專(zhuān)利名稱(chēng):流感疫苗的制備方法
本發(fā)明涉及一種新的流感疫苗，特別涉及一種自流感病毒獲得的HANA抗原與胞壁酰二肽衍生物(以下稱(chēng)為MDP衍生物)人工合成囊泡樣復(fù)合體顆粒組成的流感疫苗，HANA抗原為這種疫苗的活性成分，MDP衍生物為合成佐劑，這種人工合成顆粒在大小和形狀上與天然發(fā)生的流感病毒顆粒相似。本發(fā)明還涉及制備這種新疫苗的方法。
由于目前使用的流感HA疫苗的接種效果受發(fā)生在流行病毒HA(血凝素)分子上的突變變異影響，因此開(kāi)發(fā)較傳統(tǒng)所用更為有效的疫苗成為緊迫的要求。
在流感疫苗開(kāi)發(fā)方面的最新進(jìn)展之一就是由HA和NA(神精氨酸酶)為主要成份的一種合成疫苗的出現(xiàn)，即流感HANA疫苗。形成的這種含有純化HANA的疫苗在安全性和效果上被認(rèn)為是一種理想的疫苗，并且在美國(guó)已被用于實(shí)踐。然而，這種疫苗的效果實(shí)際上仍有不足之處。
從另一方面看，再有的進(jìn)展就是佐劑的使用。這項(xiàng)工作已導(dǎo)致對(duì)胞壁酰二肽(MDP)及多種MDP衍生物的開(kāi)發(fā)，適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾使MDP衍生物作為新型佐劑材料在免疫潛能等方面得到改善。例如，Kotani等人在YAKUGAKU ZASSHI這本期刊的1983年第103卷一期第1～27頁(yè)上發(fā)表了有關(guān)這些MDP衍生物的報(bào)告。它們提到將6-0-(2-四癸基六癸酰基)MDP與含有高度純化作為主要成分的HA和NA流感疫苗(即HANA)一起注射給豚鼠，并報(bào)告說(shuō)已得到了有效的佐劑效應(yīng)。然而，將MDP衍生物作為佐劑簡(jiǎn)單地加入疫苗所得到的HANA疫苗并不具有足夠的作用。
因此，本發(fā)明的主要目的是提供一種較傳統(tǒng)所用具有更良好的致免疫性的新型流感疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供一種包括人工合成囊泡樣HANA抗原-MDP衍生物復(fù)合體顆粒的新型流感疫苗，此復(fù)合顆粒與天然病毒顆粒在顆粒大小和形狀上幾乎相同。
本發(fā)明的這些及其它的目的通過(guò)下面的描述會(huì)更清楚。
按照本發(fā)明，提供一種包括人工合成的HANA抗原復(fù)合物的囊泡樣顆粒和至少一種MDP衍生物的流感疫苗，MDP衍生物組成此顆粒的膜(相當(dāng)于天然流感病毒顆粒的脂膜)，HANA抗原與MDP衍生物相連出現(xiàn)在此膜上以形成復(fù)合體，這樣，此種復(fù)合體就與簡(jiǎn)單地將一種疫苗和一種佐劑混合得到的疫苗不同了。因此，按本發(fā)明所獲得的人工合成HANA抗原-MDP衍生物復(fù)合體囊泡樣顆粒就具有了與天然病毒顆粒幾乎相同的顆粒大小和幾乎相同的形狀。
圖1和圖2分別為本發(fā)明的1號(hào)試樣疫苗和2號(hào)試樣疫苗的電鏡顯微照片(放大150，000倍);
圖3為本發(fā)明4號(hào)試樣疫苗的電鏡顯微照片(放大200，000倍);
圖4代表用蔗糖梯度離心法所得到的密度區(qū)帶的比較，以確定本發(fā)明的此種復(fù)合物的構(gòu)成。
這種新的流感疫苗可用下述專(zhuān)門(mén)的方法制備。
首先在某種適當(dāng)?shù)木彌_液中，例如磷酸鹽緩沖液，將流感HANA抗原與MDP衍生物以重量比10/1～1/300的比值混合后，再加入有效量的表面活化劑(0.1～10重量/體積%)，使形成的混合物溶解。此后，用透析方法將這種表面活化劑除去，便得到一種新的HANA抗原-MDP衍生物復(fù)合體。在此，最重要的是要使用一種可經(jīng)透析去除的表面活化劑。這類(lèi)表面活化劑舉例包括辛基苷、膽酸鈉等。參考圖1～3，得到的HANA抗原-MDP衍生物復(fù)合體形成所謂病毒體，在病毒體內(nèi)MDP衍生物本身使人工合成囊泡得以形成，而HANA抗原則通過(guò)它們狹窄的未端與顆粒表面結(jié)合，使得它們與存在天然病毒顆粒表面上的此抗原具有相同的方位。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，MDP衍生物可與(Ⅰ)膽固醇(Ⅱ)卵磷脂和磷酸雙鯨酯(dicetyl phosphate)或(Ⅲ)即(Ⅰ)和(Ⅱ)的混合物等物質(zhì)聯(lián)合使用，這些物質(zhì)具有促M(fèi)DP衍生物的人工合成囊泡樣顆粒形成的能力。在這種情況下，優(yōu)先選用下列重量比值使用膽固醇MDP衍生物/膽固醇＝1/0～1/5，更優(yōu)先選用的比值為1/0.5～1/2。
使用卵磷脂MDP衍生物/卵磷脂＝1/0～1/50，更優(yōu)先選用的比值為1/1～1/20。
使用磷酸雙鯨酯卵磷脂/磷酸雙鯨酯＝1/0.05～1/2，更優(yōu)先選用的比值為1/0.5～1/1。
此外，與本發(fā)明的這個(gè)方面一致，并不一定必須使用表面活化劑及進(jìn)行透析。從這點(diǎn)講，本發(fā)明比經(jīng)傳統(tǒng)的形成NDP衍生物囊泡樣顆粒的聲波處理(超聲波法)，微量注射，反相脫水等方面為優(yōu)。
本發(fā)明可使用的MDP衍生物包括許多種MDP的適當(dāng)化學(xué)修飾物。這些MDP衍生物在日本公開(kāi)專(zhuān)利(KOKAI)第52-46020，52-156812，54-73729，54-130517，55-19236，55-28932，55-28933，56-18996，56-49396和60-78997號(hào)中有論述。
優(yōu)先使用具有下列結(jié)構(gòu)式的高級(jí)脂肪酯
其中Q代表合成的總共具有20～60個(gè)碳原子的高級(jí)脂肪酸殘基;
A代表L-丙氨酸，L-絲氨酸或甘氨酸，iso Gln代表異谷氨酰胺。
更優(yōu)先使用6-0-(2-四癸基六癸?；?MDP，即B30-MDP。這些脂肪酯的論述發(fā)表在日本公開(kāi)專(zhuān)利(Ko KAI)54-130517號(hào)上。
具有下列結(jié)構(gòu)式的MDP衍生物也可優(yōu)先選用
其中X代表一種氨基酸，如L-丙氨酸，L-絲氨酸，L-纈氨酸及甘氨酸;
Y代表-NH-A或
，其中R1為氫原子，短鏈烷基，氨甲酰基或羧基;n為1～6;A為一個(gè)帶或不帶有側(cè)鏈的具有8～30個(gè)碳原子的飽和或不飽和脂肪族烴鏈殘基。這種衍生物更優(yōu)先選用的例子包括Nα-(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰)-N-十八烷-L-賴(lài)氨酸，即MDP-LYS(L18)。
更進(jìn)一步，優(yōu)先使用Nα-(N-乙酰胞壁酰-N-甲基-L-丙氨酰-D-異谷氨酰)-Nε-十八烷-L-賴(lài)氨酸，即MDP(Me Ala)-Lys(18)。對(duì)此，日本公開(kāi)專(zhuān)利60-78997對(duì)此有敘述。
本發(fā)明使用的HANA抗原是自流感病毒感染的胚蛋中抽尿囊液，經(jīng)高速離心或化學(xué)處理等純化流感病毒步驟，用非離子型表面活化劑溶解此純化病毒，如去利通X-100和NP-40;或用陽(yáng)離子表面活化劑，如去氧膽酸鈉和膽酸鈉;或用陽(yáng)離子表面活化劑，如十六烷三甲銨;也可借醚類(lèi)有機(jī)溶劑溶解，然后通過(guò)蔗糖密度梯度離心，親和層析等方法，進(jìn)一步純化所得的產(chǎn)物。
以下非限定性實(shí)施例，將能更具體地說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1流感HANA抗原的制備流感A/曼谷型/1/79(H3N2)病毒在雞胚中生長(zhǎng)，然后對(duì)生長(zhǎng)出的病毒進(jìn)行高速離心分離(23，000轉(zhuǎn)/分鐘，90分鐘)，低速離心分離(6000轉(zhuǎn)/分鐘，60分鐘)和蔗糖密度梯度離心(30，000轉(zhuǎn)/分鐘，3小時(shí))。然后將去利通X-100加到病毒懸液至終濃度1%，充分?jǐn)嚢璐藨乙?，使病毒溶解后，再通過(guò)蔗糖密度離心，便可得到純化的HANA抗原溶液。疫苗的制備與免疫試驗(yàn)利用上述得到的純化HANA抗原溶液，按下述方法制備四種疫苗試樣(它們的成分如表1所示)各個(gè)成分混合后，加入辛基苷至終濃度為3%(重量)。待這些成分溶解后，按傳統(tǒng)方法放至磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行透析，以此使每份樣品的HANA抗原濃度調(diào)整至0.8微克當(dāng)量/毫升，然后按每只小鼠0.5ml的劑量進(jìn)行腹腔接種，總共接種十五只DDY小鼠(4周齡，雌鼠)接種后，將小鼠分成三個(gè)組，每組5只，分別于接種后一星期，二星期，三星期收集相應(yīng)組的鼠血，按世界衛(wèi)生組織的方法進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，以測(cè)定抗體形成能力。
按上述同樣方法，用前述各個(gè)樣品對(duì)DDY小鼠進(jìn)行免疫，兩周后用制備疫苗所使用的病毒株感染小鼠，再四天后摘取小鼠的肺臟。用MDCK細(xì)胞對(duì)小鼠的肺臟進(jìn)行空斑形成試驗(yàn)，以測(cè)定肺內(nèi)病毒含量。得出的結(jié)果見(jiàn)表1
從表1列出的結(jié)果可以明顯看出，本發(fā)明的所有疫苗均比只由HANA組成的疫苗具有更良好的抗體形成能力。
借助電子顯微鏡觀察1號(hào)，2號(hào)和3號(hào)試樣的疫苗形態(tài)，可以肯定MDP衍生物人工合成囊泡樣顆粒具有與天然流感病毒顆粒相同的大小和相同的形狀，在其表面，HANA抗原與MDP衍生物相連，如圖1～3所示，形成清晰的復(fù)合體。
為了確定上面制備的1號(hào)試樣是否形成復(fù)合體，用蔗糖密度梯度離心的方法測(cè)定了HANA抗原、完整病毒和1號(hào)試樣的密度。從圖4中的結(jié)果明顯看出，1號(hào)試樣顯示的區(qū)帶位置與HANA抗原和完整病毒均不同，因此可以得出結(jié)論，1號(hào)試樣形成了一種不同于HANA抗原和完整病毒的復(fù)合體。實(shí)施例2除使用流感A/菲律賓型/2/82(H3N2)毒株這點(diǎn)不一樣外，其它方法與前述實(shí)施例1的方法相同，制備HANA抗原。用表2例出的成分與這種HANA抗原混合，混合后，用裝有杯狀探頭(范圍2.5)的Heat Systems W375超聲儀(Heat System-超聲儀公司生產(chǎn))對(duì)混合物進(jìn)行8分鐘的超聲處理，這樣得到的每份試樣的抗體形成能力根據(jù)前述實(shí)施例1的同樣方法測(cè)定。
表2例出了所得的結(jié)果，結(jié)果顯示本發(fā)明的疫苗具有良好的抗體形成能力。
表2試樣號(hào) 成分 血凝抑制值(經(jīng)三周后)6 HANA 1.0微克當(dāng)量B30-MDP 3.0微克 512
HANA 1.0微克當(dāng)量B30-MDP 3.0微克7 卵磷脂 450微克 512磷酸雙鯨酯 50微克HANA 1.0微克當(dāng)量8 B30-MDP 30微克 1024膽固醇 50微克HANA 1.0微克當(dāng)量MDP-LYS(L18)30微克9 卵磷脂 450微克 1024磷酸雙鯨酯 50微克HANA 1.0微克當(dāng)量10 MDP-LYS(L18)30微克 512膽固醇 50 微克對(duì)照樣11 HANA 1.0微克當(dāng)量 256從上述實(shí)施例1和2可明顯看出，本發(fā)明的流感疫苗具有良好的致免疫性和改進(jìn)的防流感感染性。
權(quán)利要求
1.一種制備流感疫苗的方法，該方法包括將流感HANA疫苗與至少一種MDP衍生物在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中混合，用可透析去除的表面活性劑使混合物溶解，溶解過(guò)程在膽固醇，卵磷脂和磷酸雙鯨酯或它們的混合物存在或不存在的條件下進(jìn)行；然后通過(guò)透析去除其中的表面活性劑，得到包括人工合成的流感HANA抗原和MDP衍生物復(fù)合體的囊泡樣顆粒的流感疫苗。
2.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中的溶解過(guò)程在膽固醇、卵磷脂及磷酸雙鯨酯或它們的混合物存在的條件下進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中的溶解過(guò)程于不存在膽固醇，卵磷脂及磷酸雙鯨酯或它們的混合物的條件下進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中流感HANA抗原與MDP衍生物的重量比為10/1～1/300。
5.根據(jù)權(quán)項(xiàng)2所述的方法，其中MDP衍生物與膽固醇的重量比為1/0～1/5。
6.根據(jù)權(quán)項(xiàng)2所述的方法，其中MDP衍生物與卵磷脂的重量比為1/0～1/50，卵磷脂與磷酸雙鯨酯的重量比為1/0.05～1/2。
7.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中的流感HANA抗原是一種經(jīng)純化流感病毒制備的抗原。
8.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中MDP衍生物物具有下列結(jié)構(gòu)式
其中Q代表一種合成的總共具有20～60個(gè)碳原子的高級(jí)脂肪酸殘基;A代表2-丙氨酸、2-絲氨酸或甘氨酸;iso Gln代表異谷氨酰胺。
9.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中MDP衍生物具有下列結(jié)構(gòu)式
其中X為一種氨基酸;Y代表-NH-A或-
，其中R1代表氫原子、短鏈烷基、氨甲?；螋然?n為1～6;A為帶有或不帶有支鏈的具有8～30個(gè)碳原子的飽和或不飽和脂肪族烴殘基。
10.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其中MDP衍生物選自6-0-(2-四癸基六癸?；?MDP，Nα-(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰)-Nε-十八烷-L-賴(lài)氨酸和Nα-(N-乙酰胞壁酰-N-甲基-L-丙氨酸-D-異谷氨酰)-Nε-十八烷-L-賴(lài)氨酸。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及一種含有HANA抗原-MDP衍生物復(fù)合體的新流感疫苗。其制備過(guò)程是將流感HANA抗原與至少一種MDP衍生物在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中混合，用可透析去除的一種表面活化劑處理，使混合物溶解，這種溶解過(guò)程是在有或沒(méi)有膽固醇，卵磷脂和磷酸雙鯨酯或它們的混合物條件下進(jìn)行，然后通過(guò)透析去除其中的表面活性劑。
文檔編號(hào)A61K39/145GK86103717SQ86103717
公開(kāi)日1987年2月11日 申請(qǐng)日期1986年6月6日
發(fā)明者根路銘國(guó)昭, 大谷明, 大隈邦夫, 井上敦郎 申請(qǐng)人:國(guó)立預(yù)防衛(wèi)生研究所, 第一制藥株式會(huì)社化學(xué)及血清療法研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan