤素組織液凍干膠囊。
公開號為CN1110128A的發(fā)明專利申請公開了一種活性胎盤粉制備方法，該制備方法包括有預(yù)處理、冷凍粉碎、干燥、過篩等四個工藝流程，其中的干燥工藝采用了真空冷凍干燥技術(shù)。干燥工藝分為預(yù)凍、升華脫水(主干燥)、干燥(第二階段干燥)三個工藝步驟，其干燥溫度低于0°c，真空度為< 13. 3Pa。
公開號為CN1235026A的發(fā)明專利申請公開了一種胎盤肽注射液的制備方法及其所制產(chǎn)品。制備方法包括取胎盤用水冼凈、清理后制成勻漿，置反復(fù)凍融7-10次，在2-8°C 下離心20-30分鐘，取上清液經(jīng)透析或超濾，再用0. 22或0. 3微米的微孔濾膜過濾即得。該方法需要反復(fù)的低溫冷凍和高溫融合交替處理，特殊的透析設(shè)備，活性成分保留率低，產(chǎn)品的生產(chǎn)成本高。
授權(quán)公告號為CN1259059C的發(fā)明專利公開了一種胎盤提取物的制備方法，該方法包括取健康胎盤搗碎，用重量比1 1的20 95%乙醇浸泡1-7天，過濾，得濾液a; 加入1-5倍20-95%的乙醇，在_4°C 40°C陳化2 10天，過濾，得濾液b ；將濾液b陳化 2 5天，過濾，得濾液為胎盤提取物。該胎盤提取物的制備方法使用高濃度乙醇和長時間的高溫陳化處理，使得提取液中的活性成分含量降低，產(chǎn)品的生物活性減弱，影響提取液的藥理作用效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有問題提供一種人胎盤生物制劑的制備方法和由該方法制備的人胎盤生物制劑。本發(fā)明方法制備的人胎盤生物制劑在低溫下進行，產(chǎn)品中的活性成分含量高，產(chǎn)品的生物活性高，而且在低溫超聲提取過程中，影響產(chǎn)品質(zhì)量的病毒被去除、滅活，產(chǎn)品的安全性高。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種人胎盤組織液的制備方法，包括如下步驟
1)收集健康胎盤組織，將其依次用氯化鈉溶液進行浸泡，清水漂洗，得到預(yù)處理胎盤組織；
2)對預(yù)處理胎盤組織進行烘干處理，然后進行粉碎處理，制成粉碎胎盤；
3)粉碎胎盤與水混合后依次進行超聲提取、離心過濾，得到粗分胎盤組織液； 4)對粗分胎盤組織液進行酸水解，過濾，得到酸水解胎盤組織液；
5)首先向酸水解胎盤組織液中加入氯化鈉，調(diào)節(jié)酸水解胎盤組織液中的氯化鈉含量，然后進行堿水解，過濾，得到堿水解胎盤組織液；
6)調(diào)節(jié)堿水解胎盤組織液的PH后，進行精濾，得到精濾胎盤組織液；
7)對精濾胎盤組織液進行滅菌，即得。
其中，步驟1)所述的氯化鈉溶液的質(zhì)量百分比濃度為4_9%，健康胎盤組織與氯化鈉溶液的重量份之比為1 0.4-0.9。
特別是，清水漂洗后的胎盤組織用手擠壓沒有血跡。
其中，步驟2)中所述的烘干處理的溫度為40-50°C，烘干時間為8-10小時，烘干處理的相對真空度為-0. 08 -0. 095MPa。
特別是，進行所述的粉碎處理時控制粉碎溫度為30-40°C，粉碎胎盤的粒度小于 20目。
其中，步驟3)中所述粉碎胎盤與水的重量份之比為1 7-12;超聲提取溫度為 30-45 °C，超聲提取時間為60-80分鐘。
特別是，所述的水為注射用水。[0031]尤其是，超聲提取時的超聲波提取設(shè)備的功率2000W，脈沖頻率200Hz。
其中，步驟3)中采用離心分離過濾后的粗分胎盤組織液中的顆粒粒度小于或等于 1. 5um。
特別是，離心過濾的濾布孔徑小于或等于1. 5um。
其中，步驟4)中所述的酸水解包括如下順序進行的步驟
A)向粗分胎盤組織液中加入鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其pH為2. 6-3. 6 ；
B)對調(diào)節(jié)pH后的粗分胎盤組織液進行超聲處理，粗分胎盤組織液水解，其中，超聲處理溫度為40-50°C，超聲處理時間為20-40分鐘。
特別是，步驟A)中所述的鹽酸溶液的摩爾濃度為l-2mol/L，pH優(yōu)選為3. 0 ；
特別是，步驟4)中所述的過濾為板框過濾，板框過濾的濾布的孔徑為0. 8-1. Oum ；
尤其是，板框過濾過程中采用加壓過濾，加壓過濾的絕對壓力為l_2MPa。
其中，步驟5)中所述酸水解胎盤組織液中的氯化鈉的質(zhì)量百分比含量為 0. 8-0. 9%，優(yōu)選為 0. 85%。
特別是，步驟5)中所述的堿水解包括如下順序進行的步驟
A)向酸水解胎盤組織液中加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH為6. 8-8. 0 ；
B)對調(diào)節(jié)pH后的粗分胎盤組織液進行超聲處理，酸水解胎盤組織液水解，其中， 超聲處理溫度為40-50°C，超聲處理時間為20-40分鐘。
尤其是，步驟A)中所述的氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為l_2mol/L。
特別是，步驟5)中所述的過濾為采用微孔濾膜進行的過濾，微孔濾膜的孔徑為 0. 45-0. 65um ；
尤其是，采用減壓微孔過濾，減壓過濾的相對真空度為-0. 08 -0. 095MPa。
其中，步驟6)中將堿水解胎盤組織液的pH調(diào)節(jié)為7. 0后，采用0. 22um微孔濾膜進行所述的精濾。
其中，步驟7)中所述的滅菌溫度為114°C，滅菌時間為20-40分鐘。
特別是，采用整體滅菌柜進行所述的滅菌處理。
本發(fā)明另一方面提供一種按照上述方法制備而成的胎盤組織液。
本發(fā)明方法制備的胎盤組織液具有如下優(yōu)點
1、本發(fā)明方法制備的胎盤組織液在低溫條件下制備而成，產(chǎn)品中的活性成分含量高，產(chǎn)品的生物活性高。
2、本發(fā)明方法制備的胎盤組織液中影響產(chǎn)品質(zhì)量的病毒被去除、滅活，產(chǎn)品的安全性高。
3、本發(fā)明方法采用低溫超聲提取，生物活性成分提取完全，提取效率高，胎盤組織液中氮含量達到2-3g/L。
4、本發(fā)明方法工藝簡單，工藝控制條件溫和，生產(chǎn)設(shè)備普通，產(chǎn)品生產(chǎn)成本低。
具體實施方式
實施例1
1、篩選健康胎盤
收集健康產(chǎn)婦足月分娩的胎盤，經(jīng)乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒檢驗后，篩選病毒檢驗結(jié)果為陰性的胎盤作為原料，備用；
2、胎盤的浸泡、漂洗
首先將合格的胎盤組織浸入氯化鈉溶液中，浸泡去除胎盤中的血液、剔除血管、 黏膜以及臍帶，制得浸泡胎盤組織，其中，氯化鈉溶液的質(zhì)量百分比濃度為4%，浸泡時間為 4小時，胎盤組織與氯化鈉溶液的重量之比為1 0.4，浸泡溫度為18°C，相對濕度為45%;
然后將浸泡胎盤組織置于清水中漂洗，漂洗后的胎盤組織用手擠壓沒有血跡，得到漂洗胎盤組織，其中，漂洗溫度為18°C，相對濕度為45% ；
3、胎盤烘干
將漂洗胎盤組織濾干水分后置于FZG系列低溫真空干燥箱(南方歐制機械有限公司)內(nèi)進行烘干處理，得到烘干胎盤組織，其中，烘干溫度為40°C，烘干時間為9小時，烘干處理的相對真空度為-0. 09MPa ；
4、胎盤粉碎
將烘干胎盤組織采用自冷式降溫粉碎機(北京環(huán)亞天元機械有限公司)進行粉碎處理，制得粉碎胎盤，其中，粉碎處理的溫度為40°C，粉碎胎盤的粒度為20目；
5、提取胎盤組織液
將粉碎胎盤與注射用水混合后，置于HSOT超聲波提取設(shè)備中(山東濟寧恒盛制藥機械有限公司)中，加熱升溫，進行超聲提取，使胎盤組織液成分流出，得到胎盤組織液和胎盤組織剩余物，其中，粉碎胎盤與注射用水的重量之比為1 10，超生溫度為40°C，超聲提取時間為80分鐘，超聲提取設(shè)備的輸出功率2000W，脈沖頻率200Hz ；
6、胎盤組織液分離
將超聲提取后的胎盤組織液和胎盤組織剩余物置于離心機( )中進行離心處理，離心管內(nèi)設(shè)置有孔徑為1.5um的濾布，提取液置入濾布中，啟動離心機進行離心分離，使胎盤組織液與胎盤剩余物分離，得到澄清的粗分胎盤組織液，其中，離心處理的溫度為18°C，相對濕度為45%，離心處理的轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心時間為40分鐘，離心機的濾布孔徑為1. 5um，獲得的粗分胎盤組織液中去除了粒度大于1. 5um的顆粒；
7、酸水解
向粗分胎盤組織液中加入鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其pH值為3. 0后，置于HSOT系列超聲波提取機(山東濟寧恒盛制藥機械有限公司)中，加熱升溫，進行水解，得到酸水解胎盤組織液，其中，鹽酸溶液的摩爾濃度為lmol/L，水解溫度為40°C，水解時間為30分鐘；
將酸水解胎盤組織液冷卻、靜置24小時后，向水解胎盤組織液加入針用活性炭并混合均勻，置于板框過濾機中進行加壓過濾，得到胎盤組織液A，其中，每IL水解胎盤組織液中加入針用活性炭20g，針用活性炭的粒度為80-100目，板框過濾機的濾布的孔徑為 1. Oum，加壓過濾的絕對壓力為IMPa ；
8、堿水解
向胎盤組織液A中加入氯化鈉，使胎盤組織液A中的氯化鈉的質(zhì)量百分比含量為 0. 85%,接著再加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值為8. 0，然后將其置于HSOT系列超聲提取設(shè)備(山東濟寧恒盛制藥機械有限公司)中，加熱升溫，進行堿水解，得到堿水解胎盤組織液， 其中，氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為lmol/L，水解溫度為40°C，水解時間為40分鐘；
將堿水解胎盤組織液冷卻、靜置12小時后，將堿水解胎盤組織液進行減壓微孔濾膜過濾，得到胎盤組織液B，其中，微孔濾膜(購自南京金日制藥裝備有限公司)的孔徑為0. 65um，微孔過濾的溫度為18°C，相對濕度為45%，減壓微孔濾膜過濾的相對真空度為-0. 09MPa ；
9、精濾
向胎盤組織液B中加入鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其pH值至7. 0后，經(jīng)過0. 22um微孔濾膜進行精濾，得到淡黃色澄明的胎盤組織液C，其中，鹽酸溶液的摩爾濃度為lmol/L，精濾的溫度為18°C，相對濕度為45%，減壓精濾的相對真空度為-0. 09MPa ；
10、分裝
將胎盤組織液C以每瓶2ml定量分裝于5ml的安瓿瓶中，然后于6小時內(nèi)置于整體滅菌柜(張家港市環(huán)宇制藥設(shè)備公司)設(shè)備中，進行滅菌處理，得胎盤組織液，其中滅菌處理溫度為114°C，滅菌時間為30分鐘。
制得的胎盤組織液的pH為7. 0，總氮含量為2. Og/L。
實施例2
1、篩選健康胎盤
收集健康產(chǎn)婦足月分娩的胎盤，經(jīng)乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒檢驗后，篩選病毒檢驗結(jié)果為陰性的胎盤作為原料，備用；
2、胎盤的浸泡、漂洗
首先將合格的胎盤組織浸入氯化鈉溶液中，浸泡去除胎盤中的血液、剔除血管、 黏膜以及臍帶，制得浸泡胎盤組織，其中，氯化鈉溶液的質(zhì)量百分比濃度為6%，浸泡時間為 5小時，胎盤組織與氯化鈉溶液的重量之比為1 0.6，浸泡溫度為26°C，相對濕度為65%;
然后將浸泡胎盤組織置于清水中漂洗，漂洗后的胎盤組織用手擠壓沒有血跡，得到漂洗胎盤組織，其中，漂洗溫度為26°C，相對濕度為65% ；
3、胎盤烘干
將漂洗胎盤組織濾干水分后置于FZG系列低溫真空干燥箱(南方歐制機械有限公司)內(nèi)進行烘干處理，得到烘干胎盤組織，得到烘干胎盤組織，其中，烘干溫度為50°C，烘干時間為10小時，烘干處理的相對真空度為-0. 08MPa ；
4、胎盤粉碎
將烘干胎盤組織采用自冷式降溫粉碎機(北京環(huán)亞天元機械有限公司)進行粉碎處理，制得粉碎胎盤，其中，粉碎處理的溫度為35°C，粉碎胎盤的粒度為50目；
5、提取胎盤組織液
將粉碎胎盤與注射用水混合后，置于HSOT系列超聲波提取設(shè)備，進行超聲提取， 使胎盤組織液成分流出，提取胎盤組織液，得到胎盤組織混合液，其中，粉碎胎盤與注射用水的重量之比為1 12，超聲提取溫度為30°C，提取時間為70分鐘，超聲提取設(shè)備的輸出功率2000W，脈沖頻率200Hz ；
6、胎盤組織液分離
將超聲提取后的胎盤組織液和胎盤組織剩余物置于離心機中進行離心處理，離心管內(nèi)設(shè)置有孔徑為1.5um的濾布，提取液置入濾布中，啟動離心機進行離心分離，使胎盤組織液與胎盤剩余物分離，得到澄清的粗分胎盤組織液，其中，離心處理的溫度為26°C，相對濕度為65%，離心處理的轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm，離心時間為20分鐘，離心機的濾布孔徑為1. 5um，獲得的粗分胎盤組織液中去除了粒度大于1. 5um的顆粒；
7、酸水解
向粗分胎盤組織液中加入鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其pH值為2. 6后，置于HSOT系列超聲波提取機(山東濟寧恒盛制藥機械有限公司)中，加熱升溫加壓，進行水解，得到酸水解胎盤組織液，其中，鹽酸溶液的摩爾濃度為2mol/L，水解溫度為50°C，水解時間為20分鐘，超聲提取設(shè)備的輸出功率2000W，頻率200Hz ；
將酸水解胎盤組織液冷卻、靜置24小時后，置于板框過濾機中進行加壓過濾，得到胎盤組織液A，其中，板框過濾機的濾布的孔徑為0. 8um，加壓過濾的絕對壓力為2MPa ；
8、堿水解
向胎盤組織液A中加入氯化鈉，使胎盤組織液A中的氯化鈉的質(zhì)量百分比含量為 0. 85%,接著再加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值為6. 8，然后將其置于HSOT系列超聲提取設(shè)備(山東濟寧恒盛制藥機械有限公司)中，加熱升溫加壓，進行堿水解，得到堿水解胎盤組織液，其中，氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為1. 5mol/L，水解溫度為50°C，水解時間為20分鐘；
將堿水解胎盤組織液冷卻、靜置12小時后，將堿水解胎盤組織液進行減壓微孔濾膜過濾，得到胎盤組織液B，其中，微孔濾膜(購自南京金日制藥裝備有限公司)的孔徑為0. 45um，微孔過濾的溫度為26°C，相對濕度為65%，減壓微孔濾膜過濾的相對真空度為-0. 09MPa ；
9、精濾
向胎盤組織液B中加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值至7. 0后，經(jīng)過0. 22um微孔濾膜進行精濾，得到淡黃色澄明的胎盤組織液C，其中，氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為0. 5mol/ L，精濾的溫度為26°C，相對濕度為65%，減壓精濾的相對真空度為-0. 09MPa ；
10、分裝
將胎盤組織液C以每瓶2ml定量分裝于5ml的西林瓶中，然后于6小時內(nèi)置于整體滅菌柜(張家港市環(huán)宇制藥設(shè)備公司)設(shè)備中，進行滅菌處理，得胎盤組織液，其中滅菌處理溫度為114°C，滅菌時間為30分鐘。
制得的胎盤組織液的pH為7. 0，總氮含量為2. 5g/L。
實施例3
1、篩選健康胎盤
收集健康產(chǎn)婦足月分娩的胎盤，經(jīng)乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒檢驗后，篩選病毒檢驗結(jié)果為陰性的胎盤作為原料，備用；
2、胎盤的浸泡、漂洗
首先將合格的胎盤組織浸入氯化鈉溶液中，浸泡去除胎盤中的血液、剔除血管、 黏膜以及臍帶，制得浸泡胎盤組織，其中，氯化鈉溶液的質(zhì)量百分比濃度為9%，浸泡時間為4. 5小時，胎盤組織與氯化鈉溶液的重量之比為1 0.9，浸泡溫度為22°C，相對濕度為 55% ；
然后將浸泡胎盤組織置于清水中漂洗，漂洗后的胎盤組織用手擠壓沒有血跡，得到漂洗胎盤組織，其中，漂洗溫度為22°c，相對濕度為55% ；
3、胎盤烘干
將漂洗胎盤組織濾干水分后置于FZG系列低溫真空干燥箱內(nèi)進行烘干處理，得
11到烘干胎盤組織，其中，烘干溫度為45°C，烘干時間為8. 5小時，烘干處理的相對真空度為-0. 09MPa ；
4、胎盤粉碎
將烘干胎盤組織采用自冷式降溫粉碎機進行粉碎，制得粉碎胎盤，其中，粉碎處理的溫度為30°C，粉碎胎盤的粒度為30目；
5、提取胎盤組織液
將粉碎胎盤與注射用水混合后，置于HSOT超聲波提取設(shè)備中(山東濟寧恒盛制藥機械有限公司)中，加熱升溫，進行超聲提取，使胎盤組織液成分流出，得到胎盤組織液和胎盤組織剩余物，其中，粉碎胎盤與注射用水的重量之比為1 7，超聲提取溫度為45°C，提取時間為60分鐘，超聲提取時的相對濕度為55%，超聲提取設(shè)備的輸出功率為2000W，頻率為 200Hz ；
6、胎盤組織液分離
將超聲提取后的胎盤組織液和胎盤組織剩余物置于離心機中進行離心處理，離心管內(nèi)設(shè)置有孔徑為1. 5um的濾布，提取液置入濾布中，啟動離心機進行離心分離，使胎盤組織液與胎盤剩余物分離，得到澄清的粗分胎盤組織液，其中，離心處理的溫度為22°C，相對濕度為55%，離心處理的轉(zhuǎn)速為7500rpm，離心時間為30分鐘，離心機的濾布孔徑為1. 5um， 獲得的粗分胎盤組織液中去除了粒度大于1. 5um的顆粒；
7、酸水解
向粗分胎盤組織液中加入鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其pH值為3. 6后，置于HSOT系列超聲波提取機中，加熱升溫，進行酸水解，得到酸水解胎盤組織液，其中，鹽酸溶液的摩爾濃度為 1. 5mol/L，水解溫度為45°C，水解時間為40分鐘；
將酸水解胎盤組織液冷卻、靜置24小時后，向水解胎盤組織液加入針用活性炭并混合均勻，置于板框過濾機中進行加壓過濾，得到胎盤組織液A，其中，每IL水解胎盤組織液中加入針用活性炭10g，用活性炭的粒度為80-100目，板框過濾機的濾布的孔徑為 1. Oum，加壓過濾的絕對壓力為1. 5MPa ；
8、堿水解
向胎盤組織液A中加入氯化鈉，使胎盤組織液A中的氯化鈉的質(zhì)量百分比含量為 0. 85%,接著再加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值為7. 4，然后將其置于HSOT系列超聲提取設(shè)備中，加熱升溫，進行堿水解，得到堿水解胎盤組織液，其中，氫氧化鈉溶液的摩爾濃度為 2mol/L，水解溫度為45°C，水解時間為30分鐘；
將堿水解胎盤組織液冷卻、靜置12小時后，將堿水解胎盤組織液進行減壓微孔濾膜過濾，得到胎盤組織液B，其中，其中，微孔濾膜(購自南京金日制藥裝備有限公司)的孔徑為0. 65um，微孔過濾的溫度為22°C，相對濕度為55 %，減壓過濾的相對真空度為-0. 095MPa ；
9、精濾
向胎盤組織液B中加入鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其pH值至7. O后，經(jīng)過0. 22um微孔濾膜進行精濾，得到淡黃色澄明的胎盤組織液C，其中，鹽酸溶液的摩爾濃度為l.Omol/L，精濾的溫度為22°C，相對濕度為55% ；
10、分裝[0129]將胎盤組織液C以每瓶2ml定量分裝于5ml的西林瓶中，然后于6小時內(nèi)置于整體滅菌柜(張家港市環(huán)宇制藥設(shè)備公司)設(shè)備中，進行滅菌處理，得胎盤組織液，其中滅菌處理溫度為114°C，滅菌時間為30分鐘。
制得的胎盤組織液的pH為7. 0，總氮含量為3. Og/L。
權(quán)利要求
1.一種胎盤組織液的制備方法，其特征在于，制備步驟如下(1)選取健康胎盤，在質(zhì)量百分比為4 9%的氯化鈉溶液中浸泡4 5小時后用清水漂洗，得到漂洗胎盤組織，其中，所述胎盤與所述氯化鈉溶液的重量比為1 0.4 0.9，浸泡時的浸泡溫度為18 26°C，相對濕度為45% 65% ；漂洗時的漂洗溫度為18 26°C， 相對濕度為45% 65% ；(2)將所述漂洗胎盤組織在40 50°C進行烘干處理8.5 10小時，并將得到的烘干胎盤組織在30 40°C粉碎，得到粉碎胎盤，其中，烘干處理的相對真空度為-0. 09 -0. 08MPa,所述粉碎胎盤的粒度為20 50目；(3)將所述粉碎胎盤與注射用水按重量比為1 7 12的比例混合后，在30 45°C 進行超聲波提取60 80分鐘，然后將提取所得的胎盤組織混合液置于離心機中進行離心過濾20 40分鐘，得粗分胎盤組織液，其中，所述胎盤組織混合液包括超聲波提取的胎盤組織液和胎盤剩余物，離心處理的溫度為18 26°C，相對濕度為45% 65%，離心速度為 5000 lOOOOrpm，所述離心機的濾布孔徑為1. 5 μ m ；(4)向所述粗分胎盤組織液中加入摩爾濃度為1 2mol/L的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)混合液的 PH值為2. 6 3. 6，加熱至40 50°C，并保持溫度水解20 40分鐘，得酸水解胎盤組織液；(5)在將所述酸水解胎盤組織液冷卻、靜置24小時后采用孔徑為0.8 1. 0 μ m的濾布以1 2MPa的絕對壓力加壓過濾，然后向所得濾液中加入氯化鈉并使氯化鈉在濾液中的質(zhì)量百分比為0.8% 0.9%，接著加入摩爾濃度為1 2mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其PH 值為6. 8 8. 0，加熱至40 50°C，并保持溫度水解20 40分鐘，得堿水解胎盤組織液；(6)在將所述堿水解胎盤組織液冷卻、靜置12小時后采用孔徑為0.45 0. 65 μ m的微孔濾膜微減壓過濾，所述微減壓過濾溫度為18 26°C，相對濕度為45% 65%，相對真空度為-0. 095 -0. 09MPa ；當(dāng)所得濾液PH值小于7. 0時，向所得濾液中加入摩爾濃度為0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，使其PH值為7.0，當(dāng)所得濾液PH值大于7. 0時，向所得濾液中加入摩爾濃度為1. Omol/L的鹽酸，使其PH 值為7.0，然后采用孔徑為0. 22 μ m的微孔濾膜進行精濾，得精濾胎盤組織液，其中，精濾的溫度為18 26°C，相對濕度為45% 65% ；(7)對所述精濾胎盤組織液進行滅菌處理，得胎盤組織液，其中，滅菌處理溫度為 114°C，滅菌時間為30分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的胎盤組織液的制備方法，其特征在于，制備步驟如下(1)選取健康人胎盤，在質(zhì)量百分比為4%的氯化鈉溶液中浸泡4小時后用清水漂洗， 得到漂洗胎盤組織，其中，所述胎盤與所述氯化鈉溶液的重量比為1 0.4，浸泡時的浸泡溫度為18°C，相對濕度為45% ；漂洗時的漂洗溫度為18°C，相對濕度為45% ；(2)將所述漂洗胎盤組織在40°C進行烘干處理9小時，并將得到的烘干胎盤組織在 40°C粉碎，得到粉碎胎盤，其中，烘干處理的相對真空度為-0. 09MPa，所述粉碎胎盤的粒度為20目；(3)將所述粉碎胎盤與注射用水按重量比為1 10的比例混合后，在40°C進行超聲波提取80分鐘，然后將提取所得的胎盤組織混合液置于離心機中進行離心過濾40分鐘，得粗分胎盤組織液，其中，離心處理的溫度為18°C，相對濕度為45%，離心速度為5000rpm ；(4)向所述粗分胎盤組織液中加入摩爾濃度為lmol/L的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其PH值為 3. 0，加熱至40°C，并保持溫度水解30分鐘，得酸水解胎盤組織液；(5)將所述酸水解胎盤組織液冷卻、靜置，并向水解胎盤組織液中以20g/L的分量加入粒度為80 100目的針用活性炭，混合均勻后，采用孔徑為1. 0 μ m的濾布以IMPa的絕對壓力加壓過濾，然后向所得濾液中加入氯化鈉并使氯化鈉在濾液中的質(zhì)量百分比為0. 85%, 接著加入摩爾濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其PH值為8. 0，加熱至40°C，并保持溫度水解40分鐘，得堿水解胎盤組織液；(6)在將所述堿水解胎盤組織液冷卻、靜置后采用孔徑為0.65 μ m的微孔濾膜微減壓過濾，所述微減壓過濾溫度為18°C，相對濕度為45%，相對真空度為-0. 09MPa，并向所得濾液中加入摩爾濃度為lmol/L的鹽酸，使其PH值為7. 0，然后進行精濾，得精濾胎盤組織液， 其中，精濾溫度為18°C，相對濕度為45%，相對真空度為-0. 09MPa ；(7)對所述精濾胎盤組織液進行滅菌處理，得胎盤組織液。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的胎盤組織液的制備方法，其特征在于，制備步驟如下(1)選取健康人胎盤，在質(zhì)量百分比為6%的氯化鈉溶液中浸泡5小時后用清水漂洗， 得到漂洗胎盤組織，其中，所述胎盤與所述氯化鈉溶液的重量比為1 0.6，浸泡時的浸泡溫度為26°C，相對濕度為65% ；漂洗時的漂洗溫度為26°C，相對濕度為65% ；(2)將所述漂洗胎盤組織在50°C進行烘干處理10小時，并將得到的烘干胎盤組織在 35°C粉碎，得到粉碎胎盤，其中，烘干處理的相對真空度為-0. 08MPa，所述粉碎胎盤的粒度為50目；(3)將所述粉碎胎盤與注射用水按重量比為1 12的比例混合后，在30°C進行超聲波提取70分鐘，然后將提取所得的胎盤組織混合液置于離心機中進行離心過濾20分鐘，得粗分胎盤組織液，其中，離心處理的溫度為26°C，相對濕度為65%，離心速度為IOOOOrpm ；(4)向所述粗分胎盤組織液中加入摩爾濃度為2mol/L的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其PH值為 2. 6，加熱至50°C，并保持溫度水解20分鐘，得酸水解胎盤組織液；(5)在將所述酸水解胎盤組織液冷卻、靜置后采用孔徑為0.8μπι的濾布以2MPa的絕對壓力加壓過濾，然后向所得濾液中加入氯化鈉并使氯化鈉在濾液中的質(zhì)量百分比為 0. 85%,接著加入摩爾濃度為1. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其PH值為6. 8，加熱至50°C， 并保持溫度水解20分鐘，得堿水解胎盤組織液；(6)在將所述堿水解胎盤組織液冷卻、靜置后采用孔徑為0.45 μ m的微孔濾膜微減壓過濾，所述微減壓過濾溫度為26°C，相對濕度為65%，相對真空度為-0. 09MPa，并向所得濾液中加入摩爾濃度為0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液，使其PH值為7. 0，然后進行精濾，得精濾胎盤組織液，其中，精濾溫度為26°C，相對濕度為65%，相對真空度為-0. 09MPa ；(7)對所述精濾胎盤組織液進行滅菌處理，得胎盤組織液。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的胎盤組織液的制備方法，其特征在于，制備步驟如下(1)選取健康人胎盤，在質(zhì)量百分比為9%的氯化鈉溶液中浸泡4. 5小時后用清水漂洗，得到漂洗胎盤組織，其中，所述胎盤與所述氯化鈉溶液的重量比為1 0.9，浸泡時的浸泡溫度為22°C，相對濕度為55% ；漂洗時的漂洗溫度為22°C，相對濕度為55% ；(2)將所述漂洗胎盤組織在45°C進行烘干處理8.5小時，并將得到的烘干胎盤組織在 30°C粉碎，得到粉碎胎盤，其中，烘干處理的相對真空度為-0. 09MPa，所述粉碎胎盤的粒度為30目；(3)將所述粉碎胎盤與注射用水按重量比為1 7的比例混合后，在45°C進行超聲波提取60分鐘，然后將提取所得的胎盤組織混合液置于離心機中進行離心過濾30分鐘，得粗分胎盤 組織液，其中，離心處理的溫度為22°C，相對濕度為55%，離心速度為7500rpm ；(4)向所述粗分胎盤組織液中加入摩爾濃度為1.5mol/L的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)其PH值為 3. 6，加熱至45°C，并保持溫度水解40分鐘，得酸水解胎盤組織液；(5)在將所述酸水解胎盤組織液冷卻、靜置后，向水解胎盤組織液中以10g/L的分量加入粒度為80 100目的針用活性炭，并混合均勻，然后采用孔徑為1. 0 μ m的濾布以1. 5MPa 的絕對壓力加壓過濾，再向所得濾液中加入氯化鈉并使氯化鈉在濾液中的質(zhì)量百分比為 0. 85%,接著加入摩爾濃度為2mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)其PH值為7. 4，加熱至45°C，并保持溫度水解30分鐘，得堿水解胎盤組織液；(6)在將所述堿水解胎盤組織液冷卻、靜置后采用孔徑為0.65 μ m的微孔濾膜微減壓過濾，所述微減壓過濾溫度為22°C，相對濕度為55%，相對真空度為-0. 095MPa,向所得濾液中加入摩爾濃度為1. Omol/L的鹽酸，使其PH值為7. 0，然后進行精濾，得精濾胎盤組織液，其中，精濾溫度為22°C，相對濕度為55% ；(7)對所述精濾胎盤組織液進行滅菌處理，得胎盤組織液。
5. 一種胎盤組織液，其特征在于，利用權(quán)利要求
1至4任意一項所述的方法制備得到。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種胎盤組織液的制備方法，該方法包括如下順序進行的步驟1)收集健康胎盤組織，依次用氯化鈉溶液進行浸泡，清水漂洗，得到預(yù)處理胎盤組織；2)對預(yù)處理胎盤組織進行烘干、粉碎，制成粉碎胎盤；3)粉碎胎盤與水混合后依次進行超聲提取、離心過濾，得到粗分胎盤組織液；4)對粗分胎盤組織液進行酸水解，過濾，得到酸水解胎盤組織液；5)向酸水解胎盤組織液中加入氯化鈉，調(diào)節(jié)氯化鈉含量后，進行堿水解，過濾，得到堿水解胎盤組織液；6)調(diào)節(jié)堿水解胎盤組織液pH，進行精濾，得到精濾胎盤組織液；7)對精濾胎盤組織液進行滅菌。本發(fā)明方法工藝簡單，條件溫和，產(chǎn)品中的活性成分含量高，活性高，安全性好，產(chǎn)品生產(chǎn)成本低。
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公開日2012年2月15日 申請日期2009年10月30日
發(fā)明者葛龍海 申請人:葛龍海導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),