專利名稱：甲型肝炎減毒活疫苗毒種(h的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是一種含有病毒性抗原的醫(yī)用生物制品，特別是用于預防人類甲型肝炎減毒活疫苗毒種(H2減毒株)及其制造方法。
甲型肝炎是世界性的傳染病，它是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的，全世界約40億人受其威脅。在中國，35歲以上成年人中，甲肝受染率達90%以上，常引起季節(jié)性的流行。1988年春季的上海甲肝特大流行，患病數(shù)達約30萬人以上，我國每年甲肝患病數(shù)在百萬人以上，由于該病的高發(fā)病率及較長的病程，給人民健康及經濟發(fā)展都有嚴重影響。根據(jù)我國現(xiàn)實情況，控制甲肝流行的有效和根本的措施在于發(fā)展疫苗。而疫苗的關鍵是其毒種。
美國MERCK公司Provost等人于1986年曾報告獲得甲肝病毒F′減毒株，但人試結果證明，該毒株的免疫效果很差，無實用價值。故至今未有進一步擴大人試的工作，亦未能投入中量試制。
本發(fā)明的目的是研制出一種安全，有效的甲型肝炎減毒活疫苗毒種，確可用于預防該病的傳染，為控制該病流行提供最有效的措施。
本發(fā)明的甲型肝炎減毒活疫苗毒種(H2減毒株)是從細胞分離病毒，建立對HAV易感的猴科動物模型進行試驗，用組織培養(yǎng)傳代，低溫減毒方法選育而獲得甲型肝炎H2減毒株。經猴體試驗及人體接種觀察證明有良好的安全性和免疫性，是目前國際上有人體接種觀察結果的最佳的甲肝減毒活疫苗毒種。
采糞便用PBS制成20%懸液，以F113～PEG沉淀及差速離心進行抽提，抽提物經超速離心沉淀，經免疫電鏡檢測觀察到含27nm大小的甲肝病毒顆粒。分離用的細胞為新生猴腎單層細胞。以上述初步純化的糞便提取物接種原代猴腎單層細胞4瓶，35℃～36℃吸附2小時，用新生牛血清的Eaglos及乳蛋白維持液，置35℃～36℃培養(yǎng)，每周換維持液一次，至第6周，去原維持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集細胞，用凍融，超聲波處理抽提HAV。以上述方法在該新生猴腎細胞中連續(xù)傳15代，每代用直接免疫熒光監(jiān)視病毒的增殖，以后以32℃～34℃培養(yǎng)，繼續(xù)連續(xù)傳5代，得HAVH2M20減毒株。
毒種適應KMB17細胞及繼續(xù)減毒傳代，KMB17細胞系人胚肺二倍體細胞，將上述H2M20病毒接種于KMB17(28代)，置32℃～34℃培養(yǎng)，每28天傳一代，連續(xù)傳5代，得H2M20K，毒種。
H2減毒株是通過人胚肺二倍體細胞32℃左右傳代和一系列猴科動物試驗而獲得的。與原來的強毒株相比，H2減毒株接種猴科動物后，未發(fā)現(xiàn)血清酶升高和肝細胞病變，糞便中不能直接查到甲肝抗原，但仍能誘導抗體產生。不同接種途徑試驗結果表明該株已失去了口服感染獼猴的能力，以上試驗結果表明該株病毒對猴科動物的毒力已經顯著減弱。H2減毒株殘余毒力較為穩(wěn)定，回到36℃?zhèn)?代未發(fā)現(xiàn)返祖現(xiàn)象。
以H2M20K5為毒種在KMB17細胞上連續(xù)傳2代，制得甲肝減毒活活疫苗，經人體接種觀察，139名抗體陰性的人接種疫苗后連續(xù)觀察6周，未發(fā)現(xiàn)任何與肝炎有關的癥狀或體征。接種后8周內血清谷丙轉氨酶及乳酸脫氫酶第5帶活性均在正常范圍之內，無一例異常升高，表明該疫苗是安全的。首批接種者中4名于接種后8～30天多次收集糞便濃縮后直接檢測甲肝抗原均為陰性，但從其中3名用細胞培養(yǎng)法分離到甲肝病毒，接種者原在單位在12周內未發(fā)現(xiàn)有急性肝炎病例。以上情況表明接種疫苗后排病毒量很少，并未發(fā)現(xiàn)通過人間密切接觸引起發(fā)病。
原來抗體陰性的人一次接種后用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，一般于3周左右抗體陽轉，陽轉率達95%?？贵w滴度在1∶1～1∶64之間。首批10名接種者于二年后復查抗體仍為陽性。對4人進行了代表保護力的中和抗體測定，證明為中和抗體。流行病學調查結果證明疫苗接種后有100%保護作用。以上結果表明疫苗株有良好的免疫原性。
用上述H2M20K5減毒株制成的甲型肝炎試驗性減毒活疫苗，至今已完成了三批共207名健康人的接種觀察，得到滿意的效果。
迄今為止，國內外僅有美國MERCK公司的Prouost博士等于1986年發(fā)表了他們選育出的甲肝CR326-F′減毒株人體接種的結果，共接種11人，結果僅6人有抗體陽轉反應，而且開始陽轉時間長達接種后7.5周。由于該減毒株的免疫效果不佳，迄今未有進一步的報告。本發(fā)明的H2減毒株制造的疫苗，通過迄今有最多接種人數(shù)的觀察結果顯示，它在安全性方面進行了最詳細的觀察並取得最滿意的結果，證明了它是迄今最安全的活疫苗毒種，另外在免疫反應方面，抗體陽轉率達95%以上，遠遠高于F′減毒株，特別是它首先證明本疫苗有流行病學保護效果，這些都證明，本疫苗是目前國際上有人體接種觀察結果的最佳的甲肝疫苗毒種。
實施例采甲肝暴發(fā)點患病者糞便，系于黃疸出現(xiàn)前一周，該患者甲肝IgM試劑檢測陽性，以往身體健康，無慢性及其它傳染病，甲肝患后康復良好。糞便用PBS制成20%懸液，以F113～PEG沉淀及差速離心進行抽提，抽提物經超速離心沉淀，以50倍濃縮于PBS中，經免疫電鏡檢測觀察到含27nm大小的，只能與甲肝恢復期血清凝集的球形病毒顆粒。分離用的細胞為新生猴腎單層細胞，該新生猴乃捕自武夷山的懷孕恒河猴，產子于籠內，產后立即以新生猴腎用胰蛋白酶制成單層細胞，并再消化凍存于液氮中備用。以上述初步純化的糞便提取物接種原代猴腎單層細胞4瓶(35cm2/瓶)，36℃吸附2小時，用含2%新生牛血清的Eagles及0.5%乳蛋白維持液，置35℃培養(yǎng)，每周換維持液一次，至第6周，去原維持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集細胞，用凍融、超聲波處理抽提HAV。以上述方法在該新生猴腎細胞中連續(xù)傳15代，每代用直接免疫熒光監(jiān)視病毒的增殖，以后以32℃培養(yǎng)，繼續(xù)連續(xù)傳5代，得HAV H2M20(32℃)減毒株。
毒種適應KMB17細胞及繼續(xù)減毒傳代，KMB17細胞系人胚肺二倍體細胞，將上述H2M20(32℃)病毒接種于KMB17(28代)，置32℃培養(yǎng)，每28天傳一代，連續(xù)傳5代，得H2M20K5毒種。
權利要求
1.一種利用組織培養(yǎng)細胞分離，傳代獲得甲型肝炎減毒活疫苗毒種(H2減毒株)及其制造方法，其特征是利用低溫在組織培養(yǎng)細胞中連續(xù)傳代，並適應于人胚肺二倍體細胞以獲得甲型肝炎病毒減毒株，培育出可預防人類甲型肝炎減毒活疫苗毒種(H2減毒株)，并建立猴科動物模型做試驗。
2.根據(jù)權利要求1所述的甲型肝炎減毒活疫苗毒種及其制造方法，其特征在于制造該活疫苗的毒種是在低溫32℃～34℃減毒和適應于人胚肺二倍體細胞而獲得的。
全文摘要
本發(fā)明是一種含有病毒性抗原的醫(yī)用生物制品，特別是用于預防人類甲型肝炎的減毒活疫苗毒種(H
文檔編號A61K39/29GK1047884SQ89106580
公開日1990年12月19日 申請日期1989年8月17日 優(yōu)先權日1989年8月17日
發(fā)明者毛江森, 董德祥, 陳念良, 張華遠, 黃海鷹, 張淑雅, 曹逸云, 柴少愛, 謝汝英, 傅幼輝, 陳統(tǒng)球, 張杭春, 李漢民, 朱既明 申請人:浙江省醫(yī)學科學院