專利名稱:新型dna和多肽的制作方法
本發(fā)明涉及一種新的DNA和一種多肽。
人的乙型肝炎是由一種DNA病毒的乙型肝炎病毒(下稱HBV)感染而發(fā)生的。HBV稱為“載恩氏顆?！?。在這種病毒顆粒的表面存在有一種HBV表面抗原(下稱HBs Ag)。而在顆粒的里面，則有HBV核心抗原(下稱HBc Ag)和HBVe抗原(下稱HBeAg)，它們?yōu)榫哂胁糠謫喂傻沫h(huán)狀雙股DNA。同時，在顆粒上已測出一種用來對雙股DNA中的單股部分起修補作用的內(nèi)源DNA合成酶的活性。HBV DNA的分子量是2.1×106道爾頓。它是由大約3200堿基對組成的。已知HBs Ag有四種類型的抗原性，即以共同抗原“a”為其中心的adr，adw，ayr及ayw。
HBc Ag可用作早期診斷受HBV感染者的診斷劑。亦即在人受HBV感染時，HBs抗體出現(xiàn)之前在血液里就誘發(fā)出抗HBc抗體。因此，一個人是否受HBV感染，在感染的早期就能夠通過測定血清里的抗HBc抗體而確定。在預(yù)防HBV感染上，最近報導(dǎo)的HBc Ag是有效的。
含有HBe Ag的血液亦會有大量的戴恩氏顆粒，而且具有一種可引起HBV感染的危險。因此在治療HBV感染的病人時，在血液里檢查出HBe Ag的存在是重要的而且在HBV感染的診斷上是必不可少的。
為了獲得HBc Ag及HBeAg，就必須收集戴恩氏顆粒并從中分離出HBc Ag和HBeAg。由于在戴恩氏顆粒里所含的HBcAg及HBeAg的量極微，就要求一個能大量產(chǎn)生HBc Ag及HBe Ag且措施安全的方法。
根據(jù)本發(fā)明將會提供(1)一種由微生物產(chǎn)生的表現(xiàn)有乙型肝炎病毒e擴原性的多肽，和(2)一個重組體DNA，它包括有一個啟動子，一位于該啟動子下游的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，一為表現(xiàn)出有乙型肝炎病毒e抗原性的多肽而編碼的，位于轉(zhuǎn)譯起始密碼子下游的DNA片段，以及一緊接在該DNA片段后面的終止密碼子，(3)一個重組體DNA，它包括有一個啟動子，一個位于該啟動子下液的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，一為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒e抗原性的多肽而編碼的，并位于該啟動子下游的DNA片段，以及緊接在該DNA片段之后的一個終止密碼子，其中在啟動子的SD(Shine-Dalgarno)序列和轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的核苷酸順序是ATCGGGC，及(4)一種制備表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C抗原性多肽的方法，它包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體含有一個包括一啟動子，一位于該啟動子下游的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，一為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C抗原性的多肽而編碼的位于啟動子下游的DNA片段，以及一個緊接在該DNA片段之后的終止密碼子，其中啟動子SD順序與轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的核苷酸順序是ATCGGGC。
HBc和HBe抗原都只能從受HBV感染的人或黑猩猩里自然地獲得有限的量。處理這樣被感染的生物體有受HBV感染的危險。本發(fā)明已解決了這些問題，并能大量地生產(chǎn)出類似自然抗原的表現(xiàn)有HBc或HBe抗原性的多肽，而且生產(chǎn)安全和經(jīng)濟。
圖1表示adw-型HBV DNA的整個核苷酸順序;
圖2表示adw型HBc Ag的氨基酸順序;
圖3表示為adw型HBc Ag編碼的DNA的核苷酸順序;
圖4是構(gòu)建質(zhì)粒PTB368的圖解;
圖5是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒HBe Ag的圖解;
圖6表示大腸桿菌DH1/pTB368的產(chǎn)物的西部斑漬(Western blotting)(1和2道)的結(jié)果;
圖7表示用氯化銫平衡密度梯度離心大腸桿菌DH1/p TB368產(chǎn)物的分析結(jié)果;
圖8和圖9表示用蔗糖梯度離心大腸桿菌DH1/p TB368及DH1/p TB441的產(chǎn)物的分析結(jié)果;
圖10表示用HBe(HBc)放射免疫測定(RIA)檢查家兔抗HBc抗體中和作用的結(jié)果，圖11是構(gòu)建質(zhì)粒p TB(4)369-4的圖解，圖12是構(gòu)建質(zhì)粒p TB(4)369-32及pTB(4)369-41的圖解，圖13是構(gòu)建質(zhì)粒p TB(4)441-1的圖解。
圖14是構(gòu)建質(zhì)粒p TB(4)441-8的圖解。
圖15是構(gòu)建質(zhì)粒p TB(4)552-8的圖解。
圖16和17表示大腸桿菌DH1/pTB(4)441-1及大腸桿菌DH1/pTB(4)552-8產(chǎn)物的分子量分析結(jié)果。在圖16里，使用125I-抗HBe抗血清進(jìn)行的西部斑漬法，以及圖17里一種用人的抗HBe抗血清免疫沉淀法。
本發(fā)明的目的只要能產(chǎn)生出一種顯示出乙型肝炎病毒e抗原性多肽的任何微生物都可使用。適合的微生物包括大腸桿菌及含有一重組體DNA的酵母。這一重組體DNA帶有一啟動子，一位于啟動子下游的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，一為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒e抗原性的多肽而編碼的位于轉(zhuǎn)譯起始密碼子下游的DNA片段，以及緊接在該DNA片段后的一個終止密碼子。含有上述重組體DNA的大腸桿菌是特別好的。
對本發(fā)明的目的來說，含有RNA聚合酶可以接上去的區(qū)域或位點的用來啟動m RNA合成的任何啟動子都可以用。當(dāng)用大腸桿菌作宿主時，適于使用的啟動子的例證是trp啟動子，recA啟動子，lac啟動子，λPL啟動子及tuf B啟動子。在上述所有啟動子中，使用trp啟動子是特別好的。
在其SD順序與將在后面介紹的轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間提供ATCGGGC核苷酸順序的啟動子更可優(yōu)選使用。
用酵母作宿主時，只要能在宿主內(nèi)起作用的任何啟動子都可使用。
作為轉(zhuǎn)譯起始密碼子，ATG可優(yōu)先使用。
作為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C抗原性的多肽編碼的DNA，可用為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C任何亞型的抗原性的多肽編碼的DNA。然而，優(yōu)先使用為如圖2所示(adw型)的多肽編碼的DNA，如圖1所示(adw型)的介乎1901和2455之間的核苷酸順序的DNA更可優(yōu)先使用。
作為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒e抗原性的多肽編碼的DNA，可用為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒e抗原性任何亞型的多肽編碼的DNA。然而優(yōu)先使用如圖2所示在氨基酸順序1和95至184之間的多肽編碼的DNA。1901和2263至2356(adw型)之間的DNA更可優(yōu)先使用。(在2263位的堿基可能是C.)。
為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C和e抗原性的多肽編碼的DNA可以是一個為多肽編碼的DNA。后面這種多肽其氨基酸或肽的一部分已經(jīng)缺失或由其它的氨基酸或肽替代，或者在其上加入了一個氨基酸或肽，只要由這個DNA產(chǎn)生的多肽能表現(xiàn)出所期望的抗原性就成。
作為終止密碼子，可以是如上所述的TAA，TAG或TGA。
一個為顯示出adw型HBc抗原性的多肽編碼的DNA，可按下面方法制備。
在Nucleic Acids Res.11，1747(1983)所揭示的質(zhì)粒pBR322-EcoRI/HBV933(下稱pHBV933)可用限制性內(nèi)切酶Hh a Ⅰ(溶血嗜血菌Ⅰ)消化而得DNA片段。從這些DNA片段，分離出一個大約1仟堿基的含有為顯示出HBc抗原性的多肽編碼的區(qū)域的DNA，用Eco RⅠ連接物連接并插到含有啟動子的trp質(zhì)粒ptrp781的Eco RⅠ位點上而獲得質(zhì)粒p HE1〔質(zhì)粒ptrp781是用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ消化ptrp701(歐洲公開專利號0068719)，緊接著再用Cla Ⅰ部分消化，以DNA聚合酶Ⅰ大片段處理而修補粘合末端，并以T4 DNA連接酶環(huán)化而制得，靠近Eco RⅠ位點的Cla Ⅰ位點被破壞〕。這個質(zhì)粒pHEl先用Eco RⅠ而后又用核酸酶Ba l 31消化，用Ca l Ⅰ連接物連接并插到帶有trp啟動子的質(zhì)粒ptrp771的Cla Ⅰ位點上(歐洲公開專利號0068719)，借此而獲得含有為表現(xiàn)出HBc抗原性的多肽編碼的所期望DNA的質(zhì)粒p TB368(圖4)。用質(zhì)粒pTB368轉(zhuǎn)化大腸桿菌(像DHl Xl776或C600株)，從而獲得能產(chǎn)生顯示出HBc抗原性的多肽的一個大腸桿菌的轉(zhuǎn)化株。
例如，通過用如Av a Ⅰ或Av a Ⅱ適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，且隨后如有必要用核酸酶Ba l 31消化質(zhì)粒p TB368，用適當(dāng)?shù)暮幸唤K止密碼子的連接構(gòu)連接獲得的片段并把這一終產(chǎn)的DNA插到質(zhì)粒ptrp771里而制備得為顯示出adw型HBe抗原性的多肽編碼的DNA。用這樣獲得的質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化大腸桿菌(如DH1，X1776或C600的一個株)，獲得能產(chǎn)生顯示HBe抗原性多肽的大腸桿菌一個轉(zhuǎn)化株(圖5)。
為表現(xiàn)出HBc的或HBe的adw以外的抗原性亞型的多肽編碼的DNA可以用上述同樣的方法獲得。當(dāng)用大腸桿菌以外的其它微生物作宿主時，可以把上述的DNA插到帶有能在這個宿主里起作用的啟動子的質(zhì)粒里而獲得能夠產(chǎn)生這種所期望的多肽的轉(zhuǎn)化體。
一個具有介乎其啟動子的SD順序和轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的ATCGGGC的核苷酸順序的重組體DNA可以通過一系列處理，其中包括例如用像EcoRⅠ那樣的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理，用Sl核酸酶處理并連接而獲得。換句話說，這樣的一種重組體DNA可通過寡核苷酸致突變或其它適合的已知方法而制得。
例如，這樣獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化株可用任何熟知的像L液體培養(yǎng)基、Penassay液體培養(yǎng)基或含有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M-9培養(yǎng)基來培養(yǎng)。這些培養(yǎng)基可用適宜的添加劑補給，像3β-吲哚基丙烯酸用來提高啟動子的活性。培養(yǎng)是在15-43℃溫度條件下，最好在28-40℃下培養(yǎng)2-24小時，最好是3-8小時來完成。如有必要則進(jìn)行通氣和攪拌。
經(jīng)培養(yǎng)后，用任何已知的方法收集細(xì)胞并懸浮在緩沖液里以聲處理、溶菌酶和/或冰結(jié)溶化來破碎。把破碎后的混合液離心而得一種含有所期望的多肽的抽提液。從中用常規(guī)方法分離和純化這種多肽。
可以用上述同樣的方法處理大腸桿菌以外的微生物轉(zhuǎn)化體而發(fā)現(xiàn)這種所期望的多肽。
如此獲得的表現(xiàn)為HBc或HBe原性的多肽可以用作HBV感染的診斷劑和抗HBV感染的預(yù)防藥劑。
具有介乎其啟動子區(qū)域的SD順序及轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的ATCGGGC堿基順序的一個重組體DNA提供了一種有HBc或HBe抗原性又高產(chǎn)且便于用來生產(chǎn)HBc或HBe抗原的多肽。
現(xiàn)將以實例在后面詳細(xì)介紹本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這些實例并無限制本發(fā)明范圍之意。
實例1用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ和Hh a Ⅰ消化質(zhì)粒p HBV933，消化液在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離出帶有這種HBc抗原基因的DNA片段(1005堿基對)這個DNA片段在緩沖液(10毫摩爾醋酸鈉，150毫摩爾氯化鈉，0.05毫摩爾硫酸鋅，pH4.0)里用核酸酶Sl處理，并用Eco RⅠ連接軸d(GGAATTCC)連接再用Eco RⅠ處理。所得的DNA片段插到質(zhì)粒ptrp781的Eco RⅠ位點上且引進(jìn)大腸桿菌DH1里。帶有這種HBc Ag基因的質(zhì)粒p HBc HE1是從克隆里抽提出并用Eco RⅠ裂解的。在24℃下以2單位的Ba l 31在緩沖液(600毫摩爾氯化鈉，20毫摩爾三羥甲基氨基甲烷鹽酸，pH8.0，12毫摩爾氯化鈣，12毫摩爾氯化鎂，1.0毫摩爾乙二胺四乙酸處理Eco RⅠDNA片段1分鐘，用Cla Ⅰ連接物d(CATCGATG)接連并用Cla Ⅰ消化。這樣處理過的DNA片段隨后被引入到大腸桿菌DH1里連行轉(zhuǎn)化，借此以獲得抗四環(huán)素轉(zhuǎn)化體大腸桿菌DH1/p TB368。
實例2將實例1得到的轉(zhuǎn)化體在37℃下培養(yǎng)于含有8μg/ml四環(huán)素的M-9培養(yǎng)基(10ml)里。當(dāng)培養(yǎng)基的克萊特色度單位(Klettunit)(在580nm處的吸光率)達(dá)到180-200時，把3β-吲哚基丙烯酸加到當(dāng)中使?jié)舛瘸蔀?5μg/ml，并續(xù)繼培養(yǎng)2-3小時。
將培養(yǎng)物置5000rpm離心10分鐘以收取細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞懸浮在1ml緩沖液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸，pH7.6，20%蔗糖)，并向它加入溶菌酶(3mg/ml)乙二胺四乙酸(最終濃度為5mM)及PMSF(最終濃度為1mM)。這一混合液充分?jǐn)嚢璨⒆屗?℃下放置1小時。然后這混合液進(jìn)行聲處理以便進(jìn)一步破碎這些細(xì)胞，后以15000轉(zhuǎn)/分再離心兩次，每次20分鐘。以此而獲得的這種上清液(抽提液)都用HBe放射免疫測定法組(Abbott)檢查HBc抗原活性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)化體是一種HBc抗原的表達(dá)無性系。
從這種轉(zhuǎn)化體而得的細(xì)胞抽提物用等滲的氯化鈉溶液稀釋，測量HBc抗原的活性。結(jié)果，用生理食鹽水溶液稀釋2500倍的一個樣品，仍然檢出它的HBc抗原的活性。
實例3從上述轉(zhuǎn)化體DH1/p TB368分離而得的質(zhì)粒p TB368，隨后用限制性內(nèi)切酶Av a Ⅰ切割并用核酸酶Ba l 31處理30-90秒鐘，所得的片段用一種具有一終止密碼子的EcoRⅠ連接物連接并插入到ptrp771的ClaⅠ、EcoRⅠ位點上，將獲得的質(zhì)粒引至大腸桿菌DH1里進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化體在M-9培養(yǎng)基里培養(yǎng)，HBe抗原活性用實施例2所介紹的同樣的方法測定。已獲得能產(chǎn)生HBe抗原的大腸桿菌DH1/pTB449，大腸桿菌DH1/p TB441及大腸桿菌DH1/p TB552等轉(zhuǎn)化體。
實例4每個從上述轉(zhuǎn)化體得到的細(xì)胞抽提物用生理食鹽水稀釋5倍，再用HBe放射免疫測定法組(Abbott)的方法分析其抗原活性。結(jié)果如下每分鐘計數(shù) 陽性/陰性陽性對照 4942陰性對照 979大腸桿菌DH1/p TB368 49736 50.8大腸桿菌DH1/p TB441 19003 19.4大腸桿菌DH1/p TB449 11774 12.0大腸桿菌DH1/p TB552 7034 7.1P/N＝ (陽性每分鐘計數(shù))/(陰性對照每分鐘計數(shù))
實例5(ⅰ)從大腸桿菌DH1/p TB368而得的細(xì)胞抽提物在4℃下用貝克曼超速離心機(SW55轉(zhuǎn)子)40000rpm離心6小時，將沉淀物溶在緩沖液(20mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸，1mM乙二胺四乙酸，0.15MNa Cl，p H7.6)中。獲得的樣品(50μl)與50μl為十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺用的緩沖液(0.15MTris·HCl，p H6.8，4%SDS，20%甘油10%2-巰基乙醇，0.002%溴酚蘭)相混。混合液在100℃下加熱5-10分鐘并用聚丙烯酰胺凝膠電泳，由此分離的蛋白質(zhì)隨電流而轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾紙上并與125Ⅰ-抗-HBe抗血清相作用，接著洗脫并放射自顯影。結(jié)果，由轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可望具有分子量達(dá)21500-22000道爾頓(圖6)。
(ⅱ)在從大腸桿菌DH1/p TB368得到的細(xì)胞抽提物里加入固體氯化銫，因此獲得的混合物平均密度ρ為1.20，隨后，混合物在38000轉(zhuǎn)/分下離心72小時以分級分離。各級分后來都作了HBc抗原性分析。分級出的這種HBc抗原發(fā)現(xiàn)的密度峰值大約在ρ＝1.34。
從上述(ⅰ)和(ⅱ)所獲得的結(jié)果，由轉(zhuǎn)化體來的表達(dá)產(chǎn)物期望組成HBc Ag的顆粒。
(ⅲ)從大腸桿菌DH1/p TB368及DH1/pTB441而得的每種細(xì)胞抽提物超過35ml5-25%的蔗糖梯度溶液(20mMTris，pH7.6，0.15MNaCl，0.001M乙二胺四乙酸)并在4℃下用24000rpm離心4小時而分出30個級分。每個200μl的HBc Ag和HBe Ag級分使用商用的HBe Ag酶免疫測定法測定(Abbott)。從大腸桿菌DH1/p TB368而得的基因產(chǎn)物主要在9和10級分見到，而從大腸桿菌DH1/pTB441而得的則在20到23級分發(fā)現(xiàn)(圖8)。前面的產(chǎn)物希望是顆粒狀的多肽，而后面的則希望是不呈顆粒狀的多肽。
(ⅳ)從大腸桿菌DH1/pTB368而得的細(xì)胞抽提物與用HBV感染的里猩猩肝臟抽提的HBc Ag顆粒使之免疫而得的抗HBc抗血清混合，以便用商用抗HBc檢測儀器(Abbott)來測定抗體滴定度的下降。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這種抽提物與抗HBc抗體相作用和中和。相反地，人們發(fā)現(xiàn)從大腸菌桿DH1/pTB41，DH1/pTB449及DH1/pTB552而得的細(xì)胞抽提物是難和抗HBc抗體起反應(yīng)的。
從每個轉(zhuǎn)化體而得的抽提物與125Ⅰ-抗HBc抗體相作用。隨后用抗HBc抗體檢測儀器(Abb0tt)測定其殘留量而獲得下面所示的結(jié)果每分鐘計數(shù) 抑制%陽性對照 324 100陰性對照 12013 0大腸桿菌DH1/p TB368 3601 72大腸桿菌DH1/p TB441 12920 -8.3大腸桿菌DH1/p TB449 11905 0.9大腸桿菌DH1/p TB552 12832 -7.0實例7從大腸桿菌DH1/p TB368和DH1/p TB441而得的細(xì)胞抽提物，每種都分別用生理食鹽水稀釋64倍和4倍，以便每種稀釋樣品能表示每分鐘計數(shù)在大約20000的抗原的活性。這些稀釋的樣品與未稀釋的血清HBe Ag(每個100μl)各自在與家免抗HBc抗體(用等滲Na Cl溶液稀釋至100，500及1000倍)一起加入一種固態(tài)HBe(HBc)抗體，以等滲NaCl溶液代替抗HBc抗體溶液作為對照。每種混合物允許在室溫下相作用一整夜，以后測定凝固成固態(tài)的抗原。結(jié)果示于圖10，百分比是以相應(yīng)系統(tǒng)計數(shù)加上對照(生理食鹽水)為依據(jù)的。在對照系統(tǒng)里的計數(shù)分別是DH1/pTB368，DH1/p TB441及血清HBe Ag的每分鐘計數(shù)23340，23471及9491。
在HBe Ag血清方面，即使加入的抗原量只是加在稀釋抽提樣品量的一半左右，與對照組有關(guān)的計數(shù)的下降最高時也只是10%，這表示抗HBc抗體很少影響HBc Ag的檢測。
從大腸桿菌DH1/p TB368而得的抽提物的計數(shù)減少至抗HBc抗體增加時，表明這一表達(dá)產(chǎn)物具有HBc抗原性。在計數(shù)時，如在從大腸桿菌DH1/p TB368而得的抽提物所見那樣明顯的減少是不會發(fā)生在大腸桿菌DH1/p TB441抽提物的情況上的。這就表示，后者的基因產(chǎn)物具有HBe抗原性。
實例8為HBe Ag編碼的各DNA的3′-未端一邊的插在質(zhì)粒pTB441，p TB449及p TB552里的堿基順序如下(ⅰ)p TB441CCA.CCA.AAT.GCC.CCT.AGA.
脯 脯 天酰 丙 脯 精(134)ATT.CTT.GAA.GAC.GAA.AGG.
異亮 亮 谷 天 谷 精GCC.TCG.TGA丙 絲 -以質(zhì)粒p TB441產(chǎn)生的肽在HBc Ag C-末端部位缺少47個氨基酸(天然HBe Ag C-末端部位缺少7個氨基酸)因而有共它9個氨基酸代替。
(ⅱ)pTB449AGA.CGA.CGG.CTA.GAA.TTC.
(2348)TTG.AAG.ACG.AAA.GGG.CCT.
CGT.GAT.ACG.CCT.ATT.TTT.
ATA.GGT.TAA.
以質(zhì)粒pTB449產(chǎn)生的肽，在HBc Ag C-未端部位缺少33個氨基酸，因此有16個氨基酸代替。
(ⅲ)p TB552GTA.CTT.GAA.TAT.TTG.GTC.TCC.TAG(2243)以質(zhì)粒p TB552產(chǎn)生的肽，在HBc Ag C-未端部位缺少64個氨基酸。
實例9用Eco RⅠ消化和用核酸外切酶Ba 131處理質(zhì)粒p TB368，獲得的片段用Pst Ⅰ連接物d(GCTGCAGC)連接，然后再用Cla Ⅰ及Pst IDNA處理，獲得一個帶有HBc Ag基因的Cla Ⅰ Pst Ⅰ片段。將這個DNA片段插到p TRP771的Cla Ⅰ Pst Ⅰ部位，獲得的質(zhì)粒用Cla Ⅰ消化，用Eco RⅠ連接物d(GGAATTCC)連接。，用Eco RⅠ及Pst Ⅰ處理，然后插到ptrp781的Eco RⅠ部位上。獲得的質(zhì)粒引到大腸桿菌DH1進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因而獲得一轉(zhuǎn)化體大腸桿菌DH1/pTB(4)368-1。
在M-9培養(yǎng)基里培養(yǎng)這一轉(zhuǎn)化體，并從中抽提出細(xì)胞。檢測這些細(xì)胞抽提物的HBc Ag產(chǎn)量以證實這一轉(zhuǎn)化體比大腸桿菌(E.coli)DH1/p TB368多產(chǎn)大約10倍HBc Ag。
質(zhì)粒p TB(4)368-1的SD順序和其HBc Ag基因的轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間一個區(qū)域的堿基順序用常規(guī)方法測定。發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域是由下列14個堿基對組成5′AAAAGGGTATCGAAGGCCGGGCATGSD為了減少SD順序和ATG之間的核苷酸數(shù)目，就用Eco RⅠ切割質(zhì)粒p TB(4)368-1，用Sl核酸酶處理，然后再進(jìn)行連接反應(yīng)。大腸桿菌DH1用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化而獲得含有質(zhì)粒p TB(4)369的轉(zhuǎn)化體DH1/p TB369。人們發(fā)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)化體比大腸桿菌DH1/p TB368產(chǎn)生多大約105倍的HBc Ag。在質(zhì)粒p TB(4)369的SD順序和ATG之間的堿基順序包括下面7個堿基對5′AAAAGGGTATCGGGCATG實例10(ⅰ)將質(zhì)粒p TB(4)369用Av a Ⅰ消化和用Klehow片段修補而將單股部分變成為雙股，隨后又用Pst Ⅰ處理并分離出一大的片段。這個大的片段后來與一個具有可被Pst Ⅰ識別部位的Pst Ⅰ終止連接物連接;
5′ATAACTAACTAACTGCA3′3′TATTGATTGATTG5′后來用pst Ⅰ處理，分離大片段并連接獲得質(zhì)粒pTB(4)369-4(圖11)。
(ⅱ)將質(zhì)粒p TB(4)369用Sty Ⅰ消化。獲得的小片段用Av a Ⅱ處理并用Klenow片段修補。所得的雙股片段用上述的Pst Ⅰ終止連接物連接，接著用Hpa Ⅰ及pst Ⅰ處理并分離出502堿基對片段。這個片段在插到ptrp781的Hpa Ⅰ Pst Ⅰ部位時就得到質(zhì)粒p TB(4)369-32(圖12)。
(ⅲ)用Sty Ⅰ將質(zhì)粒p TB(4)369消化。由此而獲得的小片段用Hpa Ⅱ處理并用Klenow片段修補。所得的雙股片段用上述的pst Ⅰ終止連接物連接，其后再用Hpa Ⅰ及Pst Ⅰ處理并分離出472堿基對片段。將這個片段插到ptrp771的Hpa Ⅰ pst Ⅰ部位上得到質(zhì)粒p TB(4)369-41(圖12)。
(ⅳ)質(zhì)粒p TB441在HBe Ag基因兩個Bg l Ⅱ部位之一上(5′那邊的1個)及在載體區(qū)的pst Ⅰ部位上切開。所得的DNA片段插在p TB(4)369的Bg l Ⅱ(5′那邊的1個)Pst Ⅰ部位上而獲得質(zhì)粒p TB(4)441-1(圖13)。
(ⅴ)質(zhì)粒p TB(4)441在HBe Ag基因的兩個Bg l Ⅱ部位之一(3′那邊的1個)及在載體區(qū)的pst Ⅰ部位上切開。所得的DNA片段插在p TB(4)369的Bg l Ⅱ(5′那邊的1個)pst Ⅰ部位上而獲得質(zhì)粒p TB(4)441-8(圖14)。
(ⅵ)質(zhì)粒p TB552在HBe Ag基因的兩個Bg l Ⅱ部位之一(5′那邊的1個)及在載體區(qū)的pst Ⅰ部位上切開。所得的DNA片段插在p TB(4)369的Bg l Ⅱ(5′那邊的1個)p STⅠ部位上而獲得質(zhì)粒p TB(4)552-8。
實例11含有從實例9和10得到的質(zhì)粒的大腸桿菌DH1的各轉(zhuǎn)化體用實例2同樣的方法培養(yǎng)。收集并破碎細(xì)胞在加入乙二胺四乙酸及溶菌酶之后，用聲處理，獲得細(xì)胞抽提物。每種細(xì)胞抽提物都用HBe酶免疫測定法(EIA)(Abbott)及Corzyme來檢查HBc Ag HBe Ag。結(jié)果得到含有質(zhì)粒p TB(4)369，p TB(4)369-4，pTB(4)369-32或pTB(4)369-41的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體都產(chǎn)生HBc Ag及HBe Ag，而含有質(zhì)粒p TB(4)441-1或p TB552-8的轉(zhuǎn)化體卻見產(chǎn)生HBe Ag。
將從含有p TB(4)441-8的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體而得的抽提物稀釋和用商用HBe放射免疫測定儀器分析抗原活性而得的細(xì)果見后。
稀釋比(倍數(shù)) pTB(4)441-8125Ⅰ計數(shù)(每分鐘計數(shù))5 2491510 2584320 2707140 2978880 24811160 16001320 11395640 84501280 58662560 4057陰性對照 500(每分鐘計數(shù))實例12插到質(zhì)粒p TB(4)369-4，p TB(4)369-32及p TB(4)369-41里的為HBe Ag編碼的各DNA的3′-末端的核苷酸順序見于后ⅰ)p TB(4)369-4ATA·ACT·AAC·TAA異亮 蘇 天酰 -(182)ⅱ)p TB(4)369-32ATA·ACT·AAC·TAA異亮 蘇 天酰 -(154)
ⅲ)p TB(4)369-41ATA·ACT·AAC·TAA異亮 蘇 天酰 -(145)質(zhì)粒p TB(4)441-8缺乏為第29-82氨基酸的肽編碼的HBe Ag基因的以及為C-末端部位的47個氨基酸編碼的兩個區(qū)域，但具有一新的為9個氨基酸編碼的結(jié)合區(qū)域。
實例13含有質(zhì)粒p TB(4)441-1或p TB(4)552-8的大腸桿菌DH1的表現(xiàn)有HBe Ag抗原性的多肽產(chǎn)物的分子量，是由用125Ⅰ-抗HBe抗血清的“西部斑漬”法以及一種用人的抗HBe抗血清的免疫沉淀法而測出的。這種西部斑漬法分析〔Towbin，H.，Proc，Natl.Acad.Sci.，U.S.A.76，9，4350-4354(1979)〕證明了含有p TB(4)441-1的大腸桿菌產(chǎn)物的分子量是15000-15500道爾頓。免疫沉淀法，它是由先培養(yǎng)含有p TB(4)552-8的大腸桿菌DH-1在有14C氨基酸的M-9培養(yǎng)基里，將人抗HBe抗血清加到細(xì)胞抽提物中，讓所得混合物在37℃下相互作用，用加入蛋白質(zhì)A(10%溶液)回收免疫作用產(chǎn)物，在聚丙烯酰胺(17%)凝膠上電泳這個產(chǎn)物并用放射自顯影方法，證明這個基因產(chǎn)物具有13000-13500道爾頓的分子量(圖17)。
這些轉(zhuǎn)化體都已在保藏單位藏，其保藏注冊號如下
IFO FERM大腸桿菌DH1/p TB368 14467 BP-1147大腸桿菌DH1/p TB441 14468 BP-1148大腸桿菌DH1/p TB552 14469 BP-1149大腸桿菌C600 14410 BP-808大腸桿菌DH1/p TB(4)369 14533 BP-1153大腸桿菌DH1/p TB(4)441-1 14534 BP-1154大腸桿菌DH1/p TB(4)441-8 14535 BP-1155大腸桿菌DH1/p TB(4)552-8 14536 BP-1156列于“IFO”之下的編號代表在日本大阪發(fā)酵研究所的貯存注冊號，而列于“FERM”之下的那些編號則表示在日本通商產(chǎn)業(yè)省，工業(yè)科學(xué)技術(shù)廳的發(fā)酵研究院的貯存注冊號。
大腸桿菌DH1是一種熟知的微生物〔M.E.Selson et al，Nature 217，1110(1968)〕。
權(quán)利要求
1.一種表現(xiàn)乙型肝炎病毒e抗原性的并由微生物生產(chǎn)的多肽。
2.一種重組體DNA包括啟動子、位于該啟動子下游的轉(zhuǎn)譯起始密碼子，為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒e抗原性的多肽而編碼的位于轉(zhuǎn)譯起始密碼子下游的DNA片段，以及緊接在該DNA片段之后的終止密碼子。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的重組體DNA，它是下列各質(zhì)粒之一p TB441(FERM BP-1148)p TB449p TB552(FERM BP-1149)p TB(4)441-1(FERM BP-1154)p TB(4)441-8(FERM BP-1155)以及p TB(4)552-8(FERM BP-1156)
4.一種制備表現(xiàn)乙型肝炎病毒e抗原性多肽的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，它含有重組體DNA，包括有啟動子、位于該啟動子下游的轉(zhuǎn)譯起始密碼子、為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒e抗原性多肽編碼的并位于啟動子下游的DNA片段，以及緊接在這DNA片段之后的終止密碼子，其中介于啟動子SD順序與轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的核苷酸順序是ATCGGGC。
5.一種重組體DNA，包括啟動子、位于該啟動子下游的轉(zhuǎn)譯起始密碼子、為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C抗原性的多肽編碼的并位于啟動子下游的DNA片段，以及緊接在該DNA片段之后的終止密碼子，其中在啟動子SD順序及轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的核苷酸順序是ATCGGGC。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的一種重組體DNA，它是下列質(zhì)粒之一p TB(4)369(FERM BP-1153)p TB(4)369-4p TB(4)369-32以及p TB(4)369-41
7.一種制備表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C抗原性的多肽的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，它含有重組體DNA，包括有啟動子、位于該啟動子下游的轉(zhuǎn)譯起始密碼子、為表現(xiàn)出乙型肝炎病毒C抗原性的并位于啟動子下游的多肽編碼的DNA片段，以及緊接在這DNA片段之后的終止密碼子，其中介于啟動子SD順序及轉(zhuǎn)譯起始密碼子之間的核苷酸順序是ATCGGGC。
專利摘要
本發(fā)明涉及由微生物產(chǎn)生的表現(xiàn)有乙型肝炎病毒e抗原性多肽，以及分別表現(xiàn)有乙型肝炎病毒e和c抗原性多肽編碼的DNA片段的重組體DNA。本發(fā)明還涉及表現(xiàn)有乙型肝炎病毒e或c抗原性多肽的生產(chǎn)，其方法包括培養(yǎng)含重組體DNA的轉(zhuǎn)化體。由此獲得的表現(xiàn)每種抗原性的多肽可用作乙型肝炎病毒感染的診斷試劑和預(yù)防劑。
文檔編號C12P21/02GK86106762SQ86106762
公開日1987年6月10日 申請日期1986年10月3日
發(fā)明者音田治夫, 稻田俊, 五十嵐貢一 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan