專利名稱：:攜帶雙鏈rna靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗的制作方法攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗，該疫苗可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移、免疫和疫苗接種，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
慢病毒是一種RNA病毒，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，因其病毒顆粒中含有依賴RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶而得名。慢病毒基因主要編碼gag,pol和env3個(gè)基本的結(jié)構(gòu)蛋白，以及4個(gè)輔助蛋白和2個(gè)調(diào)節(jié)蛋白。該科病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV),猴免疫缺陷病毒(SIV)，白血病病毒等，其中以HIV-I的研究最多，并在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上發(fā)展出慢病毒載體系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)等方面的研究[1-3]。慢病毒載體的構(gòu)建的基本原理就是將HIV-I基因組中的順式作用元件和編碼反式作用因子的序列進(jìn)行分離。整個(gè)載體系統(tǒng)由包裝部分和載體部分構(gòu)成包裝部分去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列，但能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體部分則含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV-I順式作用序列，并具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。載體包含的結(jié)構(gòu)基因包括編碼病毒的核心蛋白的gag基因，基因編碼病毒復(fù)制所需酶類的pol，編碼病毒的包膜糖蛋白的env基因，以及編碼切割蛋白前體所需的蛋白酶的pro基因[4]。1996年，為了進(jìn)一步降低兩部分基因發(fā)生同源重組而生成具有復(fù)制能力的病毒的可能性，Naldini等人采用表達(dá)水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的質(zhì)粒和雙嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的質(zhì)粒，取代表達(dá)HIV本身包膜蛋白Env的質(zhì)粒，包裝獲得了以HIV-Igagpol為骨架，以VSV-G或MLV-E蛋白作為包膜的嵌合病毒。該方案突破了最初的HIV-I載體僅對(duì)CD4+細(xì)胞的親嗜性限制，并且病毒滴度可達(dá)到IO7108TU/ml。這為采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行其他病毒的包膜蛋白功能研究提供了方便[5-6]。通過對(duì)載體序列的優(yōu)化和改造，慢病毒載體作為基因治療工具已有大量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[7-9]。與其他病毒載體相比，其優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)為1.能高效轉(zhuǎn)導(dǎo)廣泛的細(xì)胞(包括DC細(xì)胞)。2.針對(duì)載體骨架的免疫原性較弱，可多次反復(fù)加強(qiáng)免疫。3.體外轉(zhuǎn)導(dǎo)特異抗原的DC可引起較強(qiáng)的體內(nèi)外細(xì)胞應(yīng)答。但是，單純采用慢病毒載體作為疫苗，其需要能夠穩(wěn)定、永久地整合到宿主染色體上,通過持續(xù)表達(dá)目的蛋白刺激機(jī)體才能產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng),從生物安全性方面而言，這是一個(gè)極大的缺陷。所以，本發(fā)明著眼于采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞包裝獲得的假型病毒顆粒作為疫苗應(yīng)用[10-12]。Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLR)是參與非特異性免疫的一類極其重要的蛋白受體，是連接天然免疫和特異性免疫的橋梁。當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時(shí)，TLR可以識(shí)別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答。新近研究發(fā)現(xiàn)，病毒復(fù)制的中間產(chǎn)物雙鏈RNA能被TLR3特異識(shí)別，通過激活NF-κB和干擾素IFN-β前體誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放I型干擾素，從而增強(qiáng)抗原特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞，激活抗病毒天然免疫[13-16]。因此本發(fā)明將能編碼病原蛋白的雙鏈RNA引入假病毒顆粒，一方面可利用其與TLR3的結(jié)合激活天然免疫，另一方面可通過介導(dǎo)其在宿主細(xì)胞的表達(dá)從而誘導(dǎo)產(chǎn)生病原特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明具有以下特點(diǎn)1.利用反式互補(bǔ)技術(shù)，可利用慢病毒載體快速獲得攜帶天然構(gòu)象中和抗原的假型病毒顆粒，并可對(duì)包膜蛋白進(jìn)行人工突變快速獲得相應(yīng)的病毒樣顆粒。2.與其他蛋白亞單位疫苗相比，假病毒顆粒更穩(wěn)定，并可通過超離方法或超濾濃縮純化。3.對(duì)于難以培養(yǎng)或表達(dá)的病毒糖蛋白以及存在生物安全隱患的病毒，假病毒顆粒的制備是一種可選擇的替代途徑。4.結(jié)合雙鏈RNA佐劑效應(yīng)的假病毒顆粒疫苗可兼顧病毒顆粒樣(VLP)疫苗與DNA疫苗兩者的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)激發(fā)天然免疫，和抗原特異的體液免疫與細(xì)胞免疫，可以用于多次同型或異型疫苗聯(lián)合免疫?；谝陨咸攸c(diǎn)，通過基因改造獲得攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移、免疫和疫苗接種相關(guān)應(yīng)用具有良好的前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種免疫效果好、安全、制備周期短的采用假型慢病毒顆粒的新型疫苗及其制備方法。該型疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液與細(xì)胞雙重免疫應(yīng)答，可用于防治HCV，流行性感冒等病毒感染性疾病。在本發(fā)明的第一方面，提供了包裝獲得假型慢病毒顆粒所需的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。具體包括I.包裝質(zhì)粒PCMVDR8.2D64E:整合酶區(qū)域第64位氨基酸D(GAT)突變?yōu)镋(GAG)，使其成為整合酶缺陷的包裝載體。2.轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒PCS:具有自我滅活特性的并且?guī)в凶魟┗?，除此之外還可選擇插入其他抗原蛋白基因或報(bào)告基因。其攜帶的表達(dá)基因?qū)㈦S假病毒顆粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。3.表達(dá)質(zhì)粒包含完整的病原包膜蛋白基因系列，可高效表達(dá)目的病原的包膜蛋白。所述的表達(dá)質(zhì)粒，可在包括pVRC、phCMV、pcDNA3.I、pcDNA6.0、pCIneo(+)、pReceiver等真核表達(dá)質(zhì)粒中進(jìn)行優(yōu)選。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種假型慢病毒顆粒，它由權(quán)利要求I所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后表達(dá)形成，除含有按要求插入病原蛋白編碼序列外不含慢病毒核苷酸。所述的靶細(xì)胞包括BHK21、293、239T、Hela等來源于真核生物的傳代細(xì)胞系。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合，它含有上述重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的假型慢病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的佐劑或載體。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明的假型慢病毒顆粒的用途，用于制備預(yù)防和治療丙型肝炎或流感的藥物。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備假型慢病毒顆粒的方法，包括以下步驟I)將權(quán)利要求I所述的含有病原微生物結(jié)構(gòu)蛋白編碼序列的重組表達(dá)質(zhì)粒對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。2)當(dāng)所述的祀細(xì)胞充分表達(dá)抗原結(jié)構(gòu)蛋白時(shí),收獲細(xì)胞上清。3)將上清過濾去除細(xì)胞碎片后，采用蔗糖超速離心對(duì)病毒進(jìn)行分離富集，亦可采用免疫親和層析進(jìn)行分離純化。藥物組合本發(fā)明所述的藥用組合物可以包含實(shí)際使用時(shí)所選用的藥學(xué)上可以接受的緩沖齊U，也包含用于預(yù)定用途的其它物質(zhì)。本領(lǐng)域已有多種緩沖劑適用于預(yù)定用途，本領(lǐng)域的技術(shù)人員都善于選擇的緩沖劑。在一些實(shí)例中，該藥用組合可以含有藥學(xué)上可接受的保濕齊U，藥學(xué)上可接受的各種保濕劑在多種公開出版物都有敘述，包括如中華人民共和國藥典(2010版)。所述的藥用組合物可制備出各種劑型，如注射劑、片劑、丸劑、膠囊、噴霧劑等。適用于局部使用和口服的藥用級(jí)別的有機(jī)或無機(jī)載體或稀釋劑。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植物性和動(dòng)物性油脂。還可用穩(wěn)定劑、乳化劑、維持PH值的各種緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑等作為輔助材料。當(dāng)本發(fā)明用作疫苗時(shí)，假型慢病毒顆粒疫苗可采用多種方法進(jìn)行配制。通常情況下，按本領(lǐng)域熟知的各種方法，用藥學(xué)上可以接受的載體或運(yùn)載體配制本發(fā)明的疫苗。合適的藥用載體包括無菌生理鹽水，也可用其它無菌的水性和非水性的等滲注射液，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥學(xué)上可接受的載體。配制本發(fā)明的疫苗組合物時(shí)還可含有其它成分，如佐劑、穩(wěn)定劑、PH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等。這些成分都是疫苗領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。佐劑包括(但不限于)鋁鹽佐劑、皂苷佐劑、CpG佐劑等。穩(wěn)定劑包括(但不限于)精氨酸、乙基纖維素、多元醇、氨基酸、無機(jī)鹽、PEG等。給藥途徑與劑量當(dāng)用作疫苗時(shí)，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將本發(fā)明的假型慢病毒顆粒疫苗施用于個(gè)體。通常采用與常規(guī)疫苗相同的施用途徑或模擬病毒感染的途徑施用這些疫苗。采用疫苗組合物的形式時(shí)，除含有假型慢病毒顆粒外，還可包括藥學(xué)上可以接受的載體、佐齊U、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑等。給藥常規(guī)與途徑包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、靜脈注射、經(jīng)口服等，如果需要也可采用組合給藥途徑。疫苗組合物的給用劑量可以單劑量，也可多劑量，且可給予加強(qiáng)劑量以維持被施用個(gè)體的免疫力。在所選用的給藥途徑中，應(yīng)以"有效劑量"為給予假型慢病毒顆粒疫苗的量，足以引發(fā)被施用個(gè)體的免疫應(yīng)答，能有效保護(hù)被施用個(gè)體抵抗目的病原微生物的感染。所述的有效劑量，是指在疫苗組合物中所選用的假型慢病毒顆粒疫苗的量是按可引發(fā)個(gè)體免疫保護(hù)性應(yīng)答而無明顯的副作用的量確定。本發(fā)明以疫苗組分中P24蛋白抗原的定量為基礎(chǔ)計(jì)算有效劑量，該劑量包括例如相當(dāng)于O.5ng至5000ngp24抗原的載體顆粒。在小鼠中，優(yōu)選劑量可為O.5ng至50ng，而在馬中優(yōu)選劑量可為50ng至500ng。具體疫苗的最佳用量可通過實(shí)驗(yàn)免疫后觀察對(duì)象的抗體滴度和其它反應(yīng)來確定，通過檢測(cè)疫苗提供的免疫力水平來確定是否需要增強(qiáng)劑量，施用佐劑或免疫刺激劑可提高本發(fā)明假病毒顆粒的免疫應(yīng)答，這些都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，建立了假型慢病毒顆粒疫苗制備技術(shù)，并快速制備獲得了安全性好、免疫效價(jià)高的假型慢病毒顆粒疫苗，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I.提高了免疫的有效性假型慢病毒顆粒表面預(yù)免疫病原微生物的主要包膜蛋白成分，免疫宿主個(gè)體后可以產(chǎn)生對(duì)目的病原的免疫活性。并且由于假病毒的組織親嗜性和感染過程與真病毒相同，因此可以模擬天然病毒的早期感染過程，有效刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答。2.提高了疫苗的安全性。[0032]本發(fā)明的假型慢病毒顆粒所含的核酸僅為單一抗原基因，為一過性表達(dá)，不具有復(fù)制和再度感染的能力，并且在載體構(gòu)建過程中對(duì)載體的整合酶進(jìn)行了功能缺失，極大的降低了載體隨機(jī)整合的可能性，從而可以最大程度地降低疫苗使用的風(fēng)險(xiǎn)。3.操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短。在構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后收獲上清，再經(jīng)離心分離或過柱純化即可獲得該顆粒疫苗。步驟過程簡(jiǎn)單，從獲得病原包膜蛋白基因到獲得假型病毒顆粒，規(guī)范操作的周期僅為一周左右，并且擴(kuò)增規(guī)模可以通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量進(jìn)行量化控制，非常適合應(yīng)急病原疫苗的制備。圖I:HCV假病毒顆粒包裝系統(tǒng)的制備與鑒定a為包裝質(zhì)粒pCMVDR8.2D64E的結(jié)構(gòu)圖示及，突變后測(cè)序結(jié)果山為轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒pCS(pCS-NS3為例)結(jié)構(gòu)示意，及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的表達(dá)鑒定結(jié)果；c為表達(dá)質(zhì)粒PVRC-E1E2的結(jié)構(gòu)示意，及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的表達(dá)鑒定結(jié)果。圖2:HCV假病毒顆粒及其鑒定a為包裝獲得的假病毒顆粒結(jié)構(gòu)示意圖b為負(fù)染電鏡顯示的病毒顆粒形態(tài)；c和d為濃縮的病毒顆粒進(jìn)行westernblot鑒定E2，P24,NS3的結(jié)果。圖3=HCV假病毒疫苗免疫后的體液免疫反應(yīng)測(cè)定a為單獨(dú)采用HCV假病毒顆粒免疫，第二針與第四針免疫后采血檢測(cè)的小鼠針對(duì)HCVE1，E2，NS3的特異性抗體水平；b為添加佐劑后第二，三，四針后檢測(cè)的抗體水平。兩者顯示隨著免疫次數(shù)的增加，抗體水平逐漸提高，而且不添加佐劑的抗體水平與添加組相似，說明本疫苗單純免疫及有很好的免疫增強(qiáng)效果。圖4=HCV假病毒疫苗免疫后的細(xì)胞免疫反應(yīng)測(cè)定采用ELISP0T檢測(cè)HCV假病毒顆粒疫苗免疫四針后小鼠針對(duì)HCVEl,E2，NS3的特異性T細(xì)胞免疫水平。具體實(shí)施方式下面以HCV假型慢病毒顆粒疫苗作為具體實(shí)施實(shí)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡明。應(yīng)當(dāng)指出，這些實(shí)例僅用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的適用范圍。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社，2005)等本領(lǐng)域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產(chǎn)廠家所建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例I:假病毒包裝系統(tǒng)的制備I.I整合酶缺陷的包裝質(zhì)粒pCMVDR8.2D64E的制備根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道，將包裝質(zhì)粒pHR’CMVAR8.2中聚合酶區(qū)域第64位氨基酸D(GAT)突變?yōu)镋(GAG)，可以使整合酶活性喪失，卻不影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率[17，18]。具體流程如下I)將pHR’CMVΔR8.2質(zhì)粒與含突變序列的pNL_IND64E質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化甲基化缺陷的E.coliK12細(xì)菌感受態(tài)2)質(zhì)粒提取后均采用SalI和BclI雙酶切，切膠回收pHR’CMVΛR8.2中的IOkb片段和PNL-IND64E中的3.4kb片段。[0046]3)將上述回收片段以I:5的摩爾比例連接后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)。4)提取質(zhì)粒酶切鑒定后測(cè)序確認(rèn)。I.2轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒PCS-CG-NS3的制備及表達(dá)能力鑒定根據(jù)模板質(zhì)粒PUC-H155序列設(shè)計(jì)引物，上下游引物各引入酶切位點(diǎn)。引物為NS3-5:TCTGCTAGCTGGTGGTGCTGGATATCAT(NheI)；NS3-3TCACTCGAGCATTAGGTCACCACTTCCA(XhoI)。將引物用無菌水稀釋成10μΜ,反應(yīng)體系為pfxDNApolymeraselμI,dNTP(2.5mΜ)6μI,IOXAmp.buffer5μI,模板5叩，1^041111，引物各2111，模板5^，無菌水補(bǔ)足至5(^1。？0反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min；94°C30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin15PCR產(chǎn)物經(jīng)I%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小，片段大小預(yù)期約為1900bp。切膠回收，取55μ1Elutionbuffer洗脫,瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)濃度約為IOOng/μI。用NheI和XhoI分別酶切PCR產(chǎn)物和載體pCS_CG，酶切體系如下PCR產(chǎn)物(NS3)I.5μg，酶NheI和XhoI各I.5μ1,10Xbuffer25y1，BSA0.5μI，無菌水補(bǔ)至50μI；載體pCS-CG取2μg，酶NheI和XhoI各2μ1，10Xbuffer25y1，BSAO.5μI，無菌水補(bǔ)至50μI;37°C酶切2h。I%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收。將回收的載體和片段于16°C連接過夜轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，同時(shí)設(shè)載體對(duì)照和自連對(duì)照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的單克隆菌落做菌落PCR初步鑒定正確后，提質(zhì)粒酶切以及測(cè)序進(jìn)一步鑒定其正確性。在經(jīng)多克隆篩選及測(cè)序鑒定無誤后，大量擴(kuò)增獲得超純無內(nèi)毒素質(zhì)粒。取適量質(zhì)粒對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，通過特異性單克隆抗體檢測(cè)可見在相應(yīng)位置有明顯的陽性條帶(圖lb)。按脂質(zhì)體試劑說明書(Lipofectamine2000,Invitrogen)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，具體方法如下I)轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293FT細(xì)胞，以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5X105細(xì)胞/ml，重新接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后待細(xì)胞融合度達(dá)70%-80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。2)轉(zhuǎn)染前2h將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。3)向一滅菌離心管中加入所制備的各質(zhì)粒溶液(pCMVDR8.2D64E載體8μg，PCS-NS3質(zhì)粒4μg.pCMV-CElE2質(zhì)粒4μg)。與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為O.3時(shí)，在室溫下孵育5分鐘。4)將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻，取50μILipofectamine2000試劑在另一管中與O.3mlOpti-MEM混合，在室溫下孵育5min。5)把稀釋后的質(zhì)粒與稀釋后的Lipofectamine2000進(jìn)行混合,輕輕地混勻后，室溫孵育15min。6)將Lipofectamine2000與質(zhì)粒混合液小心加入至293FT細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7)培養(yǎng)8h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入5ml的pH值為7.4的PBS液，輕輕洗去殘余的轉(zhuǎn)染混和物后倒去。8)每瓶細(xì)胞中加入5ml含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞后，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的SDS-PAGE方法進(jìn)行樣品處理和電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用小鼠抗NS3的單克隆抗體作一抗，IRdye-800cw標(biāo)記的兔抗小鼠抗體(Licor公司)作二抗進(jìn)行免疫印跡(Westernblot)鑒定,有特異性抗原表達(dá)者為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。附圖Ib顯示了Westernblot鑒定結(jié)果,說明質(zhì)粒能有效表達(dá)NS3蛋白。I.3表達(dá)質(zhì)粒PVRC-E1E2的制各在真核表達(dá)質(zhì)粒pVRC的多克隆位點(diǎn)，將編碼HCV包膜蛋白E1E2的基因序列插入。在經(jīng)多克隆篩選及測(cè)序鑒定無誤后，大量擴(kuò)增獲得超純無內(nèi)毒素質(zhì)粒。取適量質(zhì)粒對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞進(jìn)行樣品處理和電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用小鼠抗HCVEI,E2的單克隆抗體作一抗,IRdye-800cw標(biāo)記的兔抗小鼠抗體(Licor公司)作二抗進(jìn)行免疫印跡(Westernblot)鑒定，有特異性抗原表達(dá)者為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。附圖Ic顯示了Westernblot的鑒定結(jié)果,說明質(zhì)粒能有效表達(dá)HCVE1,E2蛋白。實(shí)施例2=HCV假病毒顆粒的制備2.I細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium,DMEM)(GIBCO)培養(yǎng)人293FT細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37°C>5%C02。細(xì)胞傳代方法如下I)棄去舊培養(yǎng)液，加入5ml滅菌PBS溶液，輕輕清洗細(xì)胞后棄去。2)加入Iml胰酶消化液，輕輕流過細(xì)胞后棄去，用殘存液體消化細(xì)胞l_2min，直到細(xì)胞完全消化下來。3)加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基5ml，用刻度吸管吹打，將瓶壁上的細(xì)胞沖洗下來。4)補(bǔ)加液體至10ml，混勻后分至兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞株的凍存I)取培養(yǎng)2-3天生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，用含90%胎牛血清和10%二甲基亞砜配成凍存液，將細(xì)胞配成2x106-2x107個(gè)/ml。2)在Iml細(xì)胞凍存管中加入Iml細(xì)胞懸液，混勻后密封。置4°CIh,-20°C2h，然后直接放入液氣中或直液氣蒸汽上過夜后浸入液氣中。細(xì)胞復(fù)蘇I)從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管。2)迅速放入盛有37°C溫水的水浴中解凍。3)用70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺(tái)上，吸出細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加3ml含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，置37°C、5%C02孵箱培養(yǎng)。4)次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞采用脂質(zhì)體(Lipofectamine2000,Invitrogen)介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,具體方法與前述質(zhì)粒鑒定方法相同。2.3假病毒顆粒的分離根據(jù)慢病毒載體的特性，使用20%蔗糖超速離心的方法進(jìn)行濃縮和純化。具體方法如下I)收集轉(zhuǎn)染后48/h的293FT細(xì)胞上清液。[0086]2)于4°C，4000g離心lOmin，除去細(xì)胞碎片后以O(shè).45μm濾器過濾上清液。3)把病毒粗提液樣品小心加入5ml20%蔗糖溶液上方，SW32超速離心管(Beckman超速離心機(jī))，4°C,22000rpm超速離心120min。4)棄去上清，浙干后加入適量PBS溶解后即為病毒濃縮液。5)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80度長(zhǎng)期保存。取其中一支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定。圖2顯示其電鏡與westernblot鑒定結(jié)果。實(shí)施例3=HCV假病毒顆粒疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為證實(shí)假型慢病毒的免疫效果，我們采用分別采用HCV假病毒顆粒疫苗，DNA疫苗，腺病毒載體疫苗對(duì)BalB/c小鼠進(jìn)行免疫后，比較分析其免疫效果。3.I疫苗的制備方法HCV假病毒顆粒疫苗由本單位自制，為表面為HCVE1E2包膜蛋白并攜帶HCVNS3基因的假型慢病毒。由于HCV病毒有不同的型別，E1E2在不同型別的差別較大，本實(shí)例選取了中國流行率較高lb，作為HCVE1E2模板制備了表達(dá)質(zhì)粒，并包裝獲得了相應(yīng)型別的假病毒顆粒。并根據(jù)p24定量，以注射用生理鹽水配置成20ug/ml。添加佐劑的疫苗組,選用氫氧化招佐劑1.Omg/ml(按Al3+計(jì)算，lmg/ml)。免疫分組分組---------_^第一針(O周)第二針(3周)第三針(6周)第四針(9周)A__HCVpp__HCVpp__HCVpp__HCVppBHCVpp+佐齊IJ__HCVpp+佐齊IJ__HCVpp+佐劑HCVpp+佐劑C_PBS__PBS__PBS_PBS動(dòng)物免疫雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠，體重16-18克，每組12只。于第0、28天肌肉注射蛋白疫苗，免疫劑量O.Iml0第98天時(shí)采用Ad-SSl免疫，免疫劑量O.1ml，肌肉注射。每次免疫后兩周眼眶采血，并于末次免疫后兩周摘眼球取血，分離血清，測(cè)定前凍存于-20°C。將小鼠脫頸處死后無菌取脾，研磨分離獲得脾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度后立即用于ELISP0T檢測(cè)。免疫保護(hù)效果檢測(cè)I.小鼠血清中E1E2特異性IgG的ELISA測(cè)定采用真核表達(dá)的HCVEl,E2蛋白包被ELISA板。將小鼠血清以PBS從I:100作倍比稀釋，以PBS組I:50稀釋后檢測(cè)的A450/650值的平均值的2.I倍作為(Cutoff)界值，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清抗E1，E2的幾何平均滴度見圖3a。2.小鼠血清中NS3特異性IgG的ELISA測(cè)定采用原核表達(dá)的C44p蛋白包被ELISA板。將小鼠血清以PBS從I:100作倍比稀釋，以PBS組I:50稀釋后檢測(cè)的A450/650值的平均值的2.I倍作為(Cutoff)界值，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清抗-NS3的幾何平均滴度見圖3b。3.HCVEI,E2，NS3特異性細(xì)胞免疫測(cè)定小鼠Y-IFN細(xì)胞因子ELISP0T試劑購自BD公司。按說明書操作，在包被抗用抗γ-IFN抗體后，每孔加入100ul含El，E2，NS3抗原多肽的脾細(xì)胞培養(yǎng)懸液，每孔脾細(xì)胞數(shù)為5x105個(gè)，37°C5%C02靜置培養(yǎng)24h;棄去培養(yǎng)液后，分步加入檢測(cè)抗體和顯色液顯色，Bioreader4000斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)斑點(diǎn)形成數(shù)(SFC)。根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)的多少判斷特異性殺傷T細(xì)胞的數(shù)量，該數(shù)量的多少與細(xì)胞免疫強(qiáng)度呈正相關(guān)。結(jié)果見圖4。參考文獻(xiàn)[I]李振宇，徐開林.慢病毒載體構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技術(shù)領(lǐng)域：
：1.生物技術(shù)2.基因工程疫苗。本發(fā)明涉及一種攜帶雙鏈RNA靶抗原和中和抗原的假病毒顆粒疫苗，該疫苗通過采用整合缺陷的pCMVΔR8.2D64E包裝質(zhì)粒、pCS轉(zhuǎn)導(dǎo)載體和中和抗原表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，即包裝獲得顆粒表面呈現(xiàn)中和抗原而核心攜帶具有佐劑效應(yīng)的雙鏈RNA靶抗原基因的假病毒顆粒疫苗。本疫苗為顆粒疫苗，易于收獲，抗原性強(qiáng)，并且應(yīng)用安全，在多種病原，尤其是突發(fā)病毒感染性疾病的防治中具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61P35/00GKCN102961757SQ201210431175公開日2013年3月13日申請(qǐng)日期2012年11月2日發(fā)明者譚文杰,鄧瑤,管潔,文波申請(qǐng)人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan