專(zhuān)利名稱(chēng):治療癌和非惡性腫瘤的方法和組合物的制作方法
本發(fā)明是有關(guān)癌和非惡性腫瘤的免疫治療。更具體地說(shuō)，是有關(guān)通過(guò)增加細(xì)胞的細(xì)胞毒活性來(lái)增強(qiáng)身體免疫反應(yīng)的方法，這些細(xì)胞是調(diào)節(jié)依賴(lài)於抗體的細(xì)胞毒性。根據(jù)本發(fā)明的方法所獲得的，增加了細(xì)胞毒性活性的細(xì)胞在治療各種類(lèi)型的癌和非惡性腫瘤的方法和組合物中是有用的。
由於病毒的感染，化學(xué)致癌物，輻射，身體的因素或自發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌和非惡性瘤。其轉(zhuǎn)化的結(jié)果使正常細(xì)胞表面抗原的表達(dá)發(fā)生了變化。在很多類(lèi)型的腫瘤上可以證明新的抗原-腫瘤的特異抗原或早熟細(xì)胞類(lèi)型的抗原特性-或抗原表達(dá)型式的改變。這些抗原的變化是身體免疫反應(yīng)的目標(biāo)。
在有些情況下，細(xì)胞轉(zhuǎn)化的范圍或速率會(huì)超過(guò)身體免疫反應(yīng)的潛在能力。換句話說(shuō)，免疫反應(yīng)會(huì)自身失效或不足。所以，已采用了一些輔助的方法來(lái)治療轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這些方法包括例如化學(xué)治療及放射治療這樣的非外科治療和外科治療。通常，它們的共同特點(diǎn)是會(huì)產(chǎn)生一系列不良副作用。有免疫抑制劑效應(yīng)的非外科治療會(huì)增加患者繼發(fā)性感染的易感性。切除轉(zhuǎn)化細(xì)胞的外科治療有伴隨侵襲過(guò)程的危險(xiǎn)性，而且也不可能有效地排除或除去整個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的群體。
一個(gè)可選擇的治療癌和非惡性腫瘤的方法包括對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面的腫瘤特異抗原使用單克隆抗體。有代表性的包括鼠的單克隆抗體的這些療法的效果經(jīng)常受到種種因素的限制。例如用鼠單克隆抗體治療的患者可能會(huì)產(chǎn)生抗鼠免疫球蛋白的反應(yīng)，這種反應(yīng)會(huì)嚴(yán)重地降低以后施用鼠單克隆抗體的效力(G.E.Goodman等，“用鼠單克隆抗體對(duì)黑素瘤增生患者的小型試驗(yàn)”，Journal of Clinical Oncology，3，pp.340-51(1985))。其他報(bào)道過(guò)的單克隆抗體療法的副作用包括過(guò)敏反應(yīng)，發(fā)燒和寒戰(zhàn)。
單克隆抗體對(duì)治療那些暴露在特異抗體下能調(diào)整的腫瘤特異表面抗原也是無(wú)效的，這樣一些抗原包括，例如一般的急性淋巴細(xì)胞血癌抗原(“CALLA”)，這種抗原出現(xiàn)在大多數(shù)患有急性淋巴細(xì)胞血癌病人的轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面(J.Ritz等，“用單克隆抗體進(jìn)行的急性淋巴細(xì)胞血癌的血清療法”，Blood，58，pp.141-52(1981))。當(dāng)在腫瘤細(xì)胞表面上的CALLA抗原暴露在它的特異抗體之下時(shí)，抗原就遷移，而且細(xì)胞使抗原和抗體內(nèi)化，這樣，免疫反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞，例如白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，殺傷(“K”)細(xì)胞或自然殺傷(“NK”)細(xì)胞，對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的辨認(rèn)就受到了阻礙。
鑒于上述輔助療法所存在的缺點(diǎn)，所以各種療法都指向增加身體對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的自然免疫反應(yīng)。眾所周知，在抗體存在的情況下，某些效應(yīng)細(xì)胞，例如有抗體Fc區(qū)域的表面結(jié)合受體的淋巴細(xì)胞，能調(diào)節(jié)依賴(lài)抗體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(“ADCC”)對(duì)靶細(xì)胞的反應(yīng)。依靠ADCC，這些效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生了對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。
ADCC反應(yīng)的兩種類(lèi)型已在體外得到了證明。在經(jīng)典的ADCC反應(yīng)中，效應(yīng)細(xì)胞連接到被抗體覆蓋的靶細(xì)胞上，然后使靶細(xì)胞溶解(A.H.Greenberg等，“調(diào)節(jié)對(duì)覆蓋有抗體的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞的特征.I”，Immunology，21，p.719(1975))。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的這種連接是由於覆蓋靶細(xì)胞抗體的Fc區(qū)與效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體相互反應(yīng)產(chǎn)生的。這種類(lèi)型的ADCC反應(yīng)有一個(gè)缺點(diǎn)，它會(huì)受到常與各種疾病有關(guān)的循環(huán)的抗原-抗體復(fù)合物的阻礙，它們與效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體的靶細(xì)胞結(jié)合抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)(I.C.M.Maclennan，“對(duì)有細(xì)胞毒素的淋巴細(xì)胞上的免疫球蛋白受體的競(jìng)爭(zhēng)”，Clin.Exp.Immunol.，10，p.275(1972))。由於經(jīng)典的ADCC存在上述的缺點(diǎn)，於是就提出了ADCC反應(yīng)的第二種類(lèi)型-抗體引導(dǎo)的ADCC。在支配抗體的ADCC中，先把靶特異抗體連接到效應(yīng)細(xì)胞上，然后通過(guò)該抗體，把所得的復(fù)合物引導(dǎo)到靶細(xì)胞表面上的特異抗原上。其優(yōu)點(diǎn)是，支配抗原的ADCC不會(huì)受到在宿主系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)的抗原-抗體復(fù)合物的影響。
一般，通過(guò)Fc區(qū)/Fc受體的連接，發(fā)生在抗體與效應(yīng)細(xì)胞間的相互作用是弱的。在某些情況下，抗體與效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合並不能保持一段足以使靶細(xì)胞溶解的時(shí)間。鑒于這種潛在的問(wèn)題，把抗體連接到用聚乙二醇和鄰苯二甲酸鹽油混合物進(jìn)行過(guò)預(yù)處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞上(J.F.Jones和D.M.Segal，“用覆蓋抗體的效應(yīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)依賴(lài)抗體的細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用(ADCC)增強(qiáng)抗體結(jié)合和細(xì)胞溶解的新方法”，J.Immunol.，125，pp.926-33(1980))。然而，由於抗體-效應(yīng)細(xì)胞復(fù)合物上的任何聚乙二醇和鄰苯二甲酸鹽油的殘存物會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生的毒性作用，可能會(huì)減少此方法用於體內(nèi)治療的適用性。
還提出了一個(gè)用帶有細(xì)胞毒素的藥物進(jìn)行輔助化學(xué)治療來(lái)增強(qiáng)支配抗體ADCC的方法(I.R.Mackay等，“包括左旋溶肉瘤素的輔助的細(xì)胞毒素化療在乳腺癌中對(duì)自然殺傷細(xì)胞和依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒性的作用”，Cancer Immunol.Immunother.，16，pp.98-100(1983))。然而，這種方法會(huì)由於使用細(xì)胞毒素藥物而帶來(lái)人們不希望產(chǎn)生的副作用的危險(xiǎn)。
由此看來(lái)，通過(guò)輔助或增強(qiáng)身體免疫反應(yīng)來(lái)治療癌和非惡性腫瘤的一般方法都會(huì)帶來(lái)各種缺點(diǎn)。所以，就需要一種能避免這些缺點(diǎn)，而能有效地治療癌和非惡性腫瘤的有效的方法和組合物。
本發(fā)明通過(guò)提供一種增強(qiáng)身體對(duì)癌和腫瘤免疫反應(yīng)的方法，從而解決了上面提到的問(wèn)題，此方法是通過(guò)活化調(diào)節(jié)依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒性(“ADCC”)的效應(yīng)細(xì)胞，使它們的細(xì)胞毒素活性增加到超過(guò)一般水平。然后把由本方法所得到的，以增加細(xì)胞毒活性為特征的效應(yīng)細(xì)胞，有效地用於本發(fā)明的用免疫治療法治療癌和非惡性腫瘤的方法和組合物中。此外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了一個(gè)更有效地把活化的效應(yīng)細(xì)胞引導(dǎo)到靶細(xì)胞的方法，它是通過(guò)把靶特異抗體連接到活化的效應(yīng)細(xì)胞表面的Fc受體上實(shí)現(xiàn)的，還提供了一個(gè)以這種特異抗體效應(yīng)細(xì)胞的復(fù)合物為特征的組合物。
本發(fā)明的方法和組合物可用來(lái)退化，減緩或阻止轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，以防止在體內(nèi)各處的轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)或增加宿主對(duì)致病因子再挑戰(zhàn)的免疫力。有利的是，本發(fā)明的方法和組合物，通過(guò)ADCC，增強(qiáng)了身體的細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫力的自然免疫反應(yīng)，於是就不會(huì)引起癌和腫瘤一般治療法中所特有的副作用。
在第一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一個(gè)從密度梯度離心技術(shù)或分離白細(xì)胞的其他方法獲得的大量的淋巴細(xì)胞中，預(yù)選Fc受體陽(yáng)性細(xì)胞的方法。
本發(fā)明還涉及一種處理調(diào)節(jié)依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞，以使它們的細(xì)胞毒活性增加到超過(guò)一般水平的方法。本方法的一個(gè)實(shí)施例的步驟包括由供體中回收效應(yīng)細(xì)胞和在體外活化細(xì)胞，以增加它們的依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒的活性。本發(fā)明還涉及用該方法活化的細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及到一種治療癌和非惡性腫瘤的方法和組合物。概括地說(shuō)，該方法包括把用本發(fā)明方法活化的效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)入到供體中或把活化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體中這樣的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例，把對(duì)要被治療的癌和非惡性腫瘤有特異性的抗體在它們被再導(dǎo)入到供體或轉(zhuǎn)移到受體之前，先連接到活化的效應(yīng)細(xì)胞上。
根據(jù)本發(fā)明方法對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的處理，通過(guò)增加了它們依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒素對(duì)靶細(xì)胞活性，而使它們得到活化。依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒素活性的增加范圍至少為處于正常狀態(tài)的未處理效應(yīng)細(xì)胞的1.25-25倍，在有些情況下，至少為1.25-125倍。
在不受理論約束的情況下，我們認(rèn)為依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒素活性的增加是由於在用發(fā)明方法活化的效應(yīng)細(xì)胞表面上增加了Fc受體表達(dá)的緣故。我們尤其認(rèn)為，活化的細(xì)胞能更好地調(diào)節(jié)依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒性是由於，在用本發(fā)明方法處理后，效應(yīng)細(xì)胞上存在有更多的Fc受體，所以，有Fc區(qū)的腫瘤特異抗體(覆蓋了靶細(xì)胞或外源物)更可能以一種有效的方式連接到效應(yīng)細(xì)胞上，也就是，通過(guò)抗體的Fc區(qū)連接到效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體上。這樣，就維持了這種連接，確保了得到ADCC。
此外，由於在活化的效應(yīng)細(xì)胞上有更多的Fc受體，所以，就會(huì)有大量的靶特異抗體連接到每個(gè)效應(yīng)細(xì)胞上。每個(gè)效應(yīng)細(xì)胞上抗體密度的增加不僅能使大量的抗體存在於或到達(dá)每個(gè)效應(yīng)細(xì)胞的靶轉(zhuǎn)移細(xì)胞上，而且增加了效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別或找到靶細(xì)胞的能力以便調(diào)節(jié)ADCC。對(duì)處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞這些作用總結(jié)果是增強(qiáng)了身體對(duì)靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)。這對(duì)于治療導(dǎo)致患者免疫系統(tǒng)內(nèi)降低或缺少效應(yīng)細(xì)胞的疾病是特別有利的。
用本發(fā)明的方法和組合物所治療的疾病是那些以抗體能特異地被引入的靶細(xì)胞不良增生為特征的疾病。這些疾病包括惡性和非惡性的固體或液體腫瘤，癌，骨髓瘤，肉瘤，白血病和淋巴瘤。此外，預(yù)防性地使用由本發(fā)明方法活化的效應(yīng)細(xì)胞還可以防止癌和非惡性腫瘤。
還應(yīng)理解，用本發(fā)明活化的效應(yīng)細(xì)胞，特別是與一個(gè)合適的抗體一起使用，可用來(lái)增加對(duì)任何一種靶細(xì)胞的ADCC活性。在對(duì)人靶細(xì)胞的ADCC和抗腫瘤細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，用本發(fā)明方法活化的效應(yīng)細(xì)胞證明了細(xì)胞毒素活性的增，這些人靶細(xì)胞，例如是從K562腫瘤細(xì)胞系，人骨髓性白血病(H.Pross和M.Baines，“人體自生的抗腫瘤靶細(xì)胞的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性，I.惡性病的作用”，Intl.J.Cancer，18，pp.593-604(1976));Nalm-6白血病細(xì)胞系(gift of Dr.Tucker LeBein，University of Minnesota);急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞新鮮樣品和慢性骨髓性白血病細(xì)胞新鮮制品得到的靶細(xì)胞?；罨男?yīng)細(xì)胞也證明了細(xì)胞毒素對(duì)鼠靶細(xì)胞活性的增加，這些鼠靶細(xì)胞，例如Zbtu鼠T-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞;EL-4鼠細(xì)胞(ATCC Tib-39)p815鼠細(xì)胞(ATCC Tib-64)和Yac鼠細(xì)胞(R.Kiessling等，“體外細(xì)胞毒素活性的遺傳變性和未免疫的半同源的小鼠對(duì)A鼠淋巴瘤系在體內(nèi)排斥的潛力”，Intl.J.Cancer，15，pp.933-40(1975))。
本發(fā)明的方法和組合物還可以用來(lái)治療任何一種動(dòng)物，包括人。效應(yīng)細(xì)胞的來(lái)源最好是要治療的病人。但是調(diào)節(jié)ADCC的效應(yīng)細(xì)胞既不必來(lái)自特定的病人，也不必來(lái)自特定的種。因此，來(lái)自一個(gè)病人或一個(gè)種並用本發(fā)明方法活化了的效應(yīng)細(xì)胞，就可用於另一個(gè)病人或另一個(gè)種上，產(chǎn)生出抗靶細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性。對(duì)于效應(yīng)細(xì)胞水平降低的受者，可能必須使用由另一個(gè)病人或種提供的，活化了的效應(yīng)細(xì)胞。雖然，這種用供者效應(yīng)細(xì)胞的治療最終會(huì)使細(xì)胞遭到受者的排斥，但是一般在這些細(xì)胞遭到排斥以前，活化的效應(yīng)細(xì)胞總會(huì)產(chǎn)生一定程度的依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，而這些活性足以對(duì)要治療的疾病的發(fā)展過(guò)程發(fā)生影響。
效應(yīng)細(xì)胞可以用本發(fā)明活化的效應(yīng)細(xì)胞包括任何一類(lèi)具有抗體Fc區(qū)的表面受體並能調(diào)節(jié)ADCC的細(xì)胞毒素細(xì)胞，這些效應(yīng)細(xì)胞包括，例如像淋巴細(xì)胞，單核白細(xì)胞，K細(xì)胞和NK細(xì)胞這樣的白細(xì)胞。
上述的細(xì)胞可以用很多種分法分離，包括直接從同源的供體和上述細(xì)胞1到7天的培養(yǎng)液中分離，例如可用下述的方法分離效應(yīng)細(xì)胞從小鼠體內(nèi)取出脾，剁碎，用滅菌的平衡鹽溶液清洗以及用淋巴細(xì)胞分離解質(zhì)(Lymphopaque，Accurate Chemical and Scientific Corporation，Westbury，New york)，通過(guò)離心，分離出白細(xì)胞，最終濃度為5×107細(xì)胞/毫升。
人效應(yīng)細(xì)胞可以，例如用A.Boeyum描述的改良法(見(jiàn)“淋巴細(xì)胞.分離，分級(jí)和鑒定”，J.B.Natvig等(出版)，Scand.J.Immunol.，5Suppl.5，pp.9-15(1976))從外周血中被分離。在有些情況下，白細(xì)胞群眾可通過(guò)梯度離心分離法(Ficoll-Hypaque density gradient，Pharmacia Fine Chemicals，Pis-Cataway，New Jersey)被進(jìn)一步地分類(lèi)以分離出單核白細(xì)胞。然后，可把獲得的單核白細(xì)胞或就作為效應(yīng)細(xì)胞源，或用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)作進(jìn)一步的處理，分出那些具有更多活性的細(xì)胞，或僅有Fc受體的細(xì)胞。這些技術(shù)包括利用單克隆抗體的分離或富集技術(shù)，用FACS Ⅳ(螢光活化細(xì)胞分類(lèi)器，Becton Dickinson，F(xiàn)ACS Division，Sunnyvale，California)分類(lèi)或粘連技術(shù)。
例如各種各樣的抗體都可用來(lái)獲得要用本發(fā)明方法處理的效應(yīng)細(xì)胞。用來(lái)識(shí)別，標(biāo)記，鑒定，分類(lèi)，分離，富集和/或減除在本發(fā)明方法中被處理的效應(yīng)細(xì)胞的抗體包括下列的例(1)HNK-1，Leu-7(Becton Dickinson，Mountain View，California-Catalog No.73-90)(2)Leu-11-a(Becton Dickinson-Catalog No.75-23)(3)Leu-11-b(Becton Dickinson-Catalog No.75-30)(4)Leu-11-C(Becton Dickinson-Catalog No.76-17)(5)Anti-IL2-Receptor(Becton Dickinson-Catalog No.76-40)(6)Anti-Human Fc Receptor(New England Nuclear，Boston，Massachusetts-
Catalog No.Nei033)(7)Goat Anti-Mouse IgG Fc Fragment F(ab′)2(Jackson Immuno-Research Labs，Avondale，Pennsylvania-Catalog No.115-0646)(8)Rabbit Anti-Goat IgG Fc Fragment F(ab′)2(Jackson Immuno-Research Labs-Catalog No.305-0608)(9)Rabbit Antigoat IgG(Cappel，Malvern，Pennsylvania-Catalog No.0612-3151)(10)Mouse IgGl(Catalog No.9041，Litton Bionetics Inc.，Kensington，Maryland)(11)Mopc 104E，a Purified mouse myeloma Protein(Catalog Nol 8402-29，Litton Bionetics，Inc.)例如，單核白細(xì)胞可以是用Anti-Leu-lla，Anti-Leu-llb或Anti-Leu-llc抗體(Becton Dickinson)標(biāo)記，只有這些用抗體標(biāo)記的細(xì)胞才能用陽(yáng)性選擇進(jìn)行分選?；蛘?，由于有Fc受體的細(xì)胞直徑為7μ-25μ，可采用根據(jù)大小分類(lèi)細(xì)胞的淘析離心器〔Beckman Instruments〕。
作為上述步驟一個(gè)可供選擇的辦法是當(dāng)為人由人供體獲得效應(yīng)細(xì)胞，有可能采用利用了，例如Fenwal CS-3000(Fenwal Labs，Deerfield，Illinois)或Haemonetics 30型白細(xì)胞移動(dòng)機(jī)(Haemonetics Corp.，Braintree，Massachusetts)〔T Loftus等，“白細(xì)胞電透法用Fenwal CS3000增加粒性白細(xì)胞的產(chǎn)量”，J.Clin.Apheresis，1，pp.109-14(1983)和H.Braine等，“外周血淋巴細(xì)胞體外增殖反應(yīng)和定期血移動(dòng)供體內(nèi)的血清免疫球蛋白”，J.Clin.Apheresis，2，pp.213-18(1985)〕的白血球除去法技術(shù)。白細(xì)胞電透法，允許通過(guò)一個(gè)安放在具有進(jìn)出患者線路的線路中的離心機(jī)，從循環(huán)的外周血中獲得白細(xì)胞。采集白細(xì)胞並把紅細(xì)胞再送回給病人。該技術(shù)與從一個(gè)單元的血獲得白細(xì)胞相比，其優(yōu)點(diǎn)是能收集更多的白細(xì)胞，因此，也就是更多的具有Fc受體的效應(yīng)細(xì)胞。
從患者或供體獲得效應(yīng)細(xì)胞后，把它們放入到如Hanks平衡鹽溶液這樣的平衡的鹽溶液解質(zhì)中或組織培養(yǎng)解質(zhì)中，例如用經(jīng)熱失活的5%胎兒小牛血清，5%Ultroser G或5%自體血清增補(bǔ)的RPMI-1640，也可添加抗菌素，如慶大霉素(5μg/ml)，青霉素(10units/ml)，鏈霉素(10μg/ml)或它們的混合物，在4℃冰箱中保存。如果效應(yīng)細(xì)胞要在體外保存超過(guò)24小時(shí)，就要把它們放置在含有細(xì)胞存活所需基本營(yíng)養(yǎng)的解質(zhì)中。最好，把它們經(jīng)過(guò)快速冷凍到-70℃后，進(jìn)行冷凍貯存。
根據(jù)本發(fā)明，效應(yīng)細(xì)胞的活化可以在體外，用淋巴細(xì)胞活素，同種或異種的血清，或它們的混合物處理細(xì)胞來(lái)完成。采用的淋巴細(xì)胞活素可以是由天然原料用常規(guī)技術(shù)純化的，也可以是通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的。本發(fā)明中最適用的淋巴細(xì)胞活素是r干擾素(“r-IFN”)和內(nèi)白細(xì)胞素-2(“IL-2”)。為了活化效應(yīng)細(xì)胞，它們可以單獨(dú)使用，結(jié)合使用或相繼使用。r-IFN最合適的劑量為600單位/ml，其有效范圍為200-2500單位/ml。IL-2最合適的劑量為750單位/ml，其有效范圍為30-2000單位/ml。用這兩個(gè)淋巴細(xì)胞活素進(jìn)行相繼的結(jié)合處理最好先用r-IFN處理，再用IL-2處理，其用量為已指出的單獨(dú)處理時(shí)的量。
根據(jù)本發(fā)明，效應(yīng)細(xì)胞通常在體外，用淋巴細(xì)胞活素，同種或異種的血清或它們的混合物進(jìn)行處理，並於37℃在5%CO2氣中保溫或在4℃冷藏一段足以使細(xì)胞活化的時(shí)間，以使依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒性增加到超過(guò)正常的水平，可通過(guò)相繼的采樣測(cè)定來(lái)證實(shí)活化作用。更具體地說(shuō)，在懸浮液中每ml解質(zhì)最好含105-107效應(yīng)細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞活素，同種或異種血清，或它們的混合物處理1-7天，最好是3-4天。
效應(yīng)細(xì)胞在活化后和給患者施用前，可以進(jìn)行冷凍貯藏。或者，效應(yīng)細(xì)胞也可以局部活化，冷凍貯藏，使用前再解凍和進(jìn)一步活化。例如活化的效應(yīng)細(xì)胞可以放置在用胎兒小牛血清，正常人血清，或血清代用品，如Ultro Ser G，和二甲亞砜(“DMSO”)增補(bǔ)的組織培養(yǎng)解質(zhì)中，並用控制速度的細(xì)胞冷凍設(shè)備或任何一種常規(guī)的冷凍方法，盡可能快地把它冷凍到至少-70℃。貯藏后，活化的效應(yīng)細(xì)胞在細(xì)胞溫度不超過(guò)37℃下，盡可能快地被解凍。
在本發(fā)明的方法和組合物中，抗體最好與活化的效應(yīng)細(xì)胞一起使用以調(diào)整對(duì)靶細(xì)胞增強(qiáng)了的ADCC作用，並顯示所取得的效應(yīng)細(xì)胞活化作用的程度。上述的抗體是IgG類(lèi)的，最好是IgG2抗體，它們有Fc區(qū)並能主要辨認(rèn)對(duì)特定的癌或非惡性腫瘤特異的，或在癌或非惡性腫瘤細(xì)胞上以比在正常細(xì)胞上更高密度存在的抗原。
上述的抗體包括下列的例
(1)GAGRA-Goat anti-Gross Passage A Virus(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland)(2)PAGRA-Pig anti-Gross Passage A Virus(National Institute of Health，Bethesda，Maryland)(3)Anti-CALLA(Becton Dickinson，Mountain View，California-Catalog No.7500)(4)J-5 Anti-CALLA(Coulter Immunology，F(xiàn)lorida-Catalog No.6602143)(5)BA3 Anti-CALLA(Hybritech，Inc.，San Diego，California-Catalog No.0672)(6)ANTI-HPCA-1(Becton Dickinson-Catalog No.7660)(7)Rabbit Anti-Nalm6(一個(gè)多克隆抗體，它是由用一星期靜脈注射一次1×107Nalm-6細(xì)胞，共五星期的方法超免疫一個(gè)新西蘭雌兔而產(chǎn)生的)根據(jù)本發(fā)明較好的實(shí)施例，在把細(xì)胞施用于患者以前，先把對(duì)靶轉(zhuǎn)化細(xì)胞有特異性的抗體連接到活化的效應(yīng)細(xì)胞上。這樣的連接可通過(guò)把體外活化的效應(yīng)細(xì)胞與高濃度的單一的或匯集起來(lái)的單克隆或多克隆抗體一起保溫來(lái)完成。例如可以以每2mg抗體107細(xì)胞的比率讓活化的效應(yīng)細(xì)胞與抗體接觸進(jìn)行這種連接，然后把混合物保持在室溫或37℃，或在4℃冷藏，大約1-72小時(shí)。下文中，與抗體連接了的活化效應(yīng)細(xì)胞稱(chēng)為裝備的效應(yīng)細(xì)胞(armed effectorCells)。
例如把抗體連接到已用本發(fā)明方法活化的血沉棕黃色層白細(xì)胞上，白細(xì)胞先采用離心法，用RPMI-1640洗三次，離心是用裝有TH-4轉(zhuǎn)子的Beckman TJ-6離心機(jī)，以1200rpm離心5分鐘。用多級(jí)清洗方法除去結(jié)合松散的親細(xì)胞免疫球蛋白，增加Fc受體與所需要抗體結(jié)合的效力。然后通過(guò)在密度梯度解質(zhì)，如Ficoll-Hypaque(Litton Bionetics，Bethesda，Maryland)中的離心分離，進(jìn)一步純化效應(yīng)細(xì)胞。把收集到的白細(xì)胞界面再懸浮在每0.5-2.0mg抗體含有至少5×107效應(yīng)細(xì)胞的RPMI-1640解質(zhì)中，並在緩慢搖動(dòng)的情況下，在室溫，或37℃下保溫，或在4℃下冷藏1-72小時(shí)。然后讓效應(yīng)細(xì)胞通過(guò)明膠血漿代用品，如凝膠狀胞漿(HIT Corporation，Buffalo，New york)或在密度梯度解質(zhì)，如Ficoll-Hypaque中離心分離進(jìn)行沉淀，以便在給患者施用以前，把這種抗體的連接裝配到效應(yīng)細(xì)胞上。連接到靶特異抗體上的效應(yīng)細(xì)胞就可以像下面所講的那樣可以給病人施用。
通過(guò)把用本發(fā)明方法活化的效應(yīng)細(xì)胞，以治療學(xué)上或腫瘤學(xué)上有效的劑量施用于癌或非惡性腫瘤患者，對(duì)他們進(jìn)行治療。如前所述，活化的效應(yīng)細(xì)胞最好在施用以前，讓對(duì)靶細(xì)胞特異的抗體連接到它們上面?；罨男?yīng)細(xì)胞可以以液體劑型通過(guò)靜脈注射或輸注的方式給藥?；罨?yīng)細(xì)胞的可注射/可輸注的溶液也包括常規(guī)的藥劑學(xué)上可接受的載體，如無(wú)菌的生理鹽溶液。
一次或在一個(gè)連續(xù)治療階段中，活化效應(yīng)細(xì)胞的投藥量取決于最初劑量中存在的和有效的活化效應(yīng)細(xì)胞的體積和活性，患者的健康狀況，癌或非惡性腫瘤的病歷和嚴(yán)重性以及治療醫(yī)生的判斷。有效劑量的范圍大約為1×106-5×1010細(xì)胞。治療的效果，可在治療后的不同間歇，通過(guò)分析血樣或骨髓樣(對(duì)白血病和淋巴瘤)，或通過(guò)測(cè)定腫瘤重量減少的速率(對(duì)致瘤病)來(lái)確定。
當(dāng)沒(méi)有連接抗體下施用處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，患者可用抗體或其他的物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，以增加體內(nèi)循環(huán)的抗體量，最好是對(duì)腫瘤特異的抗體。例如患者可以通過(guò)靜脈注射或輸注單一的單克隆或多克隆腫瘤特異抗體或合并兩個(gè)或更多個(gè)對(duì)腫瘤特異的單克隆或多克隆抗體進(jìn)行處理。有用的抗體是那些屬于免疫球蛋白-G“IgG”類(lèi)的、通過(guò)體外分析確定具有ADCC調(diào)節(jié)能力、以及能夠識(shí)別癌特異抗原或要優(yōu)先發(fā)現(xiàn)的抗原或者以更高的密度在癌或非惡性腫瘤細(xì)胞上的抗體。
為了能更充分地了解這里所述的發(fā)明，列示了下面的實(shí)例，這些實(shí)例僅是為了達(dá)到具體說(shuō)明的目的，無(wú)論如何不是對(duì)發(fā)明的限制。
實(shí)例下列的實(shí)例中，用兩個(gè)試驗(yàn)方法來(lái)查定效應(yīng)細(xì)胞在用本發(fā)明方法活化前后的細(xì)胞毒素活性和抗腫瘤增生的潛力。它們一個(gè)是ADCC51鉻釋放試驗(yàn)，一個(gè)是抗腫瘤細(xì)胞增生試驗(yàn)。
ADCC51鉻釋放試驗(yàn)51鉻釋放試驗(yàn)是一種測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒素活性的方法。對(duì)ADCC51鉻釋放試驗(yàn)，我們采用了由R.Perlmann和G.Perlmann闡述的改良法(見(jiàn)“純化的淋巴細(xì)胞對(duì)覆蓋抗體的小雞紅細(xì)胞的接觸性溶菌作用”Cell Immunol.，1，P.300(1970))。
用51鉻(固體鉻酸鹽)〔Dupont-New England Nuclear，Catalog ＃NEZ-030S;1mci/ml濃縮物〕如下標(biāo)記靶細(xì)胞。將2.5×106或5.0×106靶細(xì)胞吸入到一個(gè)17×100mm的塑料離心管中，分別加入0.05ml51鉻或0.1ml51鉻，在含5%的濕潤(rùn)C(jī)O2的氣氛(Forma Scientific Water Jacketed Gas Processor Incubator-Model 3315，F(xiàn)orma，Marietta，Ohio)中，於37℃下，保溫75分鐘。離心管的蓋子不要蓋得太嚴(yán)，在75分鐘保溫階段的中間，搖動(dòng)一次。加入5ml含有RPMI-1640(Gibco Laboratories，Grand Island，New york)，並添加了經(jīng)熱失活的5%胎兒小牛血清(Gibco Laboratories)的洗滌解質(zhì)洗細(xì)胞后，離心管在裝有TH-4轉(zhuǎn)子(Beckman Instruments，Palo Alto，Califonia)的Beckman TJ-6離心機(jī)中，以1200rpm轉(zhuǎn)速，離心5分鐘。除去上層清液，加入5.0ml(對(duì)2.5×106標(biāo)記細(xì)胞)或10.0ml(對(duì)5.0×106標(biāo)記細(xì)胞)洗滌解質(zhì)，使最終濃度為5.0×105標(biāo)記細(xì)胞/ml。然后取出1.0ml的標(biāo)記細(xì)胞，放到一些4ml管中，將它們分組，以供下面這樣的處理。
第一組靶細(xì)胞，未用抗體標(biāo)記，用1.5ml的洗滌解質(zhì)洗二次，以1200rpm轉(zhuǎn)速，離心5分鐘。除去上層清液后，把靶細(xì)胞再懸浮在1.0ml的洗滌解質(zhì)中，使?jié)舛葹?×105活細(xì)胞/ml。再用洗滌解質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞，濃度最終為5×104活細(xì)胞/ml。
第二組靶細(xì)胞，用抗體進(jìn)行了標(biāo)記，以1200rpm轉(zhuǎn)速，離心5分鐘。除去上層清液后，將這些小粒狀的靶細(xì)胞再懸浮在0.10-0.25ml適當(dāng)?shù)目贵w中。靶細(xì)胞與抗體的混合物，在搖動(dòng)的條件下，在室溫下，保溫30分鐘。然后把1.5ml洗滌解質(zhì)加入到混合物中，用1200rpm離心5分鐘。除去上層清液后，重復(fù)洗滌三次。用洗滌解質(zhì)再懸浮靶細(xì)胞，以使最終濃度為5×104活細(xì)胞/ml。
我們按照下述制備效應(yīng)細(xì)胞(用本發(fā)明方法活化過(guò)的或未被活化的)。用10ml含有RPMI-1640的解質(zhì)洗滌效應(yīng)細(xì)胞，在裝有TH-4轉(zhuǎn)子的Beckman TJ-6離心機(jī)中，以1200rpm轉(zhuǎn)速，離心5分鐘。除去上層清液，為了做效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＝140∶1的試驗(yàn)，用洗滌解質(zhì)再懸浮效應(yīng)細(xì)胞，使其最終濃度為7×106活效應(yīng)細(xì)胞/ml，而為了做效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＝47∶1的試驗(yàn)，用洗滌解質(zhì)再懸浮效應(yīng)細(xì)胞，使其最終濃度為2.3×106活效應(yīng)細(xì)胞/ml，這樣，對(duì)每個(gè)靶細(xì)胞就有0.5ml的效應(yīng)細(xì)胞。
把靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞接到一式三份的孔穴微量滴定板(Costor Plastics，Cambridge，Massachusetts)上。一些自發(fā)孔穴形成加靶細(xì)胞和稀釋劑的地方。最大的一些孔穴形成加靶細(xì)胞和洗滌劑的地方。效應(yīng)細(xì)胞孔穴是加效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞，在有的情況下還加稀釋劑的孔穴，而且其中的效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞可以是140∶1-1∶1。
吸取0.1ml的稀釋劑，RPMI-1640解質(zhì)，到每個(gè)自發(fā)孔穴和有最高效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例的效應(yīng)細(xì)胞孔穴中。前三個(gè)孔穴或每個(gè)靶細(xì)胞行的最大孔穴中都不加稀釋劑。然后吸0.15ml的效應(yīng)細(xì)胞到每個(gè)靶細(xì)胞行的前三個(gè)孔穴並對(duì)效應(yīng)細(xì)胞作一系列的1∶3稀釋?zhuān)皇饺荩缓?，用吸管從每個(gè)第一個(gè)孔穴中吸0.05ml效應(yīng)細(xì)胞到每個(gè)第四個(gè)孔穴中。攪勻第四個(gè)孔穴，從每個(gè)第四個(gè)孔穴中吸0.05ml效應(yīng)細(xì)胞，加到它們每個(gè)第七個(gè)孔穴中。攪勻每個(gè)第七個(gè)孔穴，吸出其內(nèi)容物0.05ml。對(duì)孔穴的兩個(gè)系列2，5和8以及3，6和9中的每一系列都重復(fù)上述的稀釋操作。再把0.1ml的靶細(xì)胞(濃度為5×104活細(xì)胞/ml)加入到每個(gè)靶細(xì)胞行的孔穴中。接著，在含有靶細(xì)胞但不含有稀釋劑的孔穴中，例如最大孔穴中，加入0.1ml的洗滌劑，Triton X-100，1%的RPMI-1640解質(zhì)。
然后平衡板的重量，以1000rpm轉(zhuǎn)速，旋轉(zhuǎn)1分鐘，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。把板於37℃，在含CO2的濕潤(rùn)空氣中，放置4小時(shí)。4小時(shí)后，以2000rpm轉(zhuǎn)速將板離心10分鐘。由每個(gè)孔穴中吸0.1ml的上清液到一個(gè)液體閃爍計(jì)數(shù)器的微量小并(Beckman Instruments)中，吸時(shí)要避免任何小形顆粒的擾動(dòng)。然后在每個(gè)管中加入1ml的閃爍合劑(Beckman HP/b)，蓋好蓋，進(jìn)行搖動(dòng)。將每個(gè)管放入到液體閃爍計(jì)數(shù)器(Beckman Instrumentsl，Model LS-3801)中，計(jì)數(shù)1分鐘，以測(cè)定放射性。
通過(guò)平均三份的51鉻測(cè)定法的每分鐘的計(jì)數(shù)(“CPM”)，根據(jù)下列公式，計(jì)算出特定靶細(xì)胞細(xì)胞毒性的百分比溶菌%＝ (試驗(yàn)的CPm-自發(fā)的CPm)/(最大的CPm-自發(fā)的CPm) ×100其中-試驗(yàn)的CPm＝有效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)靶細(xì)胞釋放出的放射性
-自發(fā)的CPm＝?jīng)]有效應(yīng)細(xì)胞存在時(shí)靶細(xì)胞釋放出的放射性-最大的CPm＝有洗滌劑存在時(shí)靶細(xì)胞釋放出的放射性抗腫瘤細(xì)胞增生試驗(yàn)抗腫瘤細(xì)胞增生試驗(yàn)是效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)ADCC，抑制體外腫瘤細(xì)胞增生能力的一個(gè)量度。
從組織培養(yǎng)并中，收集靶腫瘤細(xì)胞，用RPMI-1640洗，並把它懸浮在生長(zhǎng)解質(zhì)中，使?jié)舛冗_(dá)到1.25×104活細(xì)胞/ml。用Titer-Tek多槽吸管(made for Flow Laboraties by Eflab Oy，F(xiàn)inland)，把80ml培養(yǎng)生長(zhǎng)解質(zhì)放入96個(gè)孔穴的u型底面滅菌微量滴定板(Costar Plastics)的孔7-36中。
用RPMI-1640洗效應(yīng)細(xì)胞(用本發(fā)明方法活化的或未活化的)，並調(diào)節(jié)濃度到2.5×106活細(xì)胞/ml。將效應(yīng)細(xì)胞，涂覆在六個(gè)一樣的孔穴上，以達(dá)到總共36個(gè)孔穴中6個(gè)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例值為200∶1;100∶1;50∶1;25∶1;13∶1;6∶1。孔穴1-6，每個(gè)放濃度為2.5×106的效應(yīng)細(xì)胞160ul。從孔穴7-12的每個(gè)孔穴中取出80ul效應(yīng)細(xì)胞，把它們分別轉(zhuǎn)移到孔穴13-18中，通過(guò)重復(fù)吸移進(jìn)行混合。這樣1∶2的稀釋重復(fù)到孔穴＃36。然后從孔穴30-36中棄去80ul。將20ul合適的試驗(yàn)抗體加入到試驗(yàn)行的每個(gè)孔穴中，並把20ul的培養(yǎng)解質(zhì)加入到效應(yīng)細(xì)胞的36個(gè)對(duì)照孔穴中(“2號(hào)對(duì)照”)。隨后，把80ul的靶細(xì)胞加入到試驗(yàn)行的每個(gè)孔穴中(36個(gè)2號(hào)對(duì)照孔穴和僅含有抗體的36個(gè)對(duì)照孔穴)。36個(gè)只含有效應(yīng)細(xì)胞的對(duì)照孔穴(“1號(hào)對(duì)照”)中加入80ul培養(yǎng)解質(zhì)。
這些板於37℃，在濕潤(rùn)的5%CO2的空氣中保溫，總共24小時(shí)。保溫20小時(shí)后，所有的孔中都加入50ul濃度為20μci/ml的3H-胸苷(Dupont-New England Nuclear)。在收獲所有孔穴之前15分鐘，每個(gè)中都加入15ul濃度為1∶250的胰蛋白酶(Gibco Laboratories New york)，以便實(shí)現(xiàn)細(xì)胞從板塑料上分離。隨后，通過(guò)PHD細(xì)胞采集機(jī)(Cambridge Technology，Cambridge，Massachusetts)的自動(dòng)細(xì)胞采集，把所有的孔穴都采集到過(guò)濾盤(pán)，PHD No.240-1玻璃纖維過(guò)濾條(Cambridge Technology，Cambridge，Massachusetts)上。把干燥的濾物放入塑料的微量小并(Beckman Instruments)中，加入2.0ml的閃爍合劑(Hp/b，Beckman)，激烈搖動(dòng)，在液體閃爍計(jì)數(shù)器中對(duì)β射線計(jì)數(shù)。每分鐘的衰變(“DPM”)可以被計(jì)算出來(lái)，並對(duì)六個(gè)重復(fù)樣取平均值(“
X”)。沒(méi)有抗體的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的對(duì)照孔穴作為腫瘤增生的基礎(chǔ)。根據(jù)下列公式，可以計(jì)算出作為抗增生一個(gè)量度的抑制百分?jǐn)?shù)
當(dāng)抗增生試驗(yàn)中使用了裝備效應(yīng)細(xì)胞，用下列公式計(jì)算測(cè)定抗增生的抑制百分?jǐn)?shù)
＊“3號(hào)對(duì)照”代表在沒(méi)有靶細(xì)胞下，由裝備效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)物所得到的值。
為了對(duì)上述兩個(gè)試驗(yàn)作個(gè)比較，可以用51鉻釋放試驗(yàn)和抗腫瘤細(xì)胞增生試驗(yàn)平行地測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞的ADCC活性。在比較試驗(yàn)中，我們用根據(jù)前述方法分離的人效應(yīng)細(xì)胞，把它懸浮在添加了5mg/ml慶大霉素和5-10%胎兒小牛血清的RPMI-1640中，靶細(xì)胞用GAGPA抗體標(biāo)記了的Zbtu腫瘤細(xì)胞，采用了各種不同的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的比例(ETRatio)。51鉻試驗(yàn)進(jìn)行(如前述)4小時(shí)，抗增生試驗(yàn)進(jìn)行(如前述)24小時(shí)。估量51鉻釋放試驗(yàn)的特異細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)和估量抗腫瘤細(xì)胞增生試驗(yàn)的腫瘤增生的抑制百分?jǐn)?shù)都列示在表Ⅰ中。
表Ⅰ效應(yīng)細(xì)胞與 特異細(xì)胞試驗(yàn)＃ 增生的抑制(%)靶細(xì)胞的比率 毒性(%)100 51.7 107.450 38.5 89.41 25 30.4 59.212.5 28.1 33.36.25 18.4 25.0100 73.7 99.750 39.1 99.82 25 29.6 91.912.5 - 55.76.25 - 34.9
效應(yīng)細(xì)胞與 特異細(xì)胞試驗(yàn)＃ 增生的抑制(%)靶細(xì)胞的比率 毒性(%)100 61.5 84.250 53.0 69.43 25 41.2 46.112.5 18.6 32.36.25 6.7 24.0體外51鉻釋放試驗(yàn)的分析表明，在引起抗原調(diào)節(jié)的抗體存在下，ADCC敏感性降低。特定的單克隆抗體(結(jié)合了白血病細(xì)胞的抗原)已經(jīng)顯示出能引起抗原的調(diào)制，如CALLA(J.Ritz等，“急性成淋巴細(xì)胞白血病的血清療法與單克隆抗體”，Blood，58，pp.141-52(1981)和J.M.Pesando等，“人體與白血病有關(guān)的抗原(CALLA)的分布與調(diào)制”，J.Immunology，131，pp.2038-45(1983))。正如下述，抗增生試驗(yàn)在對(duì)準(zhǔn)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)抗原時(shí)是靈敏的，足以探測(cè)ADCC的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)是在并內(nèi)，經(jīng)受著輕微的搖動(dòng)或不經(jīng)受搖動(dòng)時(shí)進(jìn)行的。搖動(dòng)促使了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，以利於細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸，有可能使抗原的調(diào)節(jié)作用減到最小。試驗(yàn)按上述進(jìn)行，只是搖動(dòng)是把并子放在搖動(dòng)平臺(tái)(Labquake Labindustries，Berkeley，California)上建立的並調(diào)整在每分鐘大約為40-50次搖動(dòng)。腫瘤靶細(xì)胞是Zbtu和Nalm-6系。所用的抗體包括GAGPA，RaNalm或抗-CALLA(＃7500，Becton-Dickinson，Mountain View，California)?？乖錾囼?yàn)和51鉻釋放試驗(yàn)的結(jié)果列示在表Ⅱ上。
表Ⅱ特異細(xì)胞 抑制(%)靶 抗體 毒性(%) 搖動(dòng) 不搖動(dòng)Zbtu 無(wú) 6.1 0 0GAGPA 79.5 86.5 88.1Nalm-6 無(wú) 3.4 0 0RaNalm 58.9 103.5 93.8CALLA 7.1 47.3 10.9冷凍貯藏我們通過(guò)51鉻釋放試驗(yàn)，做了些試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)冷凍貯藏(-75℃)對(duì)效應(yīng)細(xì)胞ADCC活性的影響。靶細(xì)胞是帶有GAGPA抗體的Zbtu腫瘤。效應(yīng)細(xì)胞按上述取自三個(gè)健康人供體，並根據(jù)Pross等“用於生物學(xué)反應(yīng)變更研究的NK細(xì)胞試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化”，J.Immunological Methods，68，pp.235-49(1984)，的技術(shù)進(jìn)行冷凍。12-58天后解凍，按前面講過(guò)的那樣，用標(biāo)準(zhǔn)洗滌解質(zhì)再補(bǔ)洗兩次。解凍的效應(yīng)細(xì)胞，按前面講過(guò)的方法進(jìn)行活化。表Ⅲ列示了冷凍前后細(xì)胞的存活力，用細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)表示的ADCC活性和冷凍后活細(xì)胞恢復(fù)的百分比數(shù)。
表Ⅲ%存活力 %細(xì)胞毒性 %恢復(fù)的供體天0 天(×) 天0 天(×) 活細(xì)胞數(shù)1 94 93(12) 76 68(12) 672 92 80(34) 71 49(34) 583 97 94(58) 71 58(58) 62被治療的腫瘤根據(jù)本發(fā)明方法，被治療的動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤，例如是Zbtu，起源於胸腺內(nèi)注射Gross Passage A病毒的C3Hf近系繁殖鼠的T-細(xì)胞白血病/淋巴瘤。割除初生的胸腺瘤，用滅菌的生理鹽水懸浮細(xì)胞並將它由內(nèi)腹膜注射到正常的C3Hf成年鼠受體鼠內(nèi)，以誘發(fā)腹水形式的腫瘤。這種腫瘤自1970年開(kāi)始在體內(nèi)已被連續(xù)地轉(zhuǎn)移。平均殘存時(shí)間為16天的C3Hf鼠有少於10個(gè)細(xì)胞的LD100。這種腫瘤的亞系已適應(yīng)於在體外生長(zhǎng)，並不顯示出腫瘤形成的明顯損失。Zbtu腫瘤細(xì)胞表達(dá)了下列的表面抗原，它們可用完全依賴(lài)于血清毒性的非直接免疫熒光法，F(xiàn)ACS(螢光活化細(xì)胞分析器)分析法以及ADCC來(lái)檢測(cè)(1)Thy1.2(2)gp70(3)P12(4)Gross Passage A Virus根據(jù)本發(fā)明方法，用於體內(nèi)治療鼠的抗體是GAGPA抗體。
實(shí)例1對(duì)C3Hf同系繁殖的小鼠〔在明尼蘇達(dá)鼠群大學(xué)繁殖並從馬里蘭州沃克斯維爾(Walkersville)的微生物學(xué)會(huì)得到〕在第0、7和14天通過(guò)將C57B1/6J〔緬因州，巴爾哈鮑(Bar Harbor)的杰克遜(Jackson)實(shí)驗(yàn)室〕種供體全脾組織的5×5毫米切片移植到耳囊中進(jìn)行三次異種抗原接觸。在第17天，從接觸異種抗原的小鼠和正常鼠令對(duì)照組上無(wú)菌切除宿主的脾，將脾細(xì)胞通過(guò)一個(gè)304型CX-30號(hào)的不銹鋼目篩(Small Part公司，弗羅里達(dá)，邁阿密)而被采集到用5%小牛胚胎血清增補(bǔ)的“完全Dulbecco最小基本培養(yǎng)基中(紐約州Grand Island，Gibco實(shí)驗(yàn)室)。在具有1.0×107細(xì)胞/毫升的C57B1/6J刺激細(xì)胞濃度下、且反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞的比例為1∶1的情況下，將脾細(xì)胞放在單向混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物(“MLC”)〔J.C.Cerottini等人“體外T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒的產(chǎn)生，I.在混合白血細(xì)胞培養(yǎng)物中正常小鼠和免疫小鼠脾細(xì)胞的反應(yīng)”J.Exp.Med.(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志)，140卷703頁(yè)(1974)〕中培養(yǎng)3-7天，反應(yīng)細(xì)胞在對(duì)GAGPA抗體標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞(表Ⅳ)進(jìn)行的51鉻釋放試驗(yàn)(以前講到過(guò))中被用作為效應(yīng)細(xì)胞。
在體內(nèi)治療具有大于1×105個(gè)Zbtu白血病細(xì)胞的小鼠時(shí)，反應(yīng)細(xì)胞也用作效應(yīng)細(xì)胞。把含有1.0×107效應(yīng)細(xì)胞的平衡鹽溶液以及在某些情況下和GAGPA抗體一起以靜脈注射方式注射到患白血病的C3HF小鼠中(表Ⅴ)。在表Ⅵ中A組代表已經(jīng)接受0.1毫升GAGPA和0.2毫升平衡鹽溶液靜脈注射的10只小鼠，B組代表已接受0.1毫升正常羊血清和含0.2毫升(1.0×107活細(xì)胞)效應(yīng)細(xì)胞的平衡鹽溶液靜脈注射的10只小鼠，C組代表已接受0.1毫升GAGPA和含0.2毫升(1.0×107)效應(yīng)細(xì)胞的平衡鹽溶液靜脈注射的10只小鼠。
表Ⅳ特異ADCC的百分比-5天MLC效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞比例 未接觸抗原的 接觸抗原的140∶1 19.9 56.047∶1 10.4 47.016∶1 8.3 31.2表Ⅴ治療后的具有腫瘤小鼠的存活百分比組別 6周 10周 18周A 20 0 0B 10 0 0C 100 90 40實(shí)例2從健康的人供體的外周血液中如下地分離出效應(yīng)細(xì)胞由靜脈穿刺從供體抽取一個(gè)單位(450CC)的外周全血放入含有63毫升抗凝劑-磷酸檸檬酸鹽-葡萄糖腺嘌呤-1溶液的一個(gè)CPDA血袋中，並置于十個(gè)50毫升的試管中，然后，血樣在具有TH-4轉(zhuǎn)子的Beckman TJ-6離心機(jī)上以1200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離10分鐘，使得血細(xì)胞沉淀，白細(xì)胞形成一層淺黃色覆蓋層，通過(guò)該血漿上層用吸管吸取。
從每個(gè)管子中收集該淺黃色層，並在為了進(jìn)一步分選出效應(yīng)細(xì)胞而進(jìn)行密度離心分離之前，將它們集中到一個(gè)50毫升的試管中，然后加Hank平衡鹽溶液至體積為17.3毫升，在50毫升玻璃管中小心地將該容積分層到14毫升的Ficoll-hypaque上。在20℃溫度下，在具有TH-4轉(zhuǎn)子的Beckman TJ-6離心機(jī)上將該管以1400轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離30分鐘，用吸管移棄上層，收集其界面白細(xì)胞，置于一個(gè)50毫升玻璃管中，加入30毫升滅菌洗滌介質(zhì)(用至少2%本體血清增補(bǔ)的RPMI-1640)，該管以1400轉(zhuǎn)/分離心分離15分鐘，去除上清液，將效應(yīng)細(xì)胞重新懸浮在8-10毫升洗滌介質(zhì)中。然后，取少量的懸浮液置于一個(gè)小管中。然后吸取所需容積的效應(yīng)細(xì)胞，並在洗滌介質(zhì)或?qū)嶒?yàn)介質(zhì)中洗兩次。將這種白細(xì)胞以1×107細(xì)胞/毫升的濃度懸浮在RPMI-1640培養(yǎng)介質(zhì)中。
然后，在按前面講過(guò)的方法制備的、與同種的(由無(wú)關(guān)供體匯集的)或異種的(由C57B1/6J繁殖鼠的脾匯集的)經(jīng)輻射成2500R刺激細(xì)胞具有1∶1比例的單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)這些白細(xì)胞。在與刺激細(xì)胞混合之前(第0天)以及與刺激細(xì)胞一起保持在培養(yǎng)物中3至7天后，反應(yīng)細(xì)胞在對(duì)未標(biāo)記的或用GAGPA標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行的51鉻釋放試驗(yàn)中用作為效應(yīng)細(xì)胞。表Ⅵ表示了ADCC活性的增加，是在用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞的51鉻釋放試驗(yàn)中(效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞＝140∶1)測(cè)定的。
表Ⅵ特異ADCC的百分比刺激細(xì)胞 0天 3天 5天 7天同種的 38.1 61.3 86.2 79.5異種的 38.1 53.2 66.6 59.7實(shí)例3除了血放在250毫升瓶中而不是10個(gè)50毫升的試管以及不匯集其淺黃色白細(xì)胞層外，按照例2指出的步驟由健康的人供體取得450毫升的外周血液。將白細(xì)胞以1×107細(xì)胞/毫升的濃度在具有不同量γ干擾素(細(xì)胞產(chǎn)品公司，Buffalo，New York)情況下懸浮在含有慶大霉素(5微克/毫升)的RPMI-1640培養(yǎng)介質(zhì)中，γ干擾素以100-1000單位/毫升范圍的量存在。得到的培養(yǎng)物在4℃的空氣中、或37℃含5%CO2的空氣恒溫箱中保持1-4天。在與干擾素混合之前以及在1～4天的干擾素各處理期后，處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞被用在對(duì)未標(biāo)記或用GAGPA抗體標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行的51鉻釋放ADCC試驗(yàn)中。表Ⅶ表明了處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞的ADCC活性的增加，它是51鉻釋放試驗(yàn)中(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞＝140∶1)測(cè)得的。
表Ⅶ特異ADCC的百分比單位 4℃ 37℃IFN 0天 1天 2天 4天 1天 2天 4天100 36.3 39.1 43.7 45.9 42.8 46.6 39.1200 36.3 ND ND ND 49.7 51.9 59.3600 36.3 43.8 51.1 49.4 36.4 53.6 51.21000 36.3 33.2 36.1 39.4 ND ND ND-特異ADCC的百分比是平均值-ND＝未測(cè)實(shí)例4如例3一樣地分離人的白細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞，並以1×107細(xì)胞/毫升的濃度將它們懸浮在含有慶大霉素(5微克/毫升)的RPMI-1640培養(yǎng)介質(zhì)中。將重組體內(nèi)白細(xì)胞素-2(Genzyme公司，Boston，Massachusetts)加入效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，其量的范圍為30到750單位/毫升。
這樣得到的培養(yǎng)物在4℃的空氣中或37℃含5%CO2的空氣恒溫箱中保溫1至4天處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞在與該內(nèi)白細(xì)胞素-2混合之前和在1～4天的內(nèi)白細(xì)胞素-2的各種處理期限后被用在對(duì)未標(biāo)記或用GAGPA標(biāo)記的Zbtu腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的51鉻釋放ADCC試驗(yàn)中。
表Ⅷ特異ADCC的百分比單位 4℃ 37℃IL-2 0天 1天 2天 4天 1天 2天 4天30 43.2 36.9 46.3 51.2 51.6 62.3 55.450 43.2 ND ND ND 39.5 51.9 60.7100 43.2 48.7 49.6 54.6 ND ND ND250 43.2 39.2 55.4 49.3 56.4 62.1 57.8500 43.2 ND ND ND 60.6 63.7 59.4700 43.2 36.1 52.7 61.1 61.4 60.9 58.3特異ADCC百分比是平均值ND＝未測(cè)實(shí)例5如實(shí)例4一樣地分離人的白血球效應(yīng)細(xì)胞，並以1×107細(xì)胞/毫升的濃度把它懸浮在含有慶大霉素(5微克/毫升)的RPMI-1640培養(yǎng)介質(zhì)中，然后以100-1000單位/毫升之間變化的量將γ干擾素(細(xì)胞產(chǎn)品公司，Buffalo，紐約)加到培養(yǎng)基中，在37℃含5%CO2的空氣恒溫箱中保持培養(yǎng)物1～4天。然后，效應(yīng)細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)介質(zhì)中洗三次，除去所加的干擾素，然后以100-1000單位/毫升之間變化的量把內(nèi)白細(xì)胞素-2加到這些細(xì)胞中，並在37℃含5%CO2的空氣恒溫箱中保持1～4天。然后這些效應(yīng)細(xì)胞在與淋巴細(xì)胞活素混合之前以及在用淋巴細(xì)胞活素處理的各種處理期限后，被用于對(duì)未標(biāo)記的Zbtu和未標(biāo)記的Nalm-6腫瘤靶細(xì)胞，GAGPA抗體標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞和兔的抗-Nalm-6標(biāo)記的Nalm-6腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行的51鉻釋放ADCC試驗(yàn)中，測(cè)定ADCC的百分比活性。
表Ⅸ說(shuō)明了處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞ADCC活性的增加(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞的比率為140∶1)表Ⅸ特異ADCC的百分比GAGPA標(biāo)記的 兔的抗Nalm-6標(biāo)記Zbtu靶細(xì)胞 的Nalm-6靶細(xì)胞組 0天 2天 4天 6天 0天 4天A 41.4 66.7 89.1 76.3 36.3 75.2B 41.4 ND 79.8 73.6 36.3 88.7C 41.4 90.1 106.5 101.3 36.3 94.3D 41.4 88.2 91.4 ND 36.3 NDE 41.4 75.5 86.3 89.1 36.3 NDA- 600單位IFN，500單位IL-2B- 600單位IFN，250單位IL-2C- 200單位IFN，600單位IL-2D- 600單位IFN，600單位IL-2E- 1000單位IFN，100單位IL-2對(duì)各組，效應(yīng)細(xì)胞在IFN(第一)，和IL-2(第二)中培養(yǎng)相等的時(shí)間。
ND-未測(cè)定實(shí)例6如實(shí)例5一樣地分離人的白血球效應(yīng)細(xì)胞，並以1×107細(xì)胞/毫升的濃度將它們懸浮在具有本體血清的RPMI-1640中。然后用51鉻釋放ADCC試驗(yàn)測(cè)定這些細(xì)胞的ADCC百分率。
隨后，在RPMI-1640介質(zhì)中清洗效應(yīng)細(xì)胞三次，除去本體血清，並將它們懸浮在含慶大霉素(5微克/毫升)、並用1%Ultroser G，5%本體血清，5%小牛胚胎血清或5%同種血清增補(bǔ)的RPMI-1640培養(yǎng)介質(zhì)中。將這種培養(yǎng)物在4℃空氣中或37℃含5%CO2的空氣恒溫箱中保持1～4天，將這些效應(yīng)細(xì)胞在與任一RPMP-1640的增補(bǔ)介質(zhì)混合前以及在各種處理期之后，用于對(duì)未標(biāo)記的Zbtu和未標(biāo)記的Nalm-6腫瘤靶細(xì)胞，GAGPA抗體標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞，抗-CALLA標(biāo)記的Nalm-6靶細(xì)胞和兔的抗-Nalm-6標(biāo)記的Nalm-6腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的51鉻釋放ADCC試驗(yàn)中，測(cè)定其百分比ADCC活性。
表Ⅹ說(shuō)明處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)GAGPA抗體標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞ADCC活性的增加(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞的比例＝140∶1)表Ⅺ說(shuō)明處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)用抗CALLA或兔的抗Nalm-6抗體標(biāo)記的Nalm-6腫瘤靶細(xì)胞ADCC活性的增加(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞的比例＝140∶1)
表Ⅹ特異ADCC的百分比4℃ 37℃培養(yǎng)介質(zhì) 0天 1天 2天 4天 1天 2天 4天A 38.6 39.6 41.3 38.6 39.3 40.2 42.8B 38.6 43.1 36.3 31.8 41.4 33.2 36.8C 38.6 68.7 83.2 79.4 81.5 93.1 86.4D 38.6 64.4 69.7 91.5 86.7 78.5 85.3表Ⅺ特異ADCC的百分比培養(yǎng) 抗CALLA標(biāo)記的 兔的抗Nalm-6標(biāo)記的介質(zhì) Nalm-6靶細(xì)胞(37℃) Nalm-6靶細(xì)胞(37℃)0天 2天 0天 2天A 12.1 17.3 32.1 31.1B 12.1 13.4 32.1 39.5C 12.1 37.8 32.1 69.4D 12.1 39.1 32.1 61.6A- 用1%Ultroser G(LBK Industries，Gaitherburg，Maryland)增補(bǔ)的RPMI-1640B- 用本體血清增補(bǔ)的RPMI-1640C- 用熱失活的5%小牛胚胎血清(Gibco實(shí)驗(yàn)室，Grand Island，紐約)增補(bǔ)的RPMI-1640
D- 用5%采集的同種血清增補(bǔ)的RPMI-1640實(shí)例7如例6所述那樣分離人的效應(yīng)細(xì)胞，並把它們懸浮在用5%本體血清或1%Ultroser G(失活細(xì)胞)增補(bǔ)的RPMI-1640中，或懸浮在用5%小牛胚胎血清(失活細(xì)胞)增補(bǔ)的RPMI-1640中，以得到細(xì)胞濃度為1×107細(xì)胞/毫升的每種懸浮液，在1或2天的處理周期后，通過(guò)這些處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)用GAGPA抗體標(biāo)記的Zbtu靶細(xì)胞和用兔的抗Nalm-6抗體標(biāo)記的Nalm-6靶細(xì)胞的ADCC測(cè)定其百分比抗增生的活性。
表Ⅻ證明了由于處理過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞，抑制了腫瘤靶細(xì)胞的增生。
表Ⅻ抗增生的百分比效應(yīng)細(xì)胞 Zbtu靶細(xì)胞 Nalm-6靶細(xì)胞1天 2天 1天 2天失活的 24.3 32.1 20.1 19.6活性的 84.2 78.8 82.6 92.3用單克隆抗體去連接、因而“裝備”效應(yīng)細(xì)胞可用51鉻釋放試驗(yàn)和抗增生試驗(yàn)兩種方法評(píng)價(jià)。對(duì)能夠識(shí)別在Zbtu細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原的單克隆抗體進(jìn)行分析，以確定它們調(diào)節(jié)ADCC的能力。
IgG 2a類(lèi)的單克隆抗體，抗Thy 1.2(＃630021 Miles Scientific)和IG2b類(lèi)的單克隆抗體，抗Thy1.2(＃1330Becton-Dickinson，Mountain View，加利福尼亞)能識(shí)別在鼠的“T”細(xì)胞和Zbtu腫瘤細(xì)胞系上表達(dá)的Ty1.2抗原。這種試驗(yàn)用未標(biāo)記的或用GAGPA標(biāo)記的Zbtu靶細(xì)胞作為對(duì)照。人的效應(yīng)細(xì)胞或是用抗體(GAGPA或Thy 1.2)“裝備”了的或是未裝備的(未處理過(guò)的)。這些試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表ⅩⅢ表ⅩⅢ靶細(xì)胞 抗體 效應(yīng)細(xì)胞 特異細(xì)胞毒 抑制增生的性的百分比 百分比Zbtu None 未裝備的 5.9 0Zbtu GAGPA 未裝備的 79.1 86.6Zbtu GAGPA 裝備的 65.3 79.7Zbtu THY1.2(2a) 未裝備的 78.6 104.5Zbtu THY1.2(2a) 裝備的 74.3 88.8Zbtu THY1.2(2b) 未裝備的 82.5 86.3Zbtu THY1.2(2b) 裝備的 75.4 89.8實(shí)例9由8個(gè)診斷有白血病人供體每人的外周血液抽取50毫升血放到含有2毫升肝素(肝素鈉注射劑-1000USP單位/毫升，Elkins-Sinn公司，Cherry Hill，New Jersey)抗凝劑的60毫升注射器中，然后如例2所述那樣分離白細(xì)胞，在不作進(jìn)一步處理的情況下，通過(guò)對(duì)未標(biāo)記的和GAGPA抗體標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞以及本體腫瘤靶細(xì)胞的51鉻釋放ADCC試驗(yàn)，對(duì)效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行分析作為對(duì)照。
培養(yǎng)過(guò)的效應(yīng)細(xì)胞以1×107細(xì)胞/毫升的濃度用含有慶大霉素的10%同種或10%異種血清刺激1～5天，再測(cè)試ADCC。表ⅩⅣ表明白血病供體效應(yīng)細(xì)胞對(duì)各種Zbtu腫瘤細(xì)胞和本體腫瘤靶細(xì)胞調(diào)節(jié)ADCC的能力。
表ⅩⅣ特異ADCC的百分比Zbtu靶細(xì)胞 本體腫瘤靶細(xì)胞病人號(hào) 診斷 治療 情況 0天 2天 0天 2天1 ALL CC 急性 32.6 58.4 31.1 53.42 CML CC 復(fù)發(fā) 14.0 21.1 13.3 37.73 CLL CC Rem 49.5 83.4 ND ND4 ALL CC Rem 19.8 62.7 ND ND5 CLL CC 復(fù)發(fā) 8.7 12.2 5.4 18.76 CML BMT Rem 31.4 60.9 ND ND7 T淋巴 CC Rem 23.2 71.1 ND ND8 CLL CC Rem 45.1 52.4 ND ND定義ALL-急性淋巴細(xì)胞白血病CLL-慢性淋巴細(xì)胞白血病CML-慢性骨髓性白血病Tlymph-“T”細(xì)胞淋巴瘤CC-結(jié)合化療BMT-骨髓移植(同種的)Rem-緩解ND-未測(cè)表ⅩⅣ中2號(hào)和5號(hào)病人在外周血液樣中已經(jīng)廣泛污染了腫瘤細(xì)胞。在這兩個(gè)病人中，大于80%的效應(yīng)細(xì)胞是惡性的。因此，調(diào)節(jié)過(guò)的每個(gè)這種病人血樣中的效應(yīng)細(xì)胞的濃度相當(dāng)于從其它病人得到血樣中的效應(yīng)細(xì)胞濃度恢復(fù)的20%左右。此外，他們是在治療時(shí)處于緩解的病人3，4，6，7，8的外周血液中沒(méi)有任何循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞。
實(shí)例10來(lái)自4個(gè)診斷有白血病人每人的外周血液得到白細(xì)胞。如例8所述那樣抽取和分離白細(xì)胞。這種白細(xì)胞在用10%小牛胚胎血清增補(bǔ)的RPMI-1640中，在37℃濕潤(rùn)C(jī)O2(10%)的恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。用對(duì)未標(biāo)記的或用GAGPA多克隆抗體Thy 1.2-2a或Thy1.2-2b單克隆抗體記標(biāo)的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行的51鉻釋放ADCC試驗(yàn)分析效應(yīng)細(xì)胞，結(jié)果列于表ⅩⅤ。
表ⅩⅤ病人號(hào) 診斷 治療 情況 抗體沒(méi)有 GAGPA Thy 1.2(2a) (2b)1 CML CC Rem 0 16 39 132 ALL CC Rem 0 68 71 643 CML 未 慢性的 1 22 45 164 CML 未 慢性的 1 39 65 23
實(shí)例11由五個(gè)診斷具有白血病人每人的外周血液得到白血細(xì)胞，如例8所述的那樣抽取血液並分離白細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞用以下五個(gè)程序之一處理(1)不處理;(2)在用10%小牛胚胎血清增補(bǔ)的RPMI-1640中培養(yǎng)48小時(shí);(3)在用IL-2(70單位/毫升)增補(bǔ)的RPMI-1640中培養(yǎng)48小時(shí);(4)在用IFE(300單位/毫升)增補(bǔ)的RPMI-1640中培養(yǎng)48小時(shí);(5)在用IFN(300單位/毫升)增補(bǔ)的RPMI-1640中培養(yǎng)24小時(shí)。在標(biāo)準(zhǔn)洗滌介質(zhì)(如上述)洗兩次，在IL-2(70單位/毫升)中另外再培養(yǎng)24小時(shí)，所有的培養(yǎng)物在37℃濕潤(rùn)的CO2(10%)恒溫器中培養(yǎng)。用對(duì)GAGPA多克隆抗體標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行51鉻釋放ADCC試驗(yàn)分析效應(yīng)細(xì)胞。結(jié)果例于表ⅩⅥ中表ⅩⅥ病人號(hào) 診斷 治療 情況 0天 FCS IL-2 IFN IFN/IL-21 ALL 未 急性 23 - - 30 312 CML 未 慢性 39 45 45 - -3 CML CC 緩解 16 40 28 - -4 CML CC 復(fù)發(fā) 12 33 20 - 215 CML 未 慢性 22 51 - - -實(shí)例12用血流血球計(jì)數(shù)法分析按本發(fā)明的方法活化的效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)結(jié)合了單克隆抗體Len-Ⅱa的效應(yīng)細(xì)胞用直接免疫螢光法，而對(duì)結(jié)合了Leu-Ⅱb的用間接免疫螢光法。Leu-Ⅱa和Leu-Ⅱb是被認(rèn)為能識(shí)別在大顆粒淋巴細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中Fc受體的抗體(B.Perussia等人，“人體自然殺傷細(xì)胞IgG的Fc受體用單克隆抗體進(jìn)行遺傳表型的，功能的和對(duì)比的研究”J.Immunol，133卷180頁(yè)(1984)〕。
如例5那樣分離人的白血球效應(yīng)細(xì)胞，並按照分別在例7，3，4和5中提出的步驟用本體血清或小牛胚胎血清、r-IFN、IL-2、或r-IFN+IL-2混合物處理這些細(xì)胞。處理的具體時(shí)間和溫度，以及所用的血清或淋巴細(xì)胞活素的濃度在表ⅩⅦ中指出。
收取每個(gè)處理組的細(xì)胞，並以1×106活細(xì)胞/毫升的濃度將它們懸浮在磷酸鹽緩沖液中(PBS，0.01M磷酸鹽，0.15M Nacl，PH7.2-7.4)。並洗滌這些細(xì)胞，用具有TH-4轉(zhuǎn)子的Beckman TJ-6離心機(jī)在1200rpm下離心分離5分鐘。將這些細(xì)胞顆粒分成4組，並在以下每一組中懸浮一種顆粒。
A組Leu-Ⅱa，5ul抗體，40ulPBS，以獲得1∶9的稀釋度。
B組小鼠IgGI，6ul 1×106個(gè)細(xì)胞的200ug/ml濃度，(非特異對(duì)照)C組Leu-Ⅱb，5ul抗體，40ulPBS，以獲得1∶9的稀釋度。
D組MoPc 104E純化的小鼠骨髓瘤蛋白質(zhì)，5ul，每1×106細(xì)胞稀釋度為1∶5(非特異對(duì)照)4組細(xì)胞的每一組在一遮光的容器中，在4℃下培養(yǎng)30分鐘。然后洗效應(yīng)細(xì)胞兩次，每次加1.0ml PBS，並在1200rpm離心分離這種混合物5分鐘。
然后將A組和B組的每一組細(xì)胞再懸浮在0.1ml PBS中，到濃度為1×106活細(xì)胞/ml並進(jìn)行分析。
將C組和D組的每一組細(xì)胞再懸浮在通過(guò)加入0.1ml的，在PBS中稀釋度為1∶50的抗體，而與羊的抗鼠IgM抗體(Tago，Inc.Burlingaml，加里福尼亞)結(jié)合的親合純化的異硫氰酸螢光素鹽(FITC)中。然后，這些效應(yīng)細(xì)胞在一個(gè)遮光的容器中，在4℃下再培養(yǎng)30分鐘將每組細(xì)胞洗兩次，每次加0.1ml PBS，在1200rpm下將混合物中離心分離5分鐘。然后，將每組細(xì)胞重新懸浮在1.0ml PBS中至濃度為1.0×106存在細(xì)胞/ml，並進(jìn)行分析。
然后，在用血清或淋巴細(xì)胞活素處理前或血清或淋巴或淋巴細(xì)胞活素處理並接觸抗體后在FACS Ⅳ細(xì)胞分離器中通過(guò)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)這些效應(yīng)細(xì)胞的免疫螢光特性。
用400mW，488nM的光(氬激光)激發(fā)FITC。用一個(gè)90°再聚焦透鏡收集螢光輻射。綠光通過(guò)一個(gè)530uM的帶通濾波器送到一個(gè)光電倍增管中(EMI.nu，99224A)，綠螢光90°角的光散射峰值電信號(hào)由模擬量轉(zhuǎn)換成數(shù)字量。由一個(gè)線性放大器放大，並分配到256個(gè)通道上。用在X軸上的螢光通道數(shù)和在y軸上的相對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)畫(huà)出直方圖。(B和D組)沒(méi)有特殊對(duì)照的值。將實(shí)驗(yàn)數(shù)值減去非特異對(duì)照值(B和D組)以得到平均通道值和陽(yáng)性細(xì)胞的百分比(實(shí)驗(yàn)的平均通道一對(duì)照的平均通道二平均通道差和陽(yáng)性細(xì)胞的百分比)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比數(shù)據(jù)反映了具體與抗體結(jié)合的細(xì)胞數(shù)。平均通道數(shù)據(jù)表明陽(yáng)性細(xì)胞免疫螢光的強(qiáng)度。因而也表明了發(fā)生與抗體結(jié)合的相對(duì)量。
這些效應(yīng)細(xì)胞還在用血清或淋巴細(xì)胞活素處理前以及在這些處理和接觸抗體后，用于對(duì)GAGPA抗體-標(biāo)記的Zbtu腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行的51鉻釋放ADCC試驗(yàn)中。
已具體參照發(fā)明最佳形式敘述了我們的發(fā)明。顯然，對(duì)于該技術(shù)領(lǐng)域：
中的專(zhuān)業(yè)人員，在不脫離本發(fā)明的要旨和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的變化和改進(jìn)，本發(fā)明的要旨和范圍是由所附的權(quán)利要求
規(guī)定的。
權(quán)利要求
1.一個(gè)處理具有抗體FC區(qū)表面受體的效應(yīng)細(xì)胞以增加它們的依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞素活性的方法，包括在體外用由淋巴細(xì)胞活素、同種異型血清、異種血清或其混合物中選出的一種材料活化所說(shuō)的效應(yīng)細(xì)胞的步驟，以使所說(shuō)效應(yīng)細(xì)胞的依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞素的活性至少增加到效應(yīng)細(xì)胞在它們自然狀態(tài)下活性的1.25到125倍之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)將一種抗體連接到活化的效應(yīng)細(xì)胞上的步驟，所說(shuō)的抗體具有一個(gè)FC區(qū)，並主要識(shí)別癌或非惡性腫瘤上的特異抗原或以比正常細(xì)胞更高的密度出現(xiàn)在癌或非惡性腫瘤上的抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其特征為所說(shuō)的效應(yīng)細(xì)胞選自于白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、K細(xì)胞和NK細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其特征為所說(shuō)淋巴細(xì)胞活素選自γ干擾素、內(nèi)白細(xì)胞素(interleukin)-2或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其特征為所說(shuō)異種血清是小牛胚胎血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其特征為所說(shuō)化合物處理1至7天的時(shí)間周期。
7.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其特征為所說(shuō)癌或非惡性腫瘤選自于固體的腫瘤、液體的腫瘤、骨髓瘤、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其特征為所說(shuō)抗體是IgG抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其特征為所說(shuō)抗體是IgG2抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其特征為所說(shuō)效應(yīng)細(xì)胞的供體是所說(shuō)效應(yīng)細(xì)胞的受體。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1和2的方法的一種效應(yīng)細(xì)胞。
12.用于治療癌或非惡性腫瘤的一種組合物，它含有對(duì)癌癥是有效量的權(quán)利要求
11的效應(yīng)細(xì)胞。
13.一種治療癌和非惡性腫瘤的方法，其特征為包括了用根據(jù)權(quán)利要求
12的組合物治療一種哺乳動(dòng)物的步驟。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明是有關(guān)癌和非惡性腫瘤的免疫治療的方法和組合物。更具體的說(shuō)，本發(fā)明是有關(guān)通過(guò)提高調(diào)節(jié)依賴(lài)抗體細(xì)胞的細(xì)胞毒性的細(xì)胞素活性來(lái)增強(qiáng)身體的免疫反應(yīng)的方法和組合物。根據(jù)本發(fā)明得到的這些細(xì)胞是以提高細(xì)胞素活性為特征的，這些細(xì)胞用于治療各種類(lèi)型的癌和非惡性腫瘤的方法和組合物中。
文檔編號(hào)A61K35/14GK86104913SQ86104913
公開(kāi)日1987年5月27日 申請(qǐng)日期1986年6月28日
發(fā)明者加里·R·蘭杜希, 托尼·N·馬里尼 申請(qǐng)人:明尼蘇達(dá)州大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan