專利名稱：生物活性多肽的延遲釋放的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于能在動物體施行腸胃外用藥以延遲釋放的生物活性多肽配方，使用所說的配方的方法，在某些所說的配方中使用的與金屬結(jié)合的生長激素，以及制備與金屬結(jié)合的生長激素的方法。
盡管一些生物性活多肽的延遲活性只需要很小劑量的腸胃外用藥就能實現(xiàn)。然而還需要有足夠的血清濃度和1或在血清中半衰期如此短以致于必須用相當(dāng)大的劑量(如至少100毫克左右)才能在整個延長時期內(nèi)如一周或更長時間提供予期的生物效應(yīng)。生長激素(somatotropins或growthhormones)便是這種多肽的一個例子。
為防止不希望有的、快速地釋放到動物的血流星，一些多肽借助于液體載體進(jìn)行腸胃外用藥，在該載體中可加或不加水合抑制劑(抗水合劑)或為進(jìn)一步降低在人體液中的溶解度而采用與金屬或金屬化合物締合的形式。為避免使用難以接受的大量載體，使載體結(jié)合高濃度的多肽應(yīng)當(dāng)是有助于解決問題的。然而大多數(shù)以高濃度存在的生物活性多肽都很粘，因而這種濃度注射或以別的方式用藥相當(dāng)困難的。除此之外，許多普通使用的抗水合劑能增加粘度并且能限制這種濃度的常規(guī)注射能力?；诜N種原因，正確結(jié)合(1)快速釋放足以在動物體內(nèi)產(chǎn)生所要求的生物效應(yīng)，(2)慢速釋放足夠產(chǎn)生延遲效應(yīng)，(3)提供足夠劑量以按要求的速度釋放，達(dá)到延長時間以及(4)體積足夠小而粘度足夠低到能常規(guī)方式用藥，對此，一般是很難于達(dá)到的。
由于各種多肽都是不同的，例如在三維空間結(jié)構(gòu)和與其它物質(zhì)的相互作用方面，多肽在適當(dāng)?shù)妮d體中處于高負(fù)載下達(dá)到有效的延遲釋放的可行性，從理論上推測和證明卻是不可能的。而在許多情況下，假若能以有用的、經(jīng)濟(jì)的方法提供多肽的生物活性，那么就必須研制這種延遲釋放的配方。
在減少治療次數(shù)和/或減少對被治療動物的損傷方面，人們已就延遲生物活性物質(zhì)的釋放進(jìn)行了長時間的研究。通過各種方法已實現(xiàn)了許多這類物質(zhì)的延遲釋放。一個體系是使用能作肌肉注射、皮下注射或以其它方式用藥的含油溶在一些情況下，低油溶性的物質(zhì)則能以油懸浮液的形式用藥。
例如，Weloh在美國2，491，537號專利中公開了將盤尼西林懸浮于果膠、纖維素化合物、或蛋白質(zhì)如明膠凝膠化的油(例如植物油)中，釋放時間長達(dá)24小時。他還提出了以此方法延長胰島素和留族化合物激素釋放。Buckwalter在美國專利2，507，193號中公開了將300，000單位/毫升的普魯卡因G盤尼西林懸浮于用5%單硬酯酸鋁(AIMS)凝膠化的花生油中，在兔體內(nèi)釋放長達(dá)11天。
Jacobson在美國專利3，016，330號中介紹了懸浮于芝麻中的AlMS色被的盤尼西林。Chien(JournalofparenteralScienceandTechnology35(3)，109(1981)〕則討論了懸浮于2%AlMS凝膠化的植物油中的盤尼西林G普魯卡因生物有效性，他認(rèn)為AIMS大于2%時對有效延長盤尼西林濃度水平僅顯示出有限的效果，而且AIMS大于2%的懸浮液對實際應(yīng)用來說也太粘。
油懸浮液僅用于某些低分子量(MW)除盤尼西林外的治療物質(zhì)。例如，Lachman等人在美國專利3，676，557號中公開了AIMS凝膠化的油懸浮液中的濃度50%的去甲嗎啡同(normorPhinone)的雙羥萘酸鹽的延遲釋放配方。
已公開了一些生物活性多肽的延遲釋放體系。例如，Anschel在美國專利2，964，448號中介紹了在用AIMS凝膠化的植物油中的骨松弛激素(約2%)的懸浮液。Anschel指出所說的懸浮液產(chǎn)生的松弛作用可與未加凝膠劑(例如5-7天)油相比，并且還介紹了加熱處理含AIMS懸液而產(chǎn)生的延長效應(yīng)(達(dá)23天)。
Geller在美國專利3，869，549號中介紹了含“極小劑量”例如“零點幾毫克”的肽注射的延遲釋放配方。提到了生長激素，但是特殊例子是水溶性促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)制劑活性長達(dá)7-8天。特別是，Geller公開的配方含有ACTH類似物的酸性加成鹽懸浮于二硬酯酸鋁(AlDS)凝膠化的花生油中或吸附于AIDS后再分散于花生油中。不管在哪種情況下，類似物都僅以0.03-0.1%的濃度和肽對鋁鹽的比值不大于0.5的Geller注射劑型存在。
已由Nestor等人在美國專利4，256，737號中則公開了LH-RH激素類似物的延長釋放配方。這些配方中含有激素鹽，包括多份金屬(例如鋅)鹽存在于酯肪酸鹽的凝膠化的植物油中。注射組分LH-RH類似物用藥濃度為0.01-1%。
另一些人則公開了延遲腸胃外釋放的金屬鹽或多肽復(fù)合物的含水懸浮液。例如，Donini在美國專利3，852，422中介紹了水溶性促性腺激素與鋁或鋅的氫氧化物的沉淀產(chǎn)物的長效含水懸浮液。因為鋅天然地存在于胰臟的胰島素中，所以進(jìn)行了由胰島素和各種金屬(例如鋅、鎳、鋁和鎘)間相互作用而產(chǎn)生的胰島素自含水懸浮液中延遲釋放的研究。參看美國專利2，143，590號;2，174862號;2，882，203號;2，920，014號和3，102，077號。
本發(fā)明的一個目的是提供一種配方，該配方可用于生物活性多肽在動物體內(nèi)的延遲釋放，并且是由與該動物生物相容的組分構(gòu)成的。
另一目的是提供能在動物體內(nèi)足夠快地釋放以產(chǎn)生所要求的生物效應(yīng)的這種配方。
另一目的是提供所說的配方，其能足夠慢地釋放以保持有助于在延遲期間內(nèi)保持所要求的生物效應(yīng)。
另一目的是提供所說的配方含有足夠高的多肽負(fù)載(足夠的劑量)，保持在所說的整個延遲期間達(dá)到所要求的釋放速度。
另一目的是提供所說的配方具有足夠低的常規(guī)腸胃外用藥的體積。這一點在多肽的用藥劑量必須很大時尤為重要。
另一目的是提供所說的配方要選擇這樣的組分及其比例，即能使配方具有足夠低的粘度，以便能用于常規(guī)注射或以別的方式給藥。當(dāng)需要注射較大劑量的多肽時，這一點也是很重要的。
在一些實施例中，目的是使所說的組分及其比例能提供足夠高的粘度，以有助于在動物體內(nèi)造成長期釋放的儲庫。
在很多情況下，這一目的很難與上述粘度目的一同實現(xiàn)。
本發(fā)明的另外一個目的包括提供使用所說的配方方法。以非常有利的形式含在所說的配方中的生長激素同時提供制備這種形式生長激素的方法。根據(jù)下列詳細(xì)的敘述將更易于了解本發(fā)明的種種目的。
我已發(fā)現(xiàn)上述目的可用基本上不含水的配方來實現(xiàn)，該配方含相對高比例的生物活性多肽以足夠量懸浮于生物相容性油中，以形成配方的連續(xù)相。在很多實施例中，所說的目的可以通過使用與無毒金屬締合的多肽而更易于意識到。所說的配方可以包括一種抗水合劑以進(jìn)一步延遲多肽的釋放。特別是對于必須大劑量用藥和/或大大提高配方粘度的多肽，我發(fā)現(xiàn)多肽與抗水合劑的比例較高時一般是有利的。我還發(fā)現(xiàn)能提供的高多肽負(fù)載(可選用一種抗水合劑)和足夠粘度的配方，在注射以后，趨向于形成長久儲藏的形式，而這種形式能使多肽以有效的速度按延遲方式釋放。
說明書全文，除特別指出者外，配方的百分比均以重量計，溫度均以攝氏溫度表示。
術(shù)語“基本不含水的”用于本說明書和從屬權(quán)利要求時，其意義是基本無水或含水很少以致使多肽在動物體內(nèi)不可能過份地加速釋放。雖然水的比例隨本發(fā)明的每一配方有所不同，處于影響多肽釋放形式的水最普通的含量應(yīng)小于2%左右(甚至少于1%左右)。
術(shù)語“無毒”在本文中是指本發(fā)明配方成分，在采用適當(dāng)用量并在適當(dāng)條件下，所說的配方以腸胃方式給藥時是相當(dāng)安全和/或無害的。
術(shù)語“生物活性的”(biologicallyactive或bioactive)多肽在本文中是指多肽，在對動物進(jìn)行適當(dāng)?shù)哪c胃外給藥后，對該動物的生物過程具有可檢測到的效應(yīng)。該效應(yīng)可能是激素的、營養(yǎng)的、治療的、予防的或其它方面，也可能是模仿的、補(bǔ)充或抑制自然發(fā)生的生物學(xué)過程。號有大量而彼此各異的所說的效應(yīng)和過程，但是作為例子可以提出的還有生長的刺激、哺乳、產(chǎn)卵或繁殖后代和/或食用性動物的飼養(yǎng)功效等。其它例子還包括羊毛、毛皮或其它非食用性動物制品的生產(chǎn)。雖然能夠使用低·MW的多肽(如至少約300)，但是這些多肽一般是大分子量的，例如至少約1000，一般至少約4000，在最佳實施例中至少為大約9000，而在許多甚至更好的實施例中則至少約為18000至大約30，000或更高些。雖然本發(fā)明配方中的多肽在對動物用藥可能處于活性狀態(tài)，但該術(shù)語(在本文中)還包括在用藥后發(fā)揮生物活性的這類多肽。
在本發(fā)明的許多實施例中，多肽是以化學(xué)上未結(jié)合的形式給藥的。另外有許多實施例是因為采用的是在含水(例如動物體)體液中溶度低的多肽，(例如與其它物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)結(jié)合)而不是呈未結(jié)合形式的多肽完成的。例如，以絕大部分(或全部)與無毒金屬化學(xué)締合的多肽或以酯、胺或其它能提供所要求的生物活性的形式的多肽，而不出現(xiàn)不可耐受的付作用。當(dāng)與所說的金屬進(jìn)行化學(xué)締合時，作為金屬本身(例如以金屬鹽或與多肽的結(jié)合物)或以鹽的形式與一種或多種其它陰離子所成的金屬鉻合物的形式存在。
雖然一價金屬(如鈉或鉀)用于本發(fā)明的一些配方中是比較有利的，但其它例子中也優(yōu)選使用了多價金屬。所說的多價金屬的例子包括鋅、鐵、鈣、鋇、鉍、鎂、錳、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等。在某些非常好的實施例中，所說的與金屬締合的多肽是所說金屬(例如以離子型的)與溶解的多肽的反應(yīng)產(chǎn)物。金屬與多肽的比例可隨形成過程中與金屬締合的多肽活性點數(shù)日而變化。例如，金屬可以和多肽中部分或所有的帶負(fù)電荷氨基酸(例如天冬氨基酸或谷氨酸)殘基締合，或與其羥基締合。一些或所有的金屬都可能以多肽鹽的形式被締合，包藏在多肽的折疊、結(jié)晶或無定形的部分里，或者作為至少兩個多肽分子間的陽離子橋而被締合。
如金屬是多價的某情況下，例如因為空間住阻效應(yīng)則可只有部分化合價與多肽產(chǎn)生化學(xué)締合。在這種情況下，金屬的其余化合價就可能與別的陰離子產(chǎn)生化學(xué)締合。在許多可望達(dá)到本方法之日的實施例中，金屬并不是以很大的比例與其它能和所說的金屬形成低溶解度鹽的陰離子化學(xué)締合的，當(dāng)該金屬與別的陰離子產(chǎn)生部分化學(xué)締合時，所說的其它陰離子(有機(jī)或無機(jī)的)經(jīng)常希望選自能與該金屬形成水溶性鹽的陰離子，例如當(dāng)金屬是鋅時，其可為Br、Cl、I、SO4或CH3COO，一般來說較好的是一價陰離子，例如Cl。
本發(fā)明新而最佳的締合金屬的多肽包括與鋅締合的生長激素。在一些例子中，(以生長激素的重量計)含鋅量可達(dá)5%或5%以上。為了減少動物體內(nèi)不希望有的注射部位反應(yīng)，可望使鋅含量不大于2%左右。甚至可小于1%左右(相同計算標(biāo)準(zhǔn))。在許多最佳實施例中這些多肽至少含0.3%(一般至少約0.5%)的鋅(相同計算標(biāo)準(zhǔn))，在有些情況下，雖然鋅的百分比更低些也是適宜的。
為適應(yīng)本發(fā)明的其它多肽鹽的例子包括(a)與無機(jī)酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或硝酸;或有機(jī)酸，如臘酸、草酸、酒石酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、苯甲酸、抗壞血酸、苯甲酸、丹寧酸、雙羥萘酸、藻酸、萘磺酸、萘二磺酸或聚半乳糖酸形成的酸加成鹽;(b)與多價有機(jī)陽離子例如N-二苯基乙基二胺或乙基二胺形成的鹽;(c)兩種或多種上述類型鹽的復(fù)合物，如丹寧酸鋅。
較好的是鋅鹽、鐵鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鈉鹽、鉀鹽、及其混合物，最好的鹽尤其是當(dāng)多肽是一種生長激素時，則是鋅、鈉或鉀鹽。令人滿意的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明之配方中摻入某一比例的生物相容性給藥時，即可與這種油相互作用而形成一種基質(zhì)或其它結(jié)構(gòu)，從而有效地增加多肽釋放延遲作用。這個意外的發(fā)現(xiàn)已在皮下和肌肉注射用藥方面引起注意，而且還顯示出對本發(fā)明的很多配方效能有重要的影響。
本發(fā)明的配方也適用于結(jié)合或非結(jié)合多肽的延遲釋放。所說的結(jié)合多肽包括酯蛋白，例如β酯蛋白;糖蛋白，例如α球蛋白;磷蛋白;例如酪蛋白;血紅素蛋白，例如紅蛋白;黃素蛋白，例如琥珀酸鹽脫氯酶;以及金屬蛋白，例如鐵蛋白和醇脫氫酶。這些化合物或上面指指出的任何形式的多肽的混合物，按其說明和所提出的權(quán)利要求應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
在許多引人注意的實施例中，按本發(fā)明配方用藥的多肽溶性很小(即室溫下溶解一份多肽至少需要100份的水)。在許多可望實施的實施例中，多肽在所采用的生物相容油中不是很易溶于所用之生物相容性油的，即室溫下不溶解于濃度約大于2%的油，而最適合的濃度是不大于1%左右。在一些例子中，例如含有各種生長激素的配方中，多肽即微溶水又基本上不溶于油。
如上所述，本發(fā)明的每一種配方，作為它的連續(xù)相，都含有生物相容性油，即某種油對多肽對動物，或，當(dāng)其產(chǎn)物進(jìn)入動物體即所說的產(chǎn)品消費者的食物鏈的情況下，不會產(chǎn)生不可耐受的有害影響。所說的油最好是低酸度的且基本下未變質(zhì)的。本文中所說的“油”是指在動物體溫下呈液態(tài)的脂油或脂肪。這樣，所說的油應(yīng)在約40℃以下，最好是在35℃以下時熔化或者至少開始熔化。25℃左右呈液態(tài)態(tài)的油將有助于本發(fā)明某些配方的注射或以其它方式給藥。在一些情況下，多聚不飽和(如部分氧化的)油就生物相容能力或其它方面來說，可能對動物更為有利。
在優(yōu)選的實施例中，生物相容性油基本上是由三甘油脂組成的，即長鏈的(通常為C8-C24，最好是C12-C18)脂肪酸甘油酯，或三甘油酯與所說的脂肪酸(最好比例數(shù)非常小，例如游離脂肪酸少于10%左右)的混合物。在一些實施例里，甘油可以取代其它的三羥基或多羥基的化合物。特別好的油包括植物油，例如橄欖油、花生油、向日葵籽油、大豆油、玉米油、紅花油、棕櫚油、油菜籽油及其混合物。芝麻油和花生油對許多實施例都是最好的。假若有足夠的生物相容性，也能使用動物油或礦物來源的或合成的油(包括長鏈脂肪酸甘油酯或次丙基二醇)。
在最好的實施例中，所說的一種油的組分按該配方重量來說是占優(yōu)勢的。生物相容油的連續(xù)相在大多數(shù)情況下應(yīng)是有所要求的微細(xì)程度的，分散的多肽顆粒應(yīng)相對均勻地分布于其中，例如懸浮液中。多肽負(fù)載量的上限應(yīng)以油不呈連續(xù)相為界，因為超過此界配方中的油至少不能把大部分的多肽包在油中。
由于在所說的配方中使用了高負(fù)載量的多肽，甚至粘度因此有很大的提高，我發(fā)現(xiàn)了令人驚奇而出乎意料的結(jié)果。然而在所說的高負(fù)載量下，我還發(fā)現(xiàn)了多肽與油的相互作用在許多情況下有助于長期儲存多肽的延遲釋放。如上所述，當(dāng)多肽締合了金屬時，這種相互作用會得以增強(qiáng)。
本發(fā)明配方含有高負(fù)載量的多肽，例如至少約10%。甚至更高的多肽負(fù)載量，例如至少約15%，經(jīng)常是可望達(dá)到的，并且對于生長激素和具有基本相似特性的其它多肽來說基本上是有效的。20%或更高的負(fù)載量(例如至少約30%)，或者高達(dá)42%以上的負(fù)載量，用于作腸胃外注射的含生長激素(如小牛的)的配方中，特別是當(dāng)生長激素締合了多價金屬如鋅時是很有效的。所說的配方能提供生長激素(按牛或其它動物血流測量的)的延遲釋放周期達(dá)30天或更長時間。
在基本不含水配方中，多肽負(fù)載量高達(dá)10%左右，這在我所查閱的現(xiàn)有技術(shù)中是從未提出過的。在現(xiàn)有技術(shù)中油制劑被限制在很低的多肽負(fù)載量，即不大于2%左右(見美國專利2，964，448號;3，869，549號;和4，256，737號)。
本發(fā)明配方除含有生物相容油外，還含有“抗水合劑”，該術(shù)語在本文中是指一種可延緩本發(fā)明所指明組分，或多肽和/或生物相容油的水合作用，從而在動物用藥后降低或穩(wěn)定組分中多肽的釋放速度的物質(zhì)。已知的無毒水含劑種類繁多，作為例子提出的還有“凝膠化”試劑，當(dāng)將其分散并在一些情況下加熱使其溶解于油中時，“凝膠化”試劑會給予一批油以更大的粘彈性(從而增強(qiáng)了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性)，并且由此減緩了含水體液對油的滲透作用。
在文發(fā)明中，這些試劑的精確機(jī)理尚不完全清楚。因此觀察了某些已知的“凝膠化”試劑，甚至在含有這種試劑的油尚未經(jīng)加熱提高它們的凝膠化效果時，(或者當(dāng)凝膠形成時)，即可提供予期的抗水合作用，而凝膠一但形成即可實質(zhì)上被除去(如通過剪切力)。同樣地，實質(zhì)上沒有使油凝膠化的各種抗水合劑，對本發(fā)明均為適用的。硬脂肪酸鎂就是一個例子。
典型的抗水合劑包括各種有機(jī)酸鹽，例如具有8個(最好至少約為10)到22個(最好約20)左右的碳原子的脂肪酸，例如月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸等的鋁、鋅、鎂或鈣鹽。根據(jù)金屬的化合價和金屬被酸氧化的程度，所說的鹽可以是有一、二或三個取代基的。特別有用的是所說的脂肪酸的鋁鹽。一硬脂酸鋁和二硬脂酸鋁是最為優(yōu)選的抗水合劑。其它有用的包括三硬脂酸鋁、一和二硬脂酸鈣、一和二硬脂酸鎂以及相應(yīng)的棕櫚酸鹽。月桂酸鹽等。在許多實施例中，所說的抗水合劑的濃度，根據(jù)油加上那種試劑的重量，以約1%至約10%(最典型的是在約2%和約5%之間)為好，當(dāng)然，某些情況下亦可使用其它的濃度。
一般來說，多肽和抗水合劑兩者都傾向增加本發(fā)明配方的粘度。使用多肽，特別是具有較大MW和/或有復(fù)雜的一級或二級結(jié)構(gòu)的多肽，我發(fā)現(xiàn)由此產(chǎn)生的問題可通過使用高重量比的多肽和抗水合劑來克服。在本發(fā)明中，這個比值通常至少約為1，較典型的為至少3左右，甚至更一般的在4左右，而最常用的至少約6。雖然對組分的粘度的要求不甚嚴(yán)格，但比值一般不大于40左右，而較典型的不大于20左右為佳。
我發(fā)現(xiàn)采用這樣的比值時，甚至于采用相對高濃度多肽所固有的較高的組分粘度時，也可以有利于長時間而有效地釋放多肽。更令人驚奇的事實是在一些所說的配方中，實際釋放速度高是因多肽負(fù)載量(由此而引起的配方的粘度)的增加所致。
本發(fā)明配方能用于動物，特別是哺乳動物，包括人和其它靈長目動物體內(nèi)多肽的延遲釋放。用于治療動物的多肽包括為用于小雞、火雞等的鳥類激素，用于人、牛、豬、綿羊、山羊等的哺乳動物激素，以及用于魚類等的水生動物激素。特別有用的多肽包括促進(jìn)生長的激素和促進(jìn)生乳的激素。所說的激素包括用于提高各種哺乳類動物包括牛(例如乳牛)、綿羊、山羊和豬的瘦肉對肥肉比例。飼養(yǎng)功率以及產(chǎn)量的生長激素。
本文中所使用的術(shù)語“生長激素”是指與動物腦下垂體所產(chǎn)生的生長激素有相似生物活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)的多肽。所說的生長激素包括由腦下垂體生長激素分泌細(xì)胞所產(chǎn)生的天然生長激素，以及由遺傳上轉(zhuǎn)化了的微生物例如大腸桿菌、其它細(xì)菌或酵母所表達(dá)的生長激素。用所說的另外一種方法產(chǎn)生的生長激素可能與天然生長激素有相同的氨基酸序列，或可能是在氨基酸序列中有一個或多個變異的類似物，這種變異可提供較高生物活性或某些其它優(yōu)點。對于本發(fā)明特別有用的多肽包括牛和豬生長激素，如由微生物表達(dá)的牛和豬生長激素，以及牛、豬或其它動物催乳激素、生長激素釋放因子、胎盤催乳激素、類胰島素生長因子等。這些多肽一般在N-末端上可具有蛋氨酸的殘基，例如由微生物翻譯多肽一個基因中的ATG起始信號所得到蛋氨酸。然而，在一些情況下希望多肽里的蛋氨酸殘基中的甲酰一蛋氨酸不多于20%左右(最好不大于10%左右)以便減少動物的外來體對多肽降解的任何保護(hù)傾向。
注射本發(fā)明配方時觀察到在某種程度上大部分的多肽是在注射開始釋放出來。這可看作為“爆發(fā)”，據(jù)信這是由注射或其它用藥方式而引起表面積增加造成的。在一些情況下有節(jié)制的爆發(fā)是需要的，例如激活予期的生物效應(yīng)。在配制本發(fā)明之制劑的配方中，一個有用的特征是通過測量短時間用藥后經(jīng)處理的動物血清中多肽濃度而確定的開始爆發(fā)水平，與通過測量其后時間動物血清中多肽濃度而確定的延遲釋放的水平的相互關(guān)系。作為本發(fā)明的目的，爆發(fā)水平是指注射后24小時血清中多肽的濃度，而延遲釋放水平是指注射后14天血清中多肽的濃度。這些濃度被用來計算“爆發(fā)對延遲釋放”的比例，其值一般認(rèn)為在1.2左右和6左右之間為好，有報道在1.5左右和3左右的。
估價和配制本發(fā)明配方中另一有用的特征是“注射器能力”，這是對通過皮下注射針頭的組分流動情況好壞的度量。假若多肽顆粒太大或配方太粘，那就需要施加未加限制的壓力迫使組分通過所說的針頭。對于本發(fā)明的“注射器能力”的確定，規(guī)定一定體積的本發(fā)明組分通過18號標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的皮下注射針頭，其內(nèi)徑為0.033寸(0.838毫米)，長4厘米，對盛在裝有針頭注射器的組分施加173磅/平方英寸〔1193千帕(Kpa)〕的壓力。對本發(fā)明的配方，“注射器能力”要求至少為0.03毫升/秒。所說的注射器能力最好高些，例如至少約0.1毫升/秒，甚至更希望至少約0.3毫升/秒。
本發(fā)明配方的制備是通過將多肽加入單一的油中或懸浮或溶解有抗水合劑的油中。經(jīng)常最方便的做法是溶解抗水合劑而得到凝膠化的油，于攪拌下向油中加入一定量粉末狀凝膠劑如脂肪酸鋁，以有助于粉末的懸浮。攪拌過的懸浮液按要求至少要加熱到脂肪酸鹽(如對AIMS)的熔點(至少155)，在該溫度下所說的鹽將溶于油中。假若凝膠劑或別的抗水合劑能充分溶解，那么也可采用較低的溫度，徹底而連續(xù)地攪拌有助于防止脂肪酸鹽的團(tuán)聚而保持分散態(tài)。通常，加熱和攪拌應(yīng)持續(xù)到懸浮的鹽完全溶解。經(jīng)常還希望再繼續(xù)攪拌一段時間，以保證完全溶解。
脂肪酸鹽的油溶液經(jīng)冷卻(如到室溫)，將會產(chǎn)生相當(dāng)穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。凝膠應(yīng)該保存在真空條件下或脫水以避免對凝膠結(jié)構(gòu)可能有不利影響的水的沾污。
然后，在不會產(chǎn)生極為有害影響(如變性)的任何溫度(如室溫)下，將多肽加入油中。例如，4-125℃下，將牛生長激素加到油中而不會破壞生物活性。以在真空中加入多肽為宜，這樣可以避免水和氣泡的污染。按要求，應(yīng)將多肽仔細(xì)分次緩慢加入油中，經(jīng)過高剪切力混合以便使多肽顆粒形成均勻的分散體。
常常希望減小多肽顆粒體積，而且這是可以做到的，如利用球磨機(jī)，在其中多肽懸浮液與裝有一定量直徑約為0.3-0.6cm的不銹鋼球相混合。這與有高速剪切力混合的容器內(nèi)較低部分的分散體同時進(jìn)行，更有助于完成上述要求。這對于那些很難將顆粒尺寸減小到平均粒徑(以體積為基礎(chǔ))為不大于15微米(如50%體積的顆粒具有不大于15微米的直徑)的高電荷多肽是特別有利的。已發(fā)現(xiàn)利用小顆粒多肽(如平均粒徑不大于10，最好不大于5微米)可望提高本發(fā)明配方的注射器能力。使用所說的球磨機(jī)可以很容易將多肽顆粒的平均粒徑減小到不大于約5微米的較好狀態(tài)。然后，利用過濾(最好在真空中)從球磨機(jī)中回收本發(fā)明的制劑。如前所述，引人注意的是將本發(fā)明的配方用于腸胃外給藥，如腹腔內(nèi)注射，更理想的是用于皮下注射和肌肉注射。延遲釋放時間，即使多肽以達(dá)到所要求的理想的生物學(xué)效應(yīng)的速度進(jìn)行釋放的時間，典型地是用動物循環(huán)血流內(nèi)多肽的濃度表示。延遲釋放期取決于所用的多肽和其生物學(xué)效應(yīng)，按要求至少大約7天。其它情況下，可以至少約為15天，更多地應(yīng)用的是至少大約30天，或甚至至少60天或60天以上。事實上，根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有與鋅締合的牛生長激素制劑在注射了劑量為2.5ml的哺乳牛的血清中至少持續(xù)釋放大約7天，平均牛生長激素濃度至少為12毫微克/毫升。這對于達(dá)到提高牛奶產(chǎn)量和或/飼料牛如轉(zhuǎn)化率的目的是很有利的。為了給要處理的奶牛(如提高牛奶產(chǎn)量)提供有效劑量的牛生長激素，要求配方中至少含有大約300mg的與鋅締合的多肽以便使增加的活性牛生長激素的血清水平維持至少大約15天。為了易于給藥，與鋅締合的生長激素濃度應(yīng)足夠高(如至少約15%)，以便使用少量的制劑(如大約10ml或更少，如在大約1ml至大約3ml之間)是本發(fā)明的一個重要特征。
當(dāng)然，也可以向配方中添加其它材料，希望所提供的這些材料不至于明顯地抑制多肽的延遲釋放。例如可以向本發(fā)明的配方中加入消炎劑或其它添加劑，以減少、防止或抵抗外來物(如無過敏性的)反應(yīng)的影響。這些添加劑包括留醇化合物和/或非留醇化合物消炎劑。配方中添加劑的量最好是低至不足以引起任何全身效應(yīng)，但對減少局部炎癥又是足夠有效的。
與金屬締合的生物活性多肽的制備可用無毒金屬(如鋅)離子與溶解的多肽反應(yīng)來制備與多價金屬締合的多肽。通常，以低水溶性鹽的形式或一般最好是水溶性鹽(如氯化鋅)的形式將金屬加至多肽的緩沖液中以便沉淀出與金屬締合的多肽。通常溶液中含有有機(jī)增溶劑，如脲、胍等，以助于溶解多肽，特別是那些微水溶性的多肽。許多情況下，增溶劑的濃度和/或溶液的PH值對維持多肽的生物活性構(gòu)型是很關(guān)鍵的。
另外，一般說來，溶液的PH值對所得的與金屬締合的多肽(通常是作為沉淀物)的回收是關(guān)鍵的，PH值的臨界范圍取決于多肽的等電點。溫度最好低些，如通常不高于室溫，以避免變性。根據(jù)所用多肽的純度，必要時可以去熱原和/或滅菌。如有熱原(如內(nèi)毒素)存在，可因多肽溶液與離子交換樹脂接觸被除去。多數(shù)熱原會結(jié)合到正電位點上，如在陽離子交換樹脂上，有些熱原可以結(jié)合到負(fù)電位點上。因此，使用離子交換樹脂微球的混合床可以確保充分排除熱原、如利用0.2微米篩目這樣的精細(xì)過濾器可以除去如細(xì)菌或來自前期處理過程中的污染物等的未滅菌異物，從而可將多肽溶液滅菌。
然后，將無毒金屬溶液加至去熱原的，滅菌的多肽溶液中。以沉淀出與金屬締合的多肽，通?？赏纬蓱腋∫?。金屬的添加速度對所得與金屬締合的多肽的顆粒大小有影響?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)所加溶液中金屬的濃度，體積流速和/或分散速度來控制金屬的添加。
通常，須對與金屬締合的多肽的懸浮液進(jìn)行稀釋，以減小粒度增長的趨勢，如可通過凝集作用。然后進(jìn)行多次離心和洗滌以除去多余的金屬和陰離子，從而回收與金屬締合的多肽，并凍干之。
將多肽和金屬離子的溶液凍干即可制得與一價金屬(如鈉或鉀)締合的多肽。
與金屬締合的生物活性生長激素的制備在所述步驟的更具體的說明中，可將生長激素溶解在各種緩沖液中。較好地是將它溶解在用三羥甲基氨基甲烷(TRIS)或其它合適的緩沖劑緩沖的含水尿素溶液中。通常要求尿素濃度的上限大約為6M;有時，以大約4.5M為重。也可以使用低濃度尿素溶液，即3M或2M，甚至1M，但是要用低溶解性的生長激素。
經(jīng)緩沖的尿素溶液的PH值以大約7至大約10.5為宜，其間的在這些PH值限度內(nèi)，溶液中生長激素的回收率典型地至少是大約60%;一般地說，PH為9-9.5時能達(dá)到較高的回收率(如至少90%)。
整個沉淀過程中，溶液的溫度應(yīng)足夠低，以防生長激素齊聚。通常該溫度要求低于約10℃，最好低于約5℃。
利用滲濾(或透析)法來處理溶液(如前所述已去熱原和滅菌的溶液)，使尿素與金屬碳酸氫鹽溶液(如2.5mM NaHco3溶液，PH9.5)或其它合適的鹽交換，以便提供一種與一價金屬締合的多肽。最好用碳酸氫鹽溶液進(jìn)行多次交換從而保證將尿素完全交換。然后再對溶液進(jìn)行處理，即用水進(jìn)一步滲濾除去過量的NaHCo3(以開始出現(xiàn)MBS沉淀為指征)。通過凍干來回收鈉-生長激素，以生產(chǎn)出生長激素鈉鹽的粉末。
為了提供與多價金屬締合的多肽，將多價(如鋅)鹽加入溶液中(如前所述已去熱原和滅菌的溶液)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用1M氯化鋅溶液能從生長激素的4.5M尿素溶液中得到可實用的Zn-生長激素沉淀物，當(dāng)然也可使用較高或較低濃度的氯化物。最好緩慢加入ZnCl2溶液，如滴定，同時攪拌生長激素溶液。
隨著ZnCl2溶液的繼續(xù)加入，生長激素溶液首先呈現(xiàn)灰白色，以隨后呈現(xiàn)的珍珠白色做為所加入的ZnCl2的化學(xué)計算量。例如，將4Ml 1M ZnCl2加入到400Ml PH為9.5的，在每毫升約含20Mg生長激素和0.09M的TRIS的4.5M尿素溶液中，搖勻，即可形成呈珍珠白色的Zn-生長激素懸浮液，繼續(xù)加入ZnCl2(如直到大約10Ml 1M ZnCl2溶液)，以保證完全沉淀。
然后，通常要求稀釋懸浮液以減少沉淀物粘度增長的趨勢。已發(fā)現(xiàn)用大約3.5體積的水來稀釋1M的尿素溶液，可以避免Zn-生長激素顆粒凝聚。利用滲濾法(或多次離心和洗滌)除去尿素、TRIS、鋅離子和氯離子進(jìn)行回收Zn-生長激素顆粒，隨后凍干，通?？傻玫搅６刃∮?0-20微米的粉末。
當(dāng)生長激素為牛生長激素時，其顆粒通常含有大約0.3-1%的鋅(大約每個生長激素分子有1-4個鋅分子)。如果提高加入Zn的速度，則發(fā)現(xiàn)沉淀中Zn的含量較高，如可高達(dá)4-5%。造成較高Zn含量的原因可能是所加入的Zn結(jié)合到了生長激素的活性酸結(jié)合點上，可能加在了天門冬氨酸和/或谷氨酸殘基上，亦可能在組氨酸殘基上，或多肽的羥基末端上。這種結(jié)合鋅的理論不能認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制。一般說來，以使用少量的鋅進(jìn)行沉淀為好。
下面的實施例只是對本發(fā)明的具體說明，并不是限定本發(fā)明的范圍。
實施例1本實施例描述了本發(fā)明的與鋅締合的牛生長激素的制備。
本實施例參考了Seebury等人(“EfficientBacterialExpressionofBovineandPorcineGrowthHormone”2(1)DNA37-45(1983)所述制備N-末端是蛋氨酸的牛生長激素(MBS)的方法。通過融解細(xì)菌細(xì)胞，再從細(xì)菌細(xì)胞碎片中分離出生長激素，以常規(guī)方法回收生長激素。
回收MBS的方法之一是用50%的硫酸將發(fā)酵肉湯的PH值降低到1.7從而殺死細(xì)菌，再用NaoH中和肉湯，離心，留下懸浮在中的細(xì)胞糊，搖勻，冷卻至大約4℃(直到MBS凍干前的以下各步驟都要保持該溫度)將細(xì)胞糊離心并洗滌三次，溶解在鹽酸胍中(7M)離心除去不溶物，過SephadexG25柱以用胍交換尿素，過濾之后再過DE52離子交換柱。通過空心絲超濾作用，流出物的體積減小大約30倍，使?jié)饪s的溶液通過Sephader G75層析柱，進(jìn)行另一個空心絲體積減少步驟，然后透析以使尿素首先交換NaHCO3溶液，之后交換蒸餾水，沉淀出MBS。將沉淀物凍干，留下如前所述的Seeburg等人的文章中指明的具有NH2-met-phe(1)-pro(2)……leu(126)……phe(190)……CooH氨基酸序列之多肽(MBS)的白色固體(微溶于水)。
這種MBS于4℃下按每ml21.5mg溶解于pH9.5的4.5M尿素，0.09M的TRIS溶液中。按每Ml無菌MBS與0.2克陰/陽離子混合離子交換樹脂微球(BioradAG-501×8)混合，使MBS溶液去熱原。于4℃下，將混合物攪拌10分鐘，然后用1微米尼龍過濾器過濾以除去含有吸附之熱原的樹脂微球。將溶液通過經(jīng)輻射滅菌的，0.2μm篩目的褶形膜過濾器除去細(xì)胞或來自前期處理過程的污染物等帶菌異物，從而使已去熱原的MBS滅菌。
在攪拌去熱原的MBS溶液的同時，加入1M ZnCl2使MBS轉(zhuǎn)化為鋅鹽(ZnMBS)。沉淀出的ZnMBS含有大約1%的鋅。然后用無菌的去熱原水稀釋含有ZnMBS固體物的溶液，使尿素濃度為1M。
將溶液保持于4℃，以10，000×g離心30分鐘，回收ZnMBS。利用高速剪切力混合方法使ZnMBS以50mgZnMBS/ml懸浮于無菌的去熱原的水中。再以10，000×g離心30分鐘，回收ZnMBS，再利用高速剪切力混合法按50mgZnMBS/ml懸浮于無菌的去熱原的水中，而后凍干產(chǎn)生出白色蓬松的無菌ZnMBS粉末。
實施例1A本實施例描述ZnMBS另一制備方法利用正壓容積，于10℃下，將溶于4.5M尿素和0.05MTRIS中(PH為8.8)含濃度為21mg/ml的去熱原的無菌溶液循環(huán)通過一個容納罐，在泵的吸力下，加入1MZnCl的濃度達(dá)到0.01M，即得到ZnMBS沉淀。加水稀釋使?jié)舛冗_(dá)到10mgMBS/ml，從而進(jìn)一步沉淀出ZnMBS。然后于25C下，將所得ZnMBS懸浮液循環(huán)通過滲濾空心絲膜(該膜具有可通過100000MW分子的微孔)，使?jié)舛冗_(dá)到40mgMBS/ml;然后加水使膜過濾速度加快，直到基本上所有的Zn，尿素和TRIS都從懸浮液中除去。估計濃度大約為80mgMBS/ml時停止加水。然后將濃縮的懸浮液凍干，以便提供干的，具有顆粒大小在0.5-11微米范圍內(nèi)的ZnMBS白色粉末。
實施例1B本實施例描述與鈉締合的牛生長激素的制備。
于4℃和PH9.5條件下，將每毫升4.5M尿素、0.05M TRIS中含21.5mg的去熱原和無菌的溶液進(jìn)行透析以尿素首先交換NaHCO3溶液，然后交換蒸溜水。當(dāng)MBS開始出現(xiàn)沉淀時，即停止水交換。然后用0.2微米過濾器過濾溶液，濾出沉淀的MBS，凍干，得到能用于本發(fā)明之配方的鈉鹽(NaMBS)。
實施例2本實施例描述本發(fā)明之含有與鋅締合的生長激素配方的制備。
將一定量芝麻油(FisherNFGrade)加至三口園底燒瓶中，加入抗水合劑(AlMS)(其量占AIMS與芝麻油的總量的5%)。將燒瓶放入155℃的油溶中，攪拌使AIMS盡可能快地分散。當(dāng)AIMS完全溶解于油時，繼續(xù)攪拌20分鐘，從油溶中取出燒瓶，于真空中冷卻到25℃，在冷卻過程中，溶液變成了粘稠的膠體。將冷卻的膠體送入裝有直徑為1/8，3/16和1/4寸(0.32、0.48和0.64Cm)的不銹鋼球的球磨機(jī)中，該球磨機(jī)具有高速剪切攪拌能力。將球磨機(jī)抽真空，并且用螺旋送料器將ZnMBS粉末(按實施例1所述方法制備)緩慢加入其中，直到配方中含有40%的ZnMBS(ZnMBS與AlMS重量比為13.3)。繼續(xù)攪拌6小時，其間，ZnMBS顆粒平均直徑從20微米減小到5微米，經(jīng)過濾從鋼球中分離出所得到的基本上無水的ZnMBS的膠凝化油懸浮液。
實施例3本實施例描述通過多肽，如牛生長激素的延遲釋放來提高哺乳期奶牛的產(chǎn)奶量，以驗證本發(fā)明之配方的效能。
按照實施例2方法，將5%的AIMS溶液在已加熱至155C的芝麻油中來制備基本上無水的制劑。將油冷卻形成膠凝化的油。使ZnMBS在油中分散且磨碎，直到油的連續(xù)相中含有32%的ZnMBS(ZnMBS與AIMS重量之比為9.4)，于配有18號，1.5寸(3.8)長之針頭的注射器抽入2.54g(2.5ml)制劑，以提供含有805mgZnMBS的劑量。制劑具有0.36ml/sec的注射器能力，同時制備在芝麻油中只含5%AIMS而不含多肽的空白配方，并取2.4g裝入同樣的注射器中。
將制劑注入23頭處于第二(或繼后)哺乳期的第二或第三個月的的荷斯坦(Holstein)奶牛體內(nèi)。將這些牛以每組5或6頭隨機(jī)分成4個組，兩組在臀肌區(qū)進(jìn)行肌肉注射，其中一組用含有ZnMBS的制劑，另一組(控制組)用空白的制劑。類似地，另外兩組在肩胛區(qū)用含有ZnMBS或空白制劑進(jìn)行皮下注射。
平均牛奶產(chǎn)量的累積最小-乘方均值(用預(yù)先處理的牛奶產(chǎn)量協(xié)變校正差值)如表1所示。其中牛奶產(chǎn)量公斤/天數(shù)表示。由表1所顯示的很高的統(tǒng)計學(xué)差異顯著性水平可以看出將本發(fā)明的配方單獨進(jìn)行肌肉注射或皮下注射，可迅速而長時間地提高牛奶產(chǎn)量。
對于未按本發(fā)明給藥的牛，采集血樣分析了其循環(huán)系統(tǒng)中牛生長激素正常含量。用放射免疫測定法(“RIA”)所作抽樣分析的結(jié)果如表2所示。其中血清中生長激素的濃度用毫微克/毫升(ng/ml)表示。
表2血漿中平均牛生長激素濃度(ng/ml)注射后天數(shù)肌肉注射皮下注射控制ZnMBS控制ZnMBS06.75.95.15.716.58.44.68.727.89.04.311.137.19.14.010.147.510.14.59.858.112.03.111.268.118.23.911.978.021.23.612.997.921.36.616.5116.818.25.216.6137.616.75.217.5157.016.25.415.7175.612.94.111.7195.413.84.412.0216.011.24.310.0235.710.65.39.5255.69.84.49.0275.88.44.98.5293.56.81.17.4313.85.92.56.7
實施例4本實施例闡述使用不同材料配制的在動物體內(nèi)延長多肽(MBS)釋放的本發(fā)明三配方的效力。
本實施例中，ZnMBS制劑基本上是按實施例3方法，聯(lián)合使用如下成份配制的。
生物相容性油芝麻油或花生油抗水合劑AlMS油與AlMS之和的3%或5%多肽負(fù)載ZnMBS總制劑的20%，30%或40%將AlMS分散到油中，加熱并于155℃下維持15分鐘，之后將分散相冷卻至25℃，形成膠凝化的油，加入ZnMBS且用高速剪切刀混合器(Polytron勻漿器)處理使之分散，形成ZnMBS在膠凝化油中的懸浮液，將懸浮液裝入帶18號皮下注射針頭的結(jié)核菌素注射器。
給每組8只計16組免疫抑制的雌性Sprague-Dawley(IFS-D)大鼠于背部肩胛區(qū)皮下注射表3所列的配方。
表3注射的配方劑量體積重量比組微升油AlMS%ZnMBS%ZnMBS/AlMS1200芝麻3無-2200芝麻3208.33130芝麻33014.34100芝麻34022.25200芝麻5無-6200芝麻5205.07130芝麻5308.68100芝麻54013.39200花生3無-10200花生3208.311130花生33014.312100花生34022.213200花生5無-14200花生5205.015130花生5308.616100花生54013.3(a)基于油與AlMS之重量和。
用放射性免疫分析法分析血樣中牛的生長激素含量。表4中的分析結(jié)果是以微之克/毫升血漿表示的。表4所示的血漿含量水平，其血樣是在注射以前0天(即注射當(dāng)天)采集的。實施例4-7中對于大鼠的某些基線測量高于實施例3中對牛的某些基線和釋放的多肽的測量。其原因部分是由于存在與正常生長激素水平的種間差異，部分是由于實施例3的放射免疫分析法更為精確。
表4牛生長激素的平均血漿濃度，ng/ml注射后的天數(shù)組0137111421283529765440304138832118223104943092371411136031154638124523916913649356261125591146119864940487633819418120314183445386468258151134149103483510673547025515294322519116582391221166134473032121175336122417114672415214738317814395774134291584792461831972151066770167413281146142135663949(按著上面所示的天數(shù)，對照組1，5，9和13的平均濃度讀數(shù)是在5-12微毫克/毫升之間)。
實施例5本實施例說明在用其他脂肪酸鋁鹽作為抗水合劑時，對本發(fā)明之延遲釋放多肽配方的效能。這些配方中，用月桂酸鋁(AlML)和-棕櫚酸鋁(AlMp)作為抗水合劑，用芝麻和花生油作為該配方的連續(xù)相。
在本實施例中，基本上按實施例4的方法，制備含有3%AlMP或AlML的凝膠化油，將ZnMBS懸浮在凝膠化油中，濃度為總配方的30%(ZnMBS與AlML或AlMP的重量比為14.3)。按著表5所示的劑量給一組8只IFS-D大鼠注射。
表5注射的配方劑量體積組微升油抗水合劑17130芝麻AlML18130芝麻AlMp19130花生AlML20130花生AlMp注射后按指定的天數(shù)，對于取自大鼠的血樣進(jìn)行分析，得到如表6所示的牛生長激素濃度，表中以0天的讀數(shù)作為分析基線。
表6血漿中平均牛生長激素濃度，ng/ml注射后天數(shù)組01371421179431143172493018106322292775833191142116219832282094921642101735
實施例6本實施例說明，利用橄欖油或者玉米油作為連續(xù)相的，本發(fā)明之多肽(MBS)延遲釋放配方的效能。
本實施例中，基本上按實施例4的方法，用占AlMS與油之重量和3%的AlMS，制備凝膠化油。將30%或者40%ZnMBS的懸浮液按著表7所示的劑量給兩組各為8只的IFS-D大鼠注射。
表7注射的配方體積量組微升油ZnMBS.%重量比，ZnMBS/AlMS21100橄欖4022.222130玉米3014.3注射后按指定的天數(shù)，分析取自大鼠的血樣，得到如表8所示的牛生長激素濃度，其中以0天的讀數(shù)作為分析基線。
表8血漿中平均牛生長激素濃度，ng/ml注射后天數(shù)組014111425217996314174983622713144441589835實施例7本實施例說明，在花生油中含有約10%的多肽，MBS和ZnMBS的本發(fā)明之配方。本實施例進(jìn)一步說明，使用與金屬締合的多肽以及抗水合劑，可以提高多肽的延遲釋放反應(yīng)。表4中指定的注射配方基本上是按著實施例4的方法制備的。
表9注射的配方組多肽多肽填充劑，% 油 AlMS，%(a)30MBS10花生-31ZnMBS10花生-32MBS10花生133ZnMBS10花生1(a)基于油與AlMS重量之和將每種配方給一組8只IFS-D大鼠皮下注射300微升。注射后按指定的天數(shù)對取自大鼠的血樣進(jìn)行分析，得到如表10所示的血漿濃度，其中以0天的讀數(shù)作為分析基線。
表10血漿中平均牛生長激素濃度，ng/ml注射后天數(shù)組01357111430141350375145755020311518003102402004020321212002501236435213318620350330280175125比較組30與31的結(jié)果表明，使用締合的多肽金屬，可提高延遲釋放MBS至少7天。比較32與33的結(jié)果表明，當(dāng)MBS是與這樣的多價金屬締合時，使用抗水合劑可提高M(jìn)BS的延遲釋放。
實施例8本實施例說明，在下述每種油含有10%牛生長激素，而沒有抗水合劑存在的本發(fā)明之配方。這些油是芝麻油、花生油、玉米油、橄欖油、紅花籽油棉籽油、棕櫚油、菜籽油以及豆油。將各種油的分離體積保持在下述各溫度下4℃，25℃，50℃，75℃，100℃和125℃。
與實施例2相同，將ZnMBS分散在每種油中并碾磨之，直到其濃度為10%，要使碾磨連續(xù)進(jìn)，直到生長激素的平均顆粒直徑小于15微米。各配方的注射器能力大于0.1毫升/秒。
實施例9本實施例說明，按實施例8的方法制備的本發(fā)明之配方，與實施例8不同的是，在加入生長激素以前，將AlMS分散在每種油中，其濃度為油與AlMS之重量和的5%。該配方的注射器能力的注射器能力大于0.1毫升/秒。
實施例10本實施例說明，按實施例8的方法制備的本發(fā)明的配方，與實施例8不同的是，連續(xù)加入生長激素，直到配方含有40%的牛生長激素。連續(xù)進(jìn)行分散和碾磨，直到生長激素平均顆粒直徑小于15微米。該配方的注射器能力大于0.03毫升/秒。
實施例11本實施例說明，按實施例10的方法制備的本發(fā)明之配方，與實施例10不同的是，在加入生長激素以前，將AlMS分散在每種油中，其濃度為基于油與AlMS之和的5%。該配方的注射器能力大于0.03毫升/秒。
實施例12本實施例說明，在下例每種油中含有10%的牛生長激素的本發(fā)明之配方。這些油是芝麻油、玉米油、橄欖油、紅花籽油、棉籽油、棕櫚油、菜籽油以及豆油。將每種油加熱到160℃并攪拌以溶解AlMS。當(dāng)1%AlMS被溶解時，將每種油冷卻到25℃。與實施例2相同，將ZnMBS分散在冷卻的油中并在其中碾磨，直到其濃度達(dá)到10%，并且，其平均顆粒直徑降低到15微米以下，各配方的注射器能力均大于0.1毫升/秒。
實施例13本實施例說明，按實施例12的方法制備的本發(fā)明之配方，與實施例12不同的是，連續(xù)加入生長激素，直到各配方含有40%的生長激素。與實施例2相同，碾磨該配方直到生長激素的平均顆粒直徑小于15微米。各配方的注射器能力均大于0.03毫升/秒。
實施例14本實施例說明，在下列溶解有濃度為基于油與AlMS之和的5%的AlMS的油中，本發(fā)明的配方含有10%的牛生長激素，這些油是芝麻油、花生油、玉米油、紅花籽油、棉籽油、棕櫚油、菜籽油以及豆油。將各種油加熱到160℃并攪拌以溶解AlMS。當(dāng)AlMS溶解以后，將每種油冷卻到25℃。與實施例2相同，然后，將ZnMBS分散在冷卻的油中并碾磨之，直到其濃度為10%。將分散液進(jìn)一步碾磨，直到生長激素的平均顆粒直徑小于15微米。各配方的注射器能力大于0.1毫升/秒。
實施例15本實施例中，制備含有42%的牛生長激素的本發(fā)明的配方，是通過連續(xù)向?qū)嵤├?4的配方中加入生長激素，直到各配方含有42%的生長激素。在還保持油作為連續(xù)相的同時，與實施例2相同，將生長激素分散并碾磨之，直到其平均顆粒濃度小于15微米。各配方的注射器能大于0.03毫升/秒。
實施例16本實施例說明，在與實施例9中使用的油相類似的油中，用下列抗水合劑中的一種代替AlMS，本發(fā)明的配方含有20%的牛生長激素，這些抗水合劑是二硬酯酸或三硬酯酸鋁;一、二或三棕櫚酸或月桂酸鋁;一或二硬酯酸、月桂酸或棕櫚酸鎂;以及一或二硬酯酸、月桂酸或棕櫚酸鈣。在加入生長激素以前，將抗水合劑加到油中。與實施例2相同，將ZnMBS加進(jìn)去，直到其濃度為20%。連續(xù)進(jìn)行分散和碾磨，直到生長激素的平均顆粒直徑小于15微米。各配方的注射器能力大于0.03毫升/秒。
實施例17本實施例說明，在與實施例20和相類似的油中，含有其他濃度的牛生長激素的本發(fā)明之配方，在此，與實施例16使用的油不同的是，連續(xù)向其中加入生長激素，直到其濃度為25%、30%或35%。連續(xù)分散并碾磨，直到生長激素的平均顆粒濃度小于15微米，各配方的注射器能力大于0.03毫升/秒。
實施例18當(dāng)采用化學(xué)上未結(jié)合的或者化學(xué)與鈉或鉀離子締合的牛生長激素時，所得的結(jié)果基本上與實施例8-17所得的結(jié)果相同。
實施例19當(dāng)使用別的牛生長激素時，所得到的結(jié)果基本上與實施例8-18所得到的結(jié)果相同，例如使用如下氨基酸順序的牛生長激素。
NH2-蛋-苯丙(1)-脯(2)……纈(126)……苯丙(190)-COOHNH2-丙-苯丙(1)-脯(2)……纈(126)……苯丙(190)-COOHNH2-丙-苯丙(1)-脯(2)……亮(126)……苯丙(190)-COOHNH2-苯丙(1)-脯(2)……亮(126)……苯丙(190)-COOHNH2-苯丙(1)-脯(2)……纈(126)……苯丙(190)-COOHNH2-蛋-天冬-谷-苯丙(1)-脯(2)-亮(126)-苯丙(190)-COOHNH2-蛋-天冬-谷-苯丙(1)-脯(2)-(126)-苯丙(190)-COOHNH2-蛋(4)……亮(126)……苯丙(190)-COOHNH2-蛋(4)……纈(126)……苯丙(190)-COOH實施例20-30在實施例8-18的方法中用豬生長激素來代替所用的牛生長激素時，其結(jié)果基本相同，這是因為牛和豬生長激素之間的相似性。
在對本發(fā)明的具體實施進(jìn)行描述的同時，本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)技術(shù)人員可以很清楚的是在不超出本發(fā)明的實質(zhì)和內(nèi)容的前提下，可進(jìn)行若干改動。因此，發(fā)明人想用下述權(quán)利要求概括全部發(fā)明內(nèi)容以內(nèi)的各種變化。
權(quán)利要求
1.用于延遲釋放組合物中的生長激素的制備方法，其特征在于該方法是將牛生長激素或豬生長激素與多價金屬離子進(jìn)行反應(yīng)性接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的生長激素是豬生長激素，其中的金屬離子選自包括鋅、鐵、鈣、鉍、鋇、鎂、錳、鋁、銅、鈷、鎳和鎘的一組離子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的金屬離子是銅離子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的生長激素是牛生長激素，其中的金屬離子是鋅離子。
全文摘要
采用新的配方可使生物活性多肽經(jīng)腸胃外延遲釋放，以達(dá)到所要求的作用效果。其中在生物相容性油的多肽的比例是很高的，如至少約為10％(重量)。同時，還介紹了一些用以使生長激素腸胃外延遲釋放的與金屬締合的生長激素。
文檔編號A61K47/44GK1044761SQ8910668
公開日1990年8月22日 申請日期1989年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1984年10月4日
發(fā)明者詹姆斯·威廉·米切爾 申請人:孟山都公司