專利名稱:一種具有抗血栓形成、溶解纖維蛋白、消炎活性的解聚的硫酸氨基己糖聚糖，其制備方法 ...的制作方法
本發(fā)明涉及一種制備低聚糖類的方法，該法通過(guò)控制性化學(xué)解聚天然多糖類，如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素及透明質(zhì)酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明也涉及所生成的新產(chǎn)物以及和這些產(chǎn)物有關(guān)的藥品組合物。
實(shí)際上，所得產(chǎn)物具有高的抑制凝血因子X(jué)a的能力、高的抗血栓形成活性、高的溶解纖維蛋白活性以及消炎作用，基本沒(méi)有抗凝劑效應(yīng)。
這些產(chǎn)物口服后具有良好的生物利用率，這是由于寡聚物具有較之原料多糖降低了的分子量的緣故。
本發(fā)明的方法是在10～20%水溶液中，在30℃至70℃之間的溫度下，并在有適量的金屬催化劑如Cu2+、Fe2+、Cr3+或Cr2O3-7等存在下，其濃度為0.001至0.1M，通過(guò)由過(guò)氧化物或過(guò)酸，如過(guò)乙酸、過(guò)氧化氫、3-氯-過(guò)苯甲酸、過(guò)硫酸鈉、枯基過(guò)氧氫引發(fā)的自由基反應(yīng)將多糖解聚。解聚產(chǎn)物通常是通過(guò)加入溶劑或季銨堿類使發(fā)生沉淀而以固體形式從反應(yīng)溶液中分離出來(lái)。
生成的低聚糖類通常與堿金屬，如鈉、鉀或鋰或與堿土金屬如鈣或鎂形成鹽類。
3500至8000道爾頓的低分子量肝素具有顯著的抗血栓形成的活性，但基本沒(méi)有抗凝劑效應(yīng)。
此外，曾報(bào)導(dǎo)過(guò)用高碘酸降解(Tollefsen DM.Nouv.Rev.Fr.Haematol.26.233.1984)，并經(jīng)親和層析獲得的含有最少為12-14個(gè)糖基的硫酸皮膚素片段對(duì)肝素解輔因子Ⅱ具有顯著活性，此活性高于未分解的硫酸皮膚素。另一方面，其他硫酸軟骨素和硫酸肝素的降解產(chǎn)物都不是已知的。
以往已報(bào)道了解聚天然肝素的許多方法，一種適于制得低分子量化合物的方法是在稀硝酸中對(duì)肝素進(jìn)行脫氨水解。生成的化合物的特點(diǎn)是具有一個(gè)由2，5-脫水甘露糖(Ⅰ)構(gòu)成的末端
R＝H，SO3H(美國(guó)專利No.4438261;1982年10月28日出版的WO/82/03627;歐洲專利申請(qǐng)No.0048231)。
還有一種對(duì)肝素(歐洲專利申請(qǐng)No.0040144)或?qū)ν榛嗡鼗蚍蓟ヮ?歐洲專利申請(qǐng)No.0044228)進(jìn)行堿性水解的方法，該法藉助于β-消除產(chǎn)生具有平均分子量為2000-9000道爾頓的低聚物，這些低聚物以不飽和糖(Ⅱ)作為末端基團(tuán)
R′＝H，SO3HR＝COOH上述方法的產(chǎn)率非常低另一種解聚方法是在非常稀的溶液中并以非常低的產(chǎn)率用肝素酶對(duì)肝素進(jìn)行酶催化水解，形成糖(Ⅲ)和半縮醛形式的氨基葡糖(Ⅳ)作為末端基團(tuán)(歐洲專利申請(qǐng)No.0064452;J.Biol.Chem.257.7310，1982)。
基于使用氧化劑如堿性過(guò)碘酸鹽類的一些肝素解聚方法也公開(kāi)了，這些方法是用該氧化劑把非硫基化糖醛酸的鄰近的C2-C3羥基之間的鍵氧化，從而使葡苷鍵不穩(wěn)定(見(jiàn)Casu B.“肝素的結(jié)構(gòu)和生物活性”，Advances in Carbohyar.Chem.Biochem.Vol.43.1985.51-134，Acad.Press)。
其他一些方法是基于在高溫(125℃)和壓力下過(guò)氧化氫和酸性pH對(duì)肝素的共同作用。由解聚而得到的寡聚物有活性變化和活性損失。(1984年8月22日公布的歐洲專利申請(qǐng)No.0101141)
其他一些方法是基于用硫酸進(jìn)行酸解聚以及用氯磺酸的混合物同時(shí)或隨后再硫酸化(Nagasawa K.等，Arhiv.Biochem.Biophys，150，451，1972;法國(guó)專利申請(qǐng)No.2538404)。
所有這些實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的方法，都有產(chǎn)率低、重現(xiàn)性不好的問(wèn)題，擴(kuò)大到半工業(yè)和工業(yè)規(guī)模時(shí)尤其如此。
意大利專利申請(qǐng)No.40021A/83(相應(yīng)于歐洲專利申請(qǐng)No.0121067)，敘述了一種方法，該法同時(shí)使用過(guò)氧化氫、抗壞血酸和醋酸銅以得到合適分子量的低聚糖類。
上述發(fā)明考慮了大大延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，即長(zhǎng)達(dá)24-48小時(shí)，以及采用高度稀釋的肝素溶液，隨之而來(lái)的是產(chǎn)率低。此外，解聚的產(chǎn)物被抗壞血酸降解產(chǎn)物所污染。
現(xiàn)在意外地發(fā)現(xiàn)，肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸類型的任何多糖都能被降解，降解時(shí)所用的水溶液濃度甚至可高于10～15%，溫度在20和70℃之間，時(shí)間為數(shù)小時(shí)，有催化劑存在，如金屬離子Cu2+、Fe2+、Cr3+或酐如Cr2O2-7，其濃度在0.1M和0.001M之間，降解是通過(guò)在過(guò)酸或過(guò)氧化物如過(guò)乙酸、過(guò)氧化氫、3-氯-過(guò)苯甲酸、枯基過(guò)氧氫、過(guò)硫酸鈉、過(guò)氧化苯甲酰的水溶液中所產(chǎn)生的由·OH基引發(fā)的自由基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明方法具有下述超過(guò)已知方法的優(yōu)點(diǎn)-操作時(shí)間短;
-可獲得具有合格平均分子量的多糖類;
-可以使用高濃度的待解聚生物聚合物進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，這樣就不需要在回收解聚產(chǎn)物時(shí)進(jìn)行耗費(fèi)頗大的濃縮和提純操作。
生產(chǎn)的低聚糖類基本是純的，因?yàn)檫^(guò)氧化物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物很容易除去，而催化劑金屬可以用EDTA或用螯合樹(shù)脂例如帶有亞氨基二乙酸官能團(tuán)的樹(shù)脂螯合除去。
在該反應(yīng)液中不存在其他雜質(zhì)，不象-舉例來(lái)說(shuō)-基于使用抗壞血酸的解聚方法，會(huì)依次產(chǎn)生脫氫化抗壞血酸、二酮戊二酸、蘇糖酸和草酸(見(jiàn)Niedermeiev W.et al.B.B.A.141，336，1976)，這些酸都是解聚后多糖中的可能雜質(zhì)。
實(shí)際上，本解聚方法得到的低分子量產(chǎn)物可在中性pH值左右，用非溶劑試劑如甲醇、乙醇、丙酮、二噁烷從反應(yīng)介質(zhì)中直接分離出來(lái)，尤其是以鈉鹽的形式分離。產(chǎn)物可通過(guò)二次沉淀或通過(guò)溶解后在合適樹(shù)脂做的柱子上洗脫，用甲醇或乙醇再沉淀來(lái)提純。
本發(fā)明的產(chǎn)物也可以與鉀、鋰、鈣、鋇或鎂機(jī)鹽，或可與有成堿類如中或長(zhǎng)鏈胺成鹽。
為了與鈉以外的陽(yáng)離子成鹽，通常的步驟是在陽(yáng)離子交換柱上洗脫下肝素酸或與硫酸皮膚素或硫酸乙酰肝素相應(yīng)的酸類，隨后使之與所要求的陽(yáng)離子成鹽。
本發(fā)明的低聚糖類主要具有以下Ⅴ和Ⅵ型C1碳的還原末端的基團(tuán)。
(軟骨糖胺)這與用色譜分離或用選擇沉淀所得到的肝素及其它多糖類的天然低聚物一樣。
然而，所述的末端基團(tuán)可以用NaIO等容易地氧化成糖醛酸酯類或用NaBH4還原成醇類。
本發(fā)明方法不改變對(duì)于生化活性重要的SO3H基含量，這可由比較解聚產(chǎn)物和起始物-SO3H/-COOH的當(dāng)量比來(lái)判斷。
此外，所述的方法特點(diǎn)在于反應(yīng)可以控制和在預(yù)期的解聚速率時(shí)停止，這些對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域：
中的專家來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
本方法通過(guò)測(cè)定平均分子量或與平均分子量直接有關(guān)的低聚物的生物活性，例如通過(guò)測(cè)定APTT(活性部分凝血因子時(shí)間)或活化抗凝血因子X(jué)的活性而得到控制。
本方法可以隨意地通過(guò)降低反應(yīng)的pH值、溫度、中止自由基的產(chǎn)生或通過(guò)用一種已知抑制劑(如SOD、過(guò)氧化氫酶、對(duì)羥基苯甲酸鹽)來(lái)中止反應(yīng)。
本發(fā)明的產(chǎn)物具有范圍在2000和7000道爾頓之間的平均分子量。
本發(fā)明也涉及所有的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用方面，包括將本發(fā)明方法的產(chǎn)品用做人類治療藥劑，如基本沒(méi)有抗凝劑活性的抗血栓形成劑、溶解纖維蛋白劑和消炎劑;為此目的，用傳統(tǒng)技術(shù)和賦形劑將本發(fā)明的化合物配制成適于非腸道、局部或口服給藥的藥劑。
適于非腸道給藥的配方例子包括裝在安瓿中的無(wú)菌溶液。
適于口服給藥的配方例子包括膠囊、片劑和糖漿，其中活性成分也可賦形成脂質(zhì)體或微膠粒形式。
含有現(xiàn)有技術(shù)中已知的常規(guī)賦形劑的軟膏提供了局部給藥配方的例子。
以下給出的例子可說(shuō)明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明范圍。
例1將305克HFA116-7原料肝素與300克氯化鈉300克二水乙酸鈉一起傾入有2升水的容器中。
一旦出現(xiàn)溶解就加入相應(yīng)于4.35克溶解于300毫升水的二價(jià)銅鹽，在不斷攪拌下，分別滴加1000毫升15%過(guò)氧化氫溶液和NaOH當(dāng)量溶液，為了在反應(yīng)期間保持pH7.5。繼續(xù)滴加和攪拌二小時(shí);保持反應(yīng)溫度于45°～60℃。然后將反應(yīng)體系冷卻至室溫，并添加17克二水二乙胺四乙酸二鈉(EDTA);用乙酸將pH值調(diào)至5.9。
用7.9升甲醇將解聚的肝素沉淀;將收集在濾器的沉淀物再次溶解在4升水中，并添加75克一水合乙酸鈉和4克EDTA。用乙酸調(diào)節(jié)至pH5.8并用8升甲醇處理;通過(guò)過(guò)濾收集所得到的沉淀物，用甲醇和丙酮洗滌，并干燥。
得到255克(產(chǎn)率83.6%)低分子量白色肝素(OP85/0201)，該產(chǎn)物具有以下特征;平均分子量4200(Hil-born.J.C.和Anastassiadis，Anal.Biochem.39，88，1971);U-APTT 33，19(Basu D.et al.，N.Engl.J.Med.287，324，1972);U-aXa 81.7(Teien A.N.et al，Thromb.Res.，8，413，1976)。起始所用原料肝素的對(duì)應(yīng)值分別是13，700;170，7;166，8。
例2將200克116.7HFA肝素;200克四水乙酸鈉及200克氯化鈉一起加入恒溫反應(yīng)容器。添加2100毫升0.02摩爾二價(jià)銅鹽。當(dāng)開(kāi)始溶解時(shí)，在15分鐘時(shí)間間隔內(nèi)分別滴加500毫升19%過(guò)氧化氫和當(dāng)量濃度的NaOH，以保持反應(yīng)pH在7.2。在內(nèi)層反應(yīng)容器中，溫度在35°～50℃之間。
在開(kāi)始反應(yīng)后60分鐘，添加30克EDTA鈉鹽;用乙酸調(diào)節(jié)溶液到pH5.9并用二體積甲醇將產(chǎn)物沉淀。
用丙酮洗滌沉淀物，并立即再次溶解(不用干燥)在2升水中。添加5克EDTA和50克乙酸鈉。調(diào)節(jié)pH至6。并在攪拌下添加2.5體積甲醇。
過(guò)濾、丙酮脫水并干燥后得到183克代碼為OP84/2610的粗產(chǎn)物，產(chǎn)率91.5%，該產(chǎn)物具有的特征示于表1。
銅含量為3.93ppm。
在靜脈給藥后，按照Reyers S.，Mussonil.，Donati M.B.，De Gaetano G.，Thromb.Res.18 699，1980，的方法評(píng)價(jià)在體內(nèi)抗血栓形成的活性(Ant.Act.)。在陰離子柱上(OH-型)層析分離出可能含有的無(wú)機(jī)酸，以及在陽(yáng)離子柱上(H+)通過(guò)傳遞釋放出肝素酸以后升，用電位滴定測(cè)定硫和糖醛酸。兩次滴定曲線彎曲處的比值相應(yīng)于-SO3H當(dāng)量/-COOH當(dāng)量。口服用藥后的利用率根據(jù)Reyer等的的靜脈血栓形式模式，當(dāng)用適用于確保穩(wěn)定膠囊系統(tǒng)的類脂相和表面活性劑組成的合適的賦形劑通過(guò)回腸內(nèi)途徑給藥時(shí)，以下報(bào)導(dǎo)的ED50值可使血栓量減半。
HFA 116.7＝7.5毫克/公斤OP84/2610＝3.25毫克/公斤例3將1公斤HFA15原料肝素，0.495公斤氯化鈉，和1公斤乙酸鈉加入到反應(yīng)容器中并用10升水溶解，該容器裝有一個(gè)恒溫槽、攪拌器、數(shù)個(gè)帶有刻度的懸滴漏斗以及溫度計(jì)。然后添加46克溶于1升水中的一水合乙酸銅，在2.5小時(shí)內(nèi)將溫度調(diào)節(jié)至35℃，分別加入當(dāng)量NaOH溶液以調(diào)節(jié)pH至7.5以及加入9%過(guò)氧化氫溶液。同時(shí)檢查內(nèi)部溫度使保持在35℃-60℃之間。
在反應(yīng)過(guò)程中，以一定的時(shí)間間隔取樣，檢查其體外活性(U-APTT和U-aXa)和平均分子量有關(guān)數(shù)據(jù)。
在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，添加90克EDTA，用30%乙酸調(diào)節(jié)pH至5.9，向反應(yīng)物質(zhì)添加44升甲醇。
通過(guò)過(guò)濾將形成的沉淀收集，用甲醇洗滌，并重新溶解在10開(kāi)水中。
生成的溶液添加350克乙酸鈉，20克EDTA并在pH值調(diào)節(jié)至5.8以后，增添20升甲醇。收集所形成的沉淀，用甲醇和丙酮洗滌，并干燥。得到845.5克(產(chǎn)率84.5%)低分子量白色肝素，具有如下特征分子量4600道爾頓U-APTT 34.4 U-aXa 72.5在本方法各個(gè)階段，不同低聚物的平均分子量，以及有關(guān)的分析特征和生物活性列于下表2。
(★)平均分子量(x)和U-APTT(y)間線性相關(guān)方程式為y＝0.0108055x-20.1658(r＝0.9925)將生成的粗產(chǎn)物溶于6升水中，在OH-形式的強(qiáng)堿型(amber-lite型)陰離子交換樹(shù)脂柱上(100φ×650毫米)以大約2個(gè)柱體積/小時(shí)的速率進(jìn)行滲濾。流出液添加乙酸至pH5，并在2升弱酸螯合樹(shù)脂上滲濾。
該流出液在用甲醇沉淀后，得出803.2克高純低分子量肝素(LMW OP 144)。原子吸收測(cè)試證明該肝素不含銅。
還原的末端基團(tuán)的信號(hào)出現(xiàn)在13C-核磁共振譜的異頭區(qū)(該譜是在D2O中，20兆赫茲處被記錄)，即N-硫酸基葡糖胺(δ92.7ppm)和α-O-硫酸基艾杜糖醛酸(94.4ppm)的C-1，與甲醇內(nèi)標(biāo)比較，他們的化學(xué)位移為51.75ppm。
例4將預(yù)先用類似例3中所列舉的一種方法解聚的，具有如下特征(U-APTT/毫升＝7;U-aXa/毫克＝52，體內(nèi)抗血栓形成活性116，分子量3300)的25克肝素進(jìn)行如下所述的進(jìn)一步解聚。
將25克低分子量(LMW)肝素隨同0.75克醋酸銅一起傾入200毫升水中。然后在二小時(shí)內(nèi)，攪拌下添加180毫升16%過(guò)氧化氫溫度65-70℃。用NaOH將pH保持在7.40將此溶液冷卻，調(diào)節(jié)到pH6，轉(zhuǎn)移到Chelex 100(R)柱子上(2.8φ×13厘米)，然后轉(zhuǎn)移到amberite(R)柱子上(IRA400OH-型，4.2φ×8厘米)并緊接著轉(zhuǎn)移到H+強(qiáng)酸型聚苯乙烯柱子上。
用NaOH調(diào)節(jié)洗脫液至pH7，并冰凍干燥。得到19.55克(產(chǎn)率78.2)低分子量OP119肝素其特征與起始產(chǎn)物比較
注★極低分子量的部分滯留在陰離子柱子上從而解釋了硫和糖醛酸百分值的降低。實(shí)際上，-SO3當(dāng)量/-COOH當(dāng)量證明未改變。
13C核磁共振譜在92.7ppm處顯示了一個(gè)非常強(qiáng)的N-硫酸化葡糖胺的異頭碳信號(hào);這可能系葡糖醛酸和艾杜糖醛-2-O-硫酯酯的C1碳分別出現(xiàn)在90.9和94.4ppm的信號(hào)所造成。
例5將具有平均分子量約12000和大于25000各占一半的10克硫酸皮膚素(060284AC/Sol)(抗血栓形成活性為21單位，U-APTT和U-aXa值分別為1.7及17)與10克氯化鈉和10克醋酸鈉一起傾入100毫升水中。添加0.45克一水合醋酸銅。溶解后，在40分鐘內(nèi)加入20毫升24%過(guò)氧化氫，保持溫度在25℃和47℃之間，用NaOH保持pH7.6。
再繼續(xù)攪拌20分鐘;加入0.5克EDTA，用醋酸調(diào)節(jié)pH6;用兩體積甲醇沉淀解聚的產(chǎn)物。通過(guò)過(guò)濾收集固體物質(zhì)，并再次溶解在100毫升水中。在添加醋酸鈉和0.45克EDTA，調(diào)節(jié)pH至6.0以后，用甲醇將該物質(zhì)再次沉淀。過(guò)濾后，收集并干燥得到7.1克低分子量硫酸皮膚素(產(chǎn)率71%)。該產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)和生物分析后，得到以下數(shù)據(jù)。
平均分子量3000-2800S%7.4糖醛酸%28.9SO-當(dāng)量/-COOH當(dāng)量1.4體外活性 U-APPT≈1U-aXa29體內(nèi)抗血栓形成活性35用0.5NHCl活化的Celle×DDEAE纖維素柱子將硫酸皮膚素060284分離，條件為0.1摩爾NaCl平衡柱子(2.5φ×55厘米)層析分離8克硫皮膚素。依次0.1摩爾、0.3摩爾和1.5摩爾NaCl溶液各2升進(jìn)行洗脫。將洗脫物濃縮，并用2體積甲醇沉淀硫酸皮膚素。
測(cè)試部分，各部分產(chǎn)率特征列于表4。
用解聚可以以高收率獲得具有良好活性的低聚物，否則的話只能通過(guò)耗費(fèi)大量時(shí)間的分離來(lái)獲取，且產(chǎn)率很低。
此外，這些解聚產(chǎn)物還具有纖維蛋白溶解活性。
例6將5克平均分子量為13700道爾頓的肝素同10克乙酸鈉一起溶解到100毫升水中。加入15毫升0.32摩爾的硫酸亞鐵溶液，然后在40分鐘內(nèi)滴入50毫升5.4%的過(guò)氧化氫。反應(yīng)物料的溫度保持在60℃。用NaOH將pH值調(diào)整到7.5。使反應(yīng)物冷卻，用decalite過(guò)濾之。將0.6克乙二胺四乙酸(EDTA)加入到濾液中，用300毫升甲醇使產(chǎn)物沉淀出來(lái)。經(jīng)過(guò)過(guò)濾收集該沉淀物，然后再將其溶解于300毫升水中。加入0.6克乙二胺四乙酸(EDTA)和18克乙酸鈉，用600毫升甲醇將所產(chǎn)生的物質(zhì)再次沉淀出來(lái)。經(jīng)過(guò)過(guò)濾收集到的解聚產(chǎn)物在干燥之后給出4.6克(92%收率)分子量為7950的肝素。
例7將2克分子量為20800的OP436-7/08硫酸乙酰肝素同92毫克一水合乙酸銅一起溶解于30毫升水中。在60分鐘內(nèi)溶解15毫升7.2%的過(guò)氧化氫，用氫氧化鈉保持pH7，溫度保持在50℃。
在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，添加2克乙酸鈉、100毫克乙二胺四乙酸(EDTA)和100毫升乙醇。過(guò)濾收集所形成的沉淀物，用甲醇洗滌之，然后將其再次溶解于15毫升水中。用乙酸使該溶液酸化達(dá)到pH值4.5，通過(guò)一個(gè)φ1.2×12cm的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱(IRC 718 amberlite resin column)洗脫;洗脫液中加入0.45克乙酸鈉使pH值達(dá)到5.5，最后再加入30毫升甲醇。
將解聚的硫酸乙酰肝素沉淀物收集起來(lái)，使之干燥后得到1.18克(59%收率)產(chǎn)品，其特性列于表5中。
例8將5克原料肝素(分子量14500道爾頓)傾入100毫升0.01摩爾的一種二價(jià)銅鹽溶液中，溶液中含有5%氯化鈉和5%乙酸鈉。在攪拌并于58℃加熱的條件下，加入50毫升1.6摩爾的過(guò)硫酸鈉溶液。
用氫氧化鈉將pH值保持在7左右。冷卻該溶液。用350毫升甲醇沉淀出粗反應(yīng)產(chǎn)物，將沉淀物再溶解于50毫升水中，先用OH-形式的陰離子交換樹(shù)脂(φ4.2×15cm)然后再用H+形式的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(φ4.2×10cm)洗脫。中和該洗脫液使之達(dá)到pH7，加入3克乙酸鈉，然后用200毫升甲醇處理該洗脫液。
過(guò)濾收集到的沉淀物，經(jīng)過(guò)干燥之后給出3.47克(69.5%收率)高純度的肝素，其分子量為3900。
例9同鈣的成鹽作用將200克OP146低分子量肝素(平均分子量4700，28.4U-APTT/毫克，88.67U-aXa/毫克，9.55%硫，27.8%糖醛酸，R3比值＝SO3H當(dāng)量/COOH當(dāng)量＝2.08(電位滴定測(cè)定)傾入2000毫升水中，用一個(gè)含有以H+形式的強(qiáng)酸性聚苯乙烯樹(shù)脂柱滲濾之。
用氫氧化鈣溶液不斷地中和顯著酸性的洗脫物。在滲濾過(guò)程結(jié)束時(shí)，添加60克氯化鈣。用2個(gè)體積的甲醇沉淀出低分子量肝素鈣。
干燥后得到191克OP149Ca(95.5%收率)肝素鈣，其分子量為4600道爾頓并具有以下特點(diǎn)S＝10.63%;糖醛酸＝28.78%;R3＝2.24(電位滴定測(cè)定)。
Ca＝9.58%(用原子吸收測(cè)定)Na＝0%(用原子吸收測(cè)定)U-APTT＝25.2/毫克;U-aXa＝84.2/毫克(用顯色法測(cè)定)。
這樣的制備達(dá)到了無(wú)熱源的目的。
例10將按照本發(fā)明所述方法解聚的肝素(具有94.81U-aXa/毫克(顯色法測(cè)定)和29.92U-APTT/毫克的OP118K)，以35毫克/公斤劑量經(jīng)回腸內(nèi)對(duì)大鼠給藥，與按照同樣劑量給藥的肝素(非解聚的)進(jìn)行比較。每隔一段時(shí)間采集一次樣品，測(cè)定大鼠血漿中的抗活性因子X(jué)活性(aXa)。在下面的表6中給出了血漿抗活性因子X(jué)活性水平。
根據(jù)曲線下面積(AUC)的比較，低分子量肝素的生物效力為高分子量肝素的8倍。
例11按照例5中的條件解聚的硫酸皮膚素(DS)，提供了下面表7中所列的化學(xué)特性和活性，作為比較表中還列出了非解聚產(chǎn)品的特性。
在對(duì)一些實(shí)驗(yàn)血栓模型的大鼠回腸內(nèi)給藥后，低分子量硫酸皮膚素(LMW-DS)提供了6.9毫克/公斤的ED50(血栓重量減半的有效劑量)，相比之下非解聚的硫酸皮膚素(DS)為8.9毫克/公斤。
還證明了低分子量硫酸皮膚素是溶解纖維蛋白的。
例12將10克硫酸皮膚素OP239(按照下述分子量的混合物構(gòu)成19%＞20000，30%≈14000，50%≈12000，用高效液相色譜法測(cè)定;〔d〕D＝-60)，同250毫克乙酸銅一起放入100毫升水中。
在持續(xù)1小時(shí)的時(shí)間里于37℃至40℃的溫度下，加入30毫升15%的過(guò)氧化氫。用總計(jì)14毫升當(dāng)量濃度NaOH將pH值保持在7.5。
在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，把溶液冷卻至20℃，用乙酸使pH值降低到5.8。
加入2體積的甲醇，用過(guò)濾分離所得沉淀物。然后將其溶解于60毫升水中，用Chelex 100(R)樹(shù)脂(φ2.h18cm)洗脫。所得到的溶液與柱子的洗脫液一起加入2體積的乙醇。經(jīng)過(guò)過(guò)濾分離出來(lái)沉淀物干燥后給出6.11克(61%收率)的硫酸皮膚素，其特性如下〔α〕＝-59.3;S＝6.7%;艾杜糖醛酸＝30.7%;SO3H當(dāng)量/COOH當(dāng)量＝1.32;
平均分子量＝4800道爾頓(采用高效液相色譜法用Protein Pak 125柱(waters)測(cè)定);
用甲醇作為內(nèi)參比標(biāo)準(zhǔn)，相對(duì)于外部四甲基硅烷給出碳-13核磁共振化學(xué)位移。甲醇在D2O中相對(duì)于四甲基硅烷的化學(xué)位移是51.75ppm。
L-伊杜糖醛酸(U)和乙酰氨基脫氧-D-半乳糖(A)的化學(xué)位移，用屬于它們的碳原子表示如下δ(ppm)104.8(U1)，103.6(A1)，82(A3)，77.73(U4)，76.94(A4)，76.08(A5)，72.7(U3)，70.9(U2-3)，60.72(A6)，52.9(A2)，25.7(CH3)。
在90-95ppm范圍內(nèi)，還原性端基(A1和U1)的信號(hào)是明顯的。
在體外化合物給出U-aXa＝2.5U.I./毫克及U-APTT＝1.3U.I/毫克。
在根據(jù)Hladovec(Physiologia Bohemoslovaca，24，551，1975)的高嶺土試驗(yàn)血栓形成中，給出了ED50＝1.2毫克/公斤例13將5克分子量大于34000(用高效液相色譜法測(cè)定)的硫酸皮膚素7-8HF，與5克乙酸鈉一起放入100毫升水中。
加入230毫克一水合乙酸酮，然后于1小時(shí)內(nèi)滴入20毫升12%的過(guò)氧化氫。
溫度保持在30℃至38℃之間，用總計(jì)5毫升0.1當(dāng)量濃度的NaOH使pH值保持在7.5。
在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，加入500毫升二水合乙二胺四乙酸二鈉，用乙酸將pH值調(diào)整到5.9，再用2體積的甲醇沉淀出解聚產(chǎn)物。
然后像前面的幾個(gè)實(shí)施例中一樣，獲取產(chǎn)品。
得到2.95克OP116(59%產(chǎn)率)，產(chǎn)品特性如下S＝6.16%;糖醛酸＝30.84%; (SO3H當(dāng)量)/(COOH當(dāng)量) ＝1.21;分子量＝6000道爾頓，采用高效液相色譜法用Protein Pak 125柱(Waters)測(cè)定，流速1毫升/分鐘，流動(dòng)相含有0.125M Na2SO4的2mM磷酸鹽緩沖液pH6，折光率檢測(cè)器測(cè)定。
碳-13核磁共振(四甲基硅烷作為外標(biāo)物，甲醇作為內(nèi)標(biāo)物，化學(xué)位移51.75ppm)
δppm104.8(C-1艾杜糖醛酸)，103.37(C-1，氨基糖-4-0-硫酸酯;60.72(C-6，氨基糖-0-硫酸酯);52.95(C-2，氨基糖N.Ac)。
〔α〕＝-60(在水中)“體內(nèi)”抗血栓形成活性24.7U。
“體內(nèi)”U-APTT2U.I./毫克。
權(quán)利要求
1.通過(guò)天然聚糖的受到控制的化學(xué)解聚制備低聚糖的方法，其特征在于在有Cu++、Fe++、Cr+++、Cr2O7--中一種催化劑存在的情況下，在20℃至70℃之間于水溶液中，使所述多聚糖經(jīng)受由一個(gè)自由基引發(fā)的自由基反應(yīng)。
2.權(quán)利要求
1的方法，其特征在于自由基是在水溶液中由選自過(guò)乙酸、3-氯-過(guò)苯甲酸、過(guò)氧化氫、枯基過(guò)氧氫、過(guò)硫酸鈉、過(guò)氧化苯甲酰的一種過(guò)氧化物產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求
1的方法，其特征在于催化劑是以0.1至0.001摩爾的濃度使用的。
4.權(quán)利要求
1-3的方法，其特征在于反應(yīng)是在濃度高于10-15%的多聚糖溶液中進(jìn)行。
5.權(quán)利要求
1-4的方法，其特征在于多聚糖選自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸。
6.權(quán)利要求
1-5的方法，用于制備與鈉、鉀、鈣、鋰或鎂成鹽的低分子量肝素組分。
7.按照權(quán)利要求
1-6所述的方法獲得的天然多聚糖的低分子量組分。
8.按照權(quán)利要求
1-6所述的方法獲得的、可能與鈉、鉀或鈣成鹽的肝素的低分子量組分。
9.權(quán)利要求
8-9中所述天然聚糖的組分，具有抗血栓形成活性、消炎活性、溶解纖維蛋白活性的藥物組合物。
10.按照權(quán)利要求
9的組合物，適于以無(wú)菌注射的懸浮溶液、膠囊、片劑、糖漿形式(其中活性組分可以包埋到脂質(zhì)體或微膠粒中)，或者以乳膏或軟膏形式非胃腸道給藥、口服給藥或局部給藥。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種制備低聚糖的方法，它是通過(guò)在20℃至70℃之間的溫度下，在有一種選自Cu
文檔編號(hào)C08B37/10GK86104301SQ86104301
公開(kāi)日1987年3月4日 申請(qǐng)日期1986年5月17日
發(fā)明者吉塞普·馬賽拉尼, 彼特羅·彼安奇尼 申請(qǐng)人:奧波克倫公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan