專利名稱：制備鼻內施用疫苗的方法
副流感病毒是副粘液病毒組的成員之一，該組還包括流行性腮腺炎病毒和新城病病毒。人類的3型副流感病毒(PI3血吸附1型)可能是造成(特別是兒童中)嚴重呼吸道疾病的副流感病毒類中的最常見者。副流感病毒1型和2型具有相似的流行病形式，并且經常造成1-4歲兒童的哮吼。已經報道了副感冒病毒1-4型之間的免疫原性關系以及副流感病毒與流行性腮腺炎病毒之間的免疫原性關系，盡管對有關的蛋白組成的情況所知有限。
以往已經報道過用福爾馬林滅活的病毒對兒童進行免疫以抵抗副流感病毒性侵染的各種嘗試，但是這類制劑均沒有提供有效的保護。隨后的有關免疫抵抗副粘液病毒的研究結果傾向于指明用化學處理滅活病毒可能破壞一些負責誘導保護性免疫應答的重要抗原位點。
另外還提出的有用修飾的活病毒免疫以抵抗呼吸道病原體。已經嘗試過的有通過鼻內施用稀釋的病毒以及用更常規(guī)的途徑如皮下、腹腔內、肌肉和靜脈內等。在這些情況中，通過鼻腔內施用稀釋病毒所引起的免疫應答不能被認為是意想不到的，因為疫苗中的修飾的活病毒遵循野生型病毒的天然感染途徑，通過臨床癥狀不明顯的感染來造成免疫性。然而，用修飾的活病毒進行免疫會留下一些危險，因為既便是無毒性的但仍然活著的病毒在施給受者后仍然可能回復到其毒性狀態(tài)。
以前已經報道的過，副粘液病毒的外殼糖蛋白HN和F是負責感染過程的開始和進展的。有關研究表明，這些糖蛋白的抗體在防止感染方面是有效的。
我們以前報道過發(fā)現(xiàn)了由人類3型副流感病毒包被糖蛋白與脂肪復合所得的新型病毒性亞單位疫苗能夠誘發(fā)抗體反應，該反應比由原先所用的福爾馬林滅活病毒性疫苗制劑所獲得的反應更為優(yōu)越(Rayetal.，J.Infect.Dis.，1521219-1230〔1985〕)。對使用這種新型亞單位疫苗的研究表明，一次皮下免疫就可以完全不受感染(同上)。還發(fā)現(xiàn)分離出的病毒性糖蛋白亞單位疫苗(由糖蛋白-脂肪復合囊組成)比在此之前所提出的亞單位疫苗易制備。而原有的亞單位疫苗分離時所用的方法使其不含脂肪。例如，參見美國專利第4344935號和4356169號以及Moreinetal.，J.Gen.Virol.641557-1569(1983)。糖蛋白-脂肪復合物表現(xiàn)出這種產生免疫性的異常能力是令人驚奇的，因為一般均認為脂肪是非抗原性的，因而，當其存在于疫苗組合物中時，將被認為會減低免疫有效力。
我們的病毒性糖蛋白亞單位疫苗，其制備方法和應用方法是共懸未決的美國專利申請?zhí)枺?9年申請的。
在我們的亞單位疫苗的制備方法中，為獲得所需抗體反應的基本抗原性位點并不經化學修飾，其結果是抗原性不受損害。再者，我們的疫苗制劑不含任何病毒性基因組，因此，免去了感染的危險。由此，我們的亞單位疫苗具有獨特的超過化學滅活病毒疫苗和修飾的活病毒疫苗的優(yōu)點。然而，迄今為止，還沒有把鼻腔內施用病毒性外殼亞單位疫苗作為有效的抗侵染方法。因為亞單位疫苗不含病毒基因組，因而使用這種疫苗時不會產生臨床癥狀明顯的和臨床癥狀不明顯的感染。由此可知，前述鼻腔內施用修飾的活病毒疫苗并不意味著如同我們的由來自病毒的雙層脂膜和兩個外殼糖蛋白所組成的亞單位疫苗可以通過鼻腔內應用誘發(fā)免疫性。
本發(fā)明提供了鼻腔內施用病毒性糖蛋白亞單位疫苗的方法，其可以使疫苗的受者提高保護性免疫應答。在鼻腔內免疫后，對病毒性糖蛋白亞單位疫苗的全身性和局部性抗體反應均得到提高。這一結果與用同樣抗原劑量進行皮下免疫的結果正好相反，皮下免疫能引起全身性抗體反應的明顯升高，但只能引起支氣管道的中度的局部反應，因而，只產生有限的抗感染作用。
在本申請的附圖中

圖1表示用蜜二糖(0.1M)洗脫結合在固定化Jacalin柱上的倉鼠血清蛋白的洗脫情況。
圖2表示從分析兔抗倉鼠IgA抗血清所得到的免疫電泳圖譜。
圖3表示在不同試驗動物組中，35S-蛋氨酸標記的3型副流感病毒侵染的LLC-MK2細胞溶胞物與支氣管洗出物的免疫沉淀結果。
圖4以圖形給出在對照組中的試驗動物組中用3型副流感病毒攻擊后，IgA類特異性抗體對在支氣管洗出物中出現(xiàn)的病毒外殼蛋白的相對量。
任何具有抗原性糖蛋白組分的含脂類病毒均屬適用于本發(fā)明方法的材料。糖蛋白-脂類復合物的脂類組分是從產生病毒的宿主細胞中得到的。當在宿主細胞中組合外殼時，脂類就隨著病毒特異性蛋白結合到病毒外殼中。疫苗的制備方式造成糖蛋白和脂類形成松散的復合物或囊。並非如所預料到的那樣，即脂類會成為所獲糖蛋白亞單位疫苗所不需要的組分，而實際上，伴隨的蛋白作為佐劑使制劑的免疫性能得到提高。一般而言，形成抗原性脂類-糖蛋白囊的能力是糖蛋白和脂類的化學本性，因此，并不限于任何特殊類型的糖蛋白和脂類。
在較為熟悉的病毒性糖蛋白中，一般被認為是抗原的有2種，即受體-結合糖蛋白和融合糖蛋白。這是由其在宿主細胞的感染過程中的作用而定義的，而且在不同的病毒中會有不同的特定名稱。至少一種，且經常是兩種均存在于以下熟知的疾病誘發(fā)物中，有副粘液病毒、流感病毒、呼吸合胞體的病毒、狂犬病病毒、皰疹病毒以及人體免疫缺陷病毒，而后者則包括獲得性免疫綜合癥(AIDS)的病原。
特別熟知的是所有副粘液病毒組的成員均具有的受體-結合類型的和融合型的糖蛋白。該組包括副流感病毒，麻疹病毒，流行性腮腺炎病毒，呼吸合胞體病毒，新城病病毒以及仙臺病毒。在副流感病毒中，這些糖蛋白分別指HN(72000道爾頓)和Fo(54000道爾頓和20000道爾頓)，而且被認為是負責附著或血細胞凝集和神經氨酸苷酶活性(HN)以及病毒的侵染(F)過程。這兩種糖蛋白均已知是高度抗原性的，因此，特別適合用在本發(fā)明的免疫方法中。很明顯，由副粘液病毒組的某些成員，特別是副流感病毒、麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒所引起的疾病在人類中特別是兒童中傳播得很廣，因而也許會對患者造成不尋常的有害綜合癥和(或)副作用。
F糖蛋白至少在副流感病毒中的F糖蛋白是已知可以分出亞單位的。為了本說明的目的，F(xiàn)糖蛋白指其本身或者其亞單位，而這兩者均可以是清潔劑溶解的。
雖然在參照自PI3病毒的外殼來的亞單位疫苗描述和給出了本發(fā)明方法的例證，但該方法具有更為廣泛的用途。據信，按本發(fā)明的方法以鼻腔內的方式施用在此所述的病毒性糖蛋白亞單位疫苗，可以有效地抵抗包括副流感病毒、呼吸合胞體病毒、皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒和狂犬病毒在內的副粘液病毒組的侵染，但并不僅限于此。
在實踐本發(fā)明中所用的亞單位疫苗可以按照本專業(yè)領域的技術人員所熟知的技術很容易地制備出來。將所需的病毒通過適合的宿主細胞培養(yǎng)，經純化去除細胞破碎物，用可透析的清潔劑如膽酸鹽或辛基-D-糖苷處理以溶解所需的外殼糖蛋白。重要的是使用可容易透析的清潔劑，以保證在進一步加工成為疫苗時僅有清潔劑被去除。溶解之后，清潔劑溶解的病毒部分通過離心或其它適宜的方式與不溶性核蛋白殼分開。然后將上清液透析，產生由內源性脂肪和病毒性糖蛋白組成的復合物，該復合物組成所獲疫苗的致免疫劑。這種病毒性糖蛋白亞單位疫苗的制備方法詳見于Rayetal.，J.InfectDis.，152，PP1219-1930(1985)，該文的全部內容通過在此引述而合并于本專利申請的參考文獻中。病毒性糖蛋白還可以用遺傳工程(例如，使用重組DNA技術)或其它適于本發(fā)明目的之技術來生產。
用親和層析可以使糖蛋白進一步純化。制備抗人類3型副流感病毒的HN和F糖蛋白的單克隆抗體的過程和使用這些抗體分離和純化糖蛋白的方法參見Rayetal.，Virology，148，PP323-336(1986)和Rayetal.，J.GenVirol.，68，PP409-18(1987)。這兩篇文章所揭示的內容通過在此引述而合并于本申請。本發(fā)明專業(yè)領域的技術人員非常熟悉用永存細胞系與對免疫原制劑敏感的淋巴細胞相融合制備雜交瘤細胞系的技術。這樣的技術可參見如Douillard，J-Y，和Hoffman，J.，BasicFactsAbowtHybridomas，CompendiumofImmunology，Vol.Ⅱ，L.Schwartz(ed.)(1981);Kohler，G.andMilstein，C.，Nature256，495-497(1975);EuropeanJournalofImmunology，Vol.6PP511-519(1986);Koprowskietal.，U.S.Patent4172124，Koprowskietal.，U.S.Patent4196265，這些文獻均通過在此引述而合并于本申請。
就進行親和層析的獨特方法而言，其常用技術的總結可見于Goding，J.W.，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice，AcademicPress，(1982)。
按如上所述制備的純化HN和F糖蛋白，不論其單獨或合并使用，均是有用的疫苗。然而，優(yōu)選的是按所需比例將這兩種成分合并于適宜的賦形劑或載體中。以HN∶F為約4∶1-1∶1的比率可獲得有效的抗感染作用。
如上所述，與糖蛋白一起存在于疫苗中的脂類顯示出可對刺激受體的免疫應答提供意想不到的有益作用。盡管對這種免疫應答的機制還解釋不清，但也許是脂類作為輔劑的功能增強了糖蛋白的抗原效應。當用前述方法提取糖蛋白時一起提取出來的存在于病毒外殼中的內源性脂類足以引起適當保護水平的抗體產生。然而，如果用經純化和分離的糖蛋白制備疫苗，則以加上外源性脂肪為好，這樣才能獲得與包括天然脂類的未經純化制劑相同的效果。以這種方法制備亞單位疫苗，則原有的蛋白質-脂肪外殼有效地重建。還發(fā)現(xiàn)，加入脂類自動形成囊泡，其包括HN和F兩種外殼糖蛋白和脂類雙分子層，因此，模仿了通過溶解病毒外殼然后又透析所獲得的產品。這樣的方法簡便易行，即將脂類溶解在含糖蛋白的可透析的清潔劑溶液中，按前邊溶解程序中所述進行溶液透析。采用這樣的方式，不僅可能由純化的蛋白質與外源性脂類結合形成囊泡，而且還可能的是由于將脂類加入到經溶解的蛋白質-脂肪制劑中提高了天然脂類與蛋白質的比率，因而增大了內源性脂類的效應。從本質上講，任何脂類均可用于重建囊泡產物。在被認為是可用于本發(fā)明疫苗的脂類中，有磷脂類，其代表例有卵磷脂、腦磷脂和鞘磷脂。優(yōu)選的是卵磷脂，特別是蛋黃卵磷脂，其為一種磷脂化的膽堿。
上述亞單位疫苗可以與藥理上可接受的載體一起制成鼻腔內用劑，載體包括水、緩沖鹽水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液狀聚乙二醇等)，它們的適當混合物，或植物油。如果需要，可用各種抗菌劑和抗真菌劑來防止微生物的污染，這類藥劑有Parabens，氯丁醇、石炭酸、山梨酸、硫汞撒等。制劑中通常以含有等滲劑為好，如葡萄糖或氯化鈉。這種制劑可以作為氣霧劑或噴霧或以液滴的形式施用于鼻腔內。
本申請中所用“藥理上可接受的載體”包括適用于鼻腔內施用病毒性糖蛋白亞單位疫苗的任何和全部的溶劑。分散介質，抗菌劑和抗真菌劑等滲劑和延遲吸收劑等。用這些介質和物質去配合藥理活性物質是已知的。除了不能與活性組合共同使用的介質或制劑之外，其余的均可用在藥物組合物中。如果需要或期望時，輔助活性組分也可結合到組合物中。
為了便于使用和使用量均勻，將疫苗制成單位劑量的形式就更為有利。單位劑量形式指的是適宜被免疫對象物理性分散的疫苗單位。每劑量均應含有按產生所需藥效計算出的一定數量的活性物質以及所選擇的藥用載體。本專業(yè)領域的技術人員熟知如何確定對某類受者為適宜的疫苗劑量。一般而言，當使用含病毒的HN和F抗原的組合物時，則約10-200μg的劑量可以滿足產生所需免疫應答的要求。
含糖蛋白-脂類的病毒對在許多脊椎動物宿主中造成侵染負有責任，上述亞單位疫苗制劑適于給懷疑患有這些侵染的脊椎動物鼻腔內施用。然而，本發(fā)明優(yōu)選的要防止副流感病毒侵染的疫苗對于包括人類在內的哺乳動物宿主是非常有價值的。
以下的各實施例將進一步詳細描述本發(fā)明。但這些實施例者在說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實施例1-從3型(PI3)人類副流感病毒制備疫苗按Ray et al.，J.Infect.Dis，同上，PP1220-21所述的方法培養(yǎng)LLC-MK2細胞(獼猴腎)制備疫苗，并按其所述確定蛋白質量。在清潔劑溶解組分中有總病毒蛋白的約三分之一可以被回收。這一物質表現(xiàn)出顯著的HA效價(1∶320)。
實施例2-免疫受試動物A.劑量對免疫保護的影響三組受試動物(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組)用不同劑量的如實施例1制備的疫苗按每周一次連續(xù)四周鼻腔內免疫。將所需的100μg疫苗通過兩個鼻孔按等份緩慢滴入。施藥完成之前，將動物的舌頭約束住以使被吞咽的疫苗為最少。另一平行組(Ⅳ)包括未免疫的對照動物。最后一次免疫21天后用100μg含105P.f.u?；畈《驹诒乔粌葘游锕簟Ｇ秩?0小時后，處死被侵染的倉鼠，收集血液用于制備血清。
通過緩慢滴注和用18號針頭及注射器從氣管吸入1ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)收集，每只倉鼠的支氣管排出物。支氣管排出物經離心澄清后，按等份冷凍儲存。取出動物的氣管和肺，懸浮于含1%BSA血清白蛋白的2mlDulbecco氏培養(yǎng)基中，并冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 按Rayetal.，J.Infect.Dis.，同上，PP1220所述的方法對倉鼠肺勻漿物進行噬菌斑檢測。在經鼻腔免疫后又受侵染攻擊的肺中沒回收到病毒。
相反，未免疫的試驗但動物如前報道CId.1226-27頁(Ⅳ組)可從組織回收到104Pfu/gm的病毒，上面所述免疫試驗的結果見表1A。
B.給藥方式對免疫保護的影響為進一步用相對低的疫苗量測定預防性免疫應答和比較鼻內和皮下用藥，用另外四組倉鼠作試驗。用例1制備的疫苗分別皮下和鼻內用藥，每周一次，每次用量5μg，用藥四次使Ⅴ和Ⅵ組動物免疫。將Ⅶ組只鼻內用藥三次，每次用疫苗5μg使其免疫。Ⅷ組作為對照。結果皮下免疫注射的動物僅僅部分免遭感染。Ⅴ組動物肺中的病毒效價比未免疫的對照組低100倍。另一方面，用同樣量疫苗鼻內免疫的動物則完全免受感染。Ⅶ組受試動物也僅顯示部分保護。本試驗結果見表1B。
＊每組由四個倉鼠組成。
回收病毒用四個倉鼠幾何平均效價值表達。
例3測定局部免疫應答殺死感染的倉鼠后收集支氣管灌洗液，將其用于在Vero單層細胞上進行的PI3病毒噬菌斑中和試驗。該試驗是根據Ray等人在J.Infect.Dis.，Supra，1121-1122頁上敘述的步驟進行的。試驗結果是以抑制生成50%斑的血清最高稀釋度的倒數來表示，見表2。結果表明每次用5μg例1制備的疫苗鼻內免疫三次或，每次用5μg該疫苗皮下免疫注射10次的動物，其中和效價有兩倍變差，而且是部分免受感染。相反，用5μg，10μg或20μg鼻內免疫注射四次的動物，其支氣管灌洗液顯示大于20的互補中和效價，而且完抗感染。
根據Ray等人在J.Infect.Dis.，Supra.1221頁所述步驟，用HI試驗進行受試動物血清和支氣管灌洗液抗-HN抗體試驗。結果見表2。皮下免疫注射動物的血清，其互補效價為16，而支氣管灌洗液沒有HI活性。然而，用高量的糖蛋白鼻內免疫的動物(用10μg或20μg，四次)，其支氣管灌洗液和血清均測出HI活性。
用免疫沉淀分析支氣管灌洗液，測定局部抗體對病毒多肽的比活性。在該分析中，用PI3病毒感染LLC-MK2細胞，再用35S-蛋氨酸在感染后30小時標記感染細胞3小時。用溶菌緩沖液溶解細胞，在13，000g下離心5分鐘，將澄清溶菌液用作病毒多肽材料。將支氣管灌洗液(100μl)與溶菌液混合，加入預先涂蓋山羊抗倉鼠全血清的蛋白A-瓊脂糖CL-4B珠，得到免疫沉淀。廣泛地洗瓊脂糖珠，用SDS-PAGE分析，再用Ray等人在J.Infect.Dis，Supra，1222頁上所述的熒光法分析 。
對從每組倉鼠得到的典型樣品進行的免疫沉淀分析見圖3。PI3病毒35S-蛋氨酸標記多肽的圖象出現(xiàn)在1道，Ⅰ和Ⅵ組倉鼠支氣管灌洗液免疫沉淀的圖象分別在2到7道，這些圖象均在10%SDS PAGE上自顯影的。8道是皰疹性口炎病毒的多肽，是作為分子量標志。
用不同劑量的糖蛋白鼻內免疫倉鼠的支氣管灌洗液可有效地沉淀HN和F多肽(4、5、6和7道)，HN(68K)沉淀強度似乎比F1(54K)高。由此結果很難定量測出該抗體對這些糖蛋白的應答，因為不能鑒定出高分子量帶(＞68K)，所以只能代表未切的融和蛋白(FO)和HN及F的同質或異質的多聚體。也發(fā)現(xiàn)皮下免疫動物的支氣管灌洗液也能沉淀HN和F1，但與鼻內免疫動物相比，沉淀強度低得多。用高劑量糖蛋白鼻內免疫動物的支氣管灌洗液免疫沉淀中，發(fā)現(xiàn)核殼蛋白M多肽(5、6和7道)，估計是由于它們存在于用作疫苗免疫制劑中。
＊用8HAU病毒測定效價，以四個動物的平均值表達。例4比較局部與系統(tǒng)應答為進一步分析免疫應答，需要用酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)測定血清和支氣管灌洗液中HN和F的抗體。其試驗結果見表3。分別測定血清和支氣管灌洗液對HN和F的特異抗體應答。將親和層析純化的HN和F分別用于涂蓋ELISA盤。用含1%BSA的硼酸鹽-鹽水在加入被測樣品前固定抗原涂蓋的盤。用2倍稀釋的系列血清或支氣管灌洗液在抗原涂蓋的穴中溫育。將家兔抗倉鼠全血清用作測定總體Ig對病毒糖蛋白應答的第二抗體。用家兔抗血清測定IgA類特異抗體對倉鼠IgA的應答。
用Jacalin(Pierce化學公司，Rockford，IL)作試劑進行凝集素親合層析從混合血清中制備抗倉鼠IgA家兔抗血清所需的倉鼠IgA。Jaealin是一種α-D-半乳糖結合凝集素，它是從Jack(一種類似面包樹的樹)果中的種子萃取的，可與人IgA特異結合。固定在瓊脂糖珠上的Jacalin包裝在一個特制的小塑料柱中(Biorad實驗室，Richmond，CA)該柱體積為4ml。用柱體積5倍的pH7.4的PBS洗該柱。將混合的倉鼠血清(6ml)對PBS透析，再通過Jacalin柱緩慢地循環(huán)四次。用10倍體積的PBS洗柱，再用含0.1M蜜二糖(Sigma化學公司.，St.bouis，MO)，的PSB洗脫結合蛋白，監(jiān)測收集吸收率為280mm部分，在火棉膠袋中濃縮(Schleicher和Schuell產品，Keene，NH)。
用蜜二糖洗脫結合在Jacalin柱上的倉鼠血清蛋白，顯示一個狹峰(見圖1)。家兔抗血清隨蛋白純度而上升顯示在免疫擴散試驗中有一強的沉淀素帶。由于有從Jacalin柱洗脫的雜質血清蛋白存在，可觀察到一個附加弱沉淀素帶。用免疫電泳(IEP)進一步分析說明家兔抗血清與倉鼠IgG(H和L鏈特異的)交叉反應。通過瓊脂糖凝膠4B-倉鼠IgG柱反復吸附家兔抗血清，再用IEP監(jiān)測收集(見圖2)及抗純化倉鼠IgG的ELISA使該交叉反應性消除了。如圖2所示，抗純化IgA(1道)的家兔抗血清和吸附在倉鼠IgG(3道)的抗血清都分別與電泳后倉鼠IgG(a和c穴中)及倉鼠全血清(b穴)反應?？箓}鼠IgG的山羊抗血清用作對照(2道)。與倉鼠IgA和IgG出現(xiàn)沉淀弧的位置已用箭頭標出。與IgA出現(xiàn)的沉淀弧的殘余部分可能是由于在Jacalin柱上得到的IgA中存在倉鼠血清蛋白的雜質。
這樣得到的IgA用于誘導高免疫家兔抗血清。用純化IgA，每周一次、每次100μg皮內免疫家兔三次。頭一次免疫需用弗氏完全佐劑Difco實驗室，Detoit，MI)乳化蛋白。第二次免疫則用弗氏不完全佐劑，而第一次用無佐劑的純IgA，每次用同樣量蛋白，均皮下給藥。再將另一些家兔用100μg純IgA靜脈免疫注射，最后一次注射的第4天心臟穿刺殺死家兔，制備和貯存其血清。將血清過Sepharose-4B與倉鼠IgG(H&L鏈特異的)偶聯(lián)的親合層析柱(SouthernBiotechnologyAssociates，Birmingham，AL)循環(huán)四次，吸附出與倉鼠IgG交叉反應部分。用免疫擴散，免疫電泳和ELISA試驗分析抗血清，測定其對倉鼠IgA的比活性。
將其與第二抗體-與堿性磷酸鹽連接的山羊抗家兔Ig溫育后，加入到ELISA盤的穴內。最后，用對-硝基苯基磷酸鹽作底物，發(fā)生一成色反應，溫育后加等體積2N的NaOH中止反應。用分光光度計(TitertekMultiskanRMC，F(xiàn)lowLaboratories，MCLean，Va)在405納米處測量其顏色強度。用涂蓋Jacalin或山羊抗倉鼠血清(CappelPhiladelphia，PA)及家兔抗倉鼠IgA(作為第二抗體)的滴定盤測定支氣管灌洗液中總體IgA效價。所有ELISA試劑均要預先標定以確定所用合適的稀釋度。
根據表3所示ELISA試驗結果，用例1的疫苗皮下免疫的動物血清的抗體效價均提高，而在支氣管洗液中則為低水平。另一方面，鼻內免疫倉鼠的支氣管洗液中觀察到較高的抗體應答，其效價隨糖蛋白(C、D、E和F組)用量的增加而增加。鼻內免疫動物的血清和支氣管洗液中都觀察到有糖蛋白特異抗體出現(xiàn)和IgA類對HN和F的特異應答。有趣的是由于用20μg免疫4次的動物與皮下免疫動物血清抗體的Ig和IgA水平相似，所以用較高疫苗量鼻內免疫也產生系統(tǒng)抗體應答。支氣管洗液中抗體的ELISA效價比較低，這可能是由于其收集過程稀釋了支氣管液體。
進而支氣管洗液中抗原特異IgA和總體IgA比例。為測定總體IgA效價，需用兩種不同試劑-涂蓋在ELISA盤的Jacalin和山羊抗倉鼠全血清分別試驗支氣管洗液。用這兩種試驗得到相似的效價。分別測定支氣管洗液中糖蛋白特異IgA對親合純化HN和F的效價，結果見圖4。圖中光密度對每個不同支氣管洗液稀釋液作圖，得到光密度與不同濃度特異抗原及總體IgA效價成直線關系。特異抗原和總體IgA在同一濃度兩個重復下，其光密度乘10代表支氣管中特異抗原IgA的百分數。未免疫的(A組)，用5μg皮下免疫4次的(B組)，用5μg鼻內免疫3次的(C組)，用5μg鼻內免疫4次的(D組)，用10μg鼻內免疫4次的(E組)或用20μg鼻內免疫4次的動物，其抗HN和抗F抗體水平用圖線表示，上面的線代表每組間的變差。
從圖4可看出鼻內免疫的動物顯示出對HN(＞15%)和F(＞7%)有明顯高的局部IgA應答，而抗HNIgA應答大于抗-F。也用搗碎病毒涂蓋在ELISA盤來測試支氣管洗液，發(fā)現(xiàn)產生相似的IgA應答。從相似試驗中看出其它類抗原特異免疫珠蛋白以較低的效價出現(xiàn)。
上述例子的試驗結果表明前述糖蛋白亞單位疫苗鼻內給藥后在呼吸道中可有效地誘導保護免疫應答。這至少是由于誘導局部抗體產生，特別是IgA類抗體。上面資料進而說明為有效保護機體免受感染，鼻內免疫與皮下免疫相比需要低劑量病毒外殼糖蛋和脂類復合物。
上述本發(fā)明實施例不是為了限定實施本發(fā)明，不離開其范圍及構思的修飾是允許的
權利要求
1.抗病毒感染的免疫方法，包括鼻內施用免疫有效量病毒外殼亞單位疫苗，疫苗是由糖蛋白與脂類復合組成。
2.根據權利要求1所述方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的受體結合糖蛋白或融合糖蛋白或兩者結合。
3.根據權利要求1所述的方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的F糖蛋白和HN糖蛋白。
4.根據權利要求1所述方法，其中為有效免疫施用重建到脂類囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。
5.抗選自下組之一病毒感染的免疫方法，該組病毒包括付粘液病毒，流感病毒，呼吸合胞體病毒，狂犬病病毒，皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒，該方法包括鼻內施用免疫有效量的該病毒外殼亞單位疫苗，該疫苗是由糖蛋白與脂類復合組成的。
6.根據權利要求5所述方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的受體結合糖蛋白或融合糖蛋白或兩者結合。
7.根據權利要求5的方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的F糖蛋白和HN糖蛋白。
8.根據權利要求5的方法，其中為有效免疫施用重建到脂類囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。
9.抗付流感病毒感染的免疫方法，該方法包括鼻內施用免疫有效量的來自該病毒的病毒外殼亞單位疫苗，該疫苗包括與脂類復合的糖蛋
10.根據權利要求9所述方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的受體糖蛋白或融合蛋白或其兩者結合。
11.根據權利要求9所述方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的F糖蛋白和HN糖蛋白。
12.根據權利要求9所述方法，其中為有效免疫施用重建到脂類囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。
13.抗人付流感3型病毒的免疫方法，該方法包括鼻內施用免疫有效量的來自該病毒的病毒外殼亞單位疫苗，該疫苗包括與脂類復合的糖蛋白。
14.根據權利要求13所述方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的受體結合蛋白或融合蛋白或兩者的結合。
15.根據權利要求13所述方法，其中為有效免疫施用與脂類復合的F糖蛋白和HN糖蛋白。
16.根據權利要求13所述方法，其中為有效免疫施用重建到脂類囊中的F糖蛋白和HN糖蛋白。
17.根據權利要求1的方法，其中所述病毒外殼亞單位疫苗是用遺傳工程方法制造的。
18.應用由脂類與糖蛋白復合組成的病毒外殼亞單位疫苗，制造鼻內施用、抗病毒感染藥物的方法。
19.根據權利要求18的應用方法，其中用權利要求2到17中任一項所定義的疫苗。
20.在抗病毒感染免疫方法中適用于鼻內施用的組合物，包括由與脂類復合物的糖蛋白組成的有效免疫量的病毒外殼亞單位疫苗和適用鼻內用藥的藥物學可接受的載體。
21.權利要求20中所述組合物，其中用的疫苗如權利要求2到17中任一項所定義。
22.權利要求20所述組合物，以氣霧劑或噴霧劑或液滴形式。
23.權利要求20所述組合物，單位用藥量為該疫苗的10-20mg。
24.制備抗病毒感染免疫疫苗的方法，包括(1)將由與脂類復合糖蛋白組成的免疫有藥量的病毒外殼亞單位疫苗與(2)藥物學上可接受的適于鼻內給藥的載體結合。
25.根據權利要求24所述方法，其中制備權利要求2-17中任一項所定義的疫苗。
26.根據權利要求24所述方法，其中疫苗是用作為噴霧劑、氣霧劑或液滴配方。
27.根據權利要求24所述方法，其中的疫苗是用作10-200mg用藥量的配方。
全文摘要
抗病毒感染的免疫方法，該方法是鼻內施用免疫有效量病毒外殼亞單位疫苗，該疫苗是由糖蛋白與脂類復合組成的。
文檔編號A61K39/205GK1031328SQ8810267
公開日1989年3月1日 申請日期1988年5月5日 優(yōu)先權日1987年5月5日
發(fā)明者里查德·威·康普斯, 云濟特·雷 申請人:分子工程聯(lián)合公司