專利名稱：乙二胺四乙酸作為需鈣/調鈣蛋白的白激酶ii或蛋白激酶c的抑制劑的應用的制作方法
需鈣/調鈣蛋白的蛋白激酶Ⅱ(CCPKⅡ)和蛋白激酶C(PKC)是一種細胞信號傳遞機制中的成分，該機制是磷脂酰肌醇(4，5)雙磷酸酯(PIP2)進行受體控制的降解而降解為第二信使肌醇(1，4，5)三磷酸酯(IP3)及二甘油二酯(DAG)。IPa使鈣從細胞內貯存物中釋放出來，并與調鈣蛋白結合，然后以鈣/調鈣蛋白復合物的形式激活CCPKⅡ。DAG直接激活在細胞膜上靠細胞質一邊的PKC。鈣以及已知的PKC激活劑，如DAG或佛波醇酯，能引起平滑肌的收縮，促進分泌過程以及影響細胞的增殖(Y.Nishizuka(1986)Nature 308，693-698，(1988)同上334，661-665)。因此，找出在心血管失調、風濕病、中樞神經系統失調以及癌癥等病的治療過程中很有可能起作用，并對CCPKⅡ及PKC有高度親和力的專一性抑制劑是有很重要意義的。
迄今為止尚未有CCPKⅡ的專一性抑制劑的報道。
目前已知的PKC的抑制劑多少有點非專一性(L.G.Garlandetal.(1987)TIPS8，(1987)334)。K.Albert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，(1984)，3622-3625;F.Hucho等，FEBSLett.211(1987)，207-210;J.R.McDonald和M.P.Walsh，Biochem.J.232，(1985)，559-567描述了存在于細胞本身的內源抑制PKC的蛋白/肽。溶神經鞘脂類和神經鞘氨醇是存在于細胞膜上的脂類降解產物，而且也有可能起抑制PKC的作用(Y.AHannun和R.M.Bell，Science235(1987)670-674)。到目前為止，尚未透露有內源低分子量的水溶性抑制劑。
本發(fā)明的目的是提供新的低分子量的CCPKⅡ和PKC的抑制劑。
目前已令人驚呀地發(fā)現，乙二胺四乙酸(EDTA)及其類似物是上述激酶的極好抑制劑。
以下本發(fā)明涉及到乙二胺四乙酸(EDTA)或其類似物作為需鈣/調鈣蛋白激酶Ⅱ或蛋白激酶C的抑制劑的應用。
最好的EDTA類似物是它的酯類，具體地說是含有1至6個碳原子的脂肪族的酯。特別推薦的類似物是乙酯。
但是，EDTA本身由于抑制CCPKⅡ和PKC為最好。
根據濃度的不同，EDTA及其類似物可抑制CCPKⅡ和PKC高達100%。
用于測定CCPKⅡ活力的是鼠腦膜制劑，將該制劑在調鈣蛋白激活劑存在或不存在的情況下與標記的ATP(γ32P-ATP)一起保溫，利用已被轉移的32P-磷酸酯所放射標記并在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中分級分離的蛋白進行分析，然后用放射性自顯影儀分析，再用激光光密度分析法進行定量分析。
用于測定PKC活力的制劑是鼠腦制劑，該制劑與標記的ATP(γ-32P-ATP)一起保溫，組蛋白作為底物蛋白，磷脂酰絲氨酸、鈣和/或DAG作為激活劑(t＝0.5或1或2分鐘)。磷酸化反應用以下方法終止a)用移液管將反應物吸至磷酸纖維素上上，b)加入3%SDS(十二烷基磺酸鈉)。在a)的情況下，將磷酸纖維素洗滌數次，除去過量的標記ATP，在b)的情況下，按Lammli的方法(U.K.Laemmli(1970)Nature 225，680-688)進行SDS凝膠電泳。通過測定磷酸纖維素的放射性(a)在β-計數器內測定契倫科夫放射線，或b)將X-射線膜放在干的SDS電泳膠頂部進行光密度分析)可定量測得PKC在無抑制劑(對照＝100%)及有抑制劑存在下的活力。
鑒于以上所述的抑制作用的原因，EDTA及其類似物可用來治療心血管失調(例如高壓壓，動脈粥樣硬化)、中樞神經系統疾病、炎癥、癌癥及病毒感染。
以下例子對本發(fā)明加以闡明a)CCPKⅡ的濃縮及活性測定CCPKⅡ的濃縮及測定基本上按Schulman和Greengard的方法(Schulman，H，J.和Greengard，P.(1978)Nature271，478-479)進行。
b)PKC的純化用改進的Walton方法(G.M.Walton等(1987)Anal.Biochem.161，425-437)從牛腦中分離出PKC，以下所有步驟都在4℃下進行
將200-250g牛腦(外皮)放入1l均化的緩沖液〔20mM三乙醇胺pH7.4;10mMEGTA(乙二醇雙乙胺醚-N，N′-四乙酸);2mMEDTA;1mM二硫赤鮮糖醇;2mM苯基甲基磺酰氟;10mg/ml抗蛋白肽酶;10mg/ml甲〔乙〕酰-亮-亮-精三肽〕中勻漿并在16000xg下離心1小時。上清液用玻璃棉過濾后加入DEAE-纖維素柱中(柱床體積180ml，用20mM三乙醇胺pH7.4;10mMEGTA;2mMEDTA;50mMβ-疏基乙醇平衡)。該柱先用500ml緩沖液A(20mM三乙醇胺pH7.4;1mMEGTA;1mMEDTA;10mMβ-疏基乙醇)洗滌，然后用1000ml含20mMNaCl的緩沖液A洗滌。用500ml含90mMNaCl的緩沖液A洗脫PKC。洗脫物中加入NaCl至最終濃度為1M，然后將此混合物加入苯基-Sepharose(瓊脂糖)柱中〔柱床體積50ml，用含1MNaCl的緩沖液B(20mM三乙醇胺pH7.4;2mMEGTA;2mMEDTA;1mM二硫赤鮮糖醇)平衡〕。用500ml含1MNaCl的緩沖液B洗滌柱，然后用250ml含濃度梯度為1M至0M的NaCl的緩沖液B進行梯度洗脫。合并含PKC的部分，加入甘油(最終濃度為10%v/v)再將此溶液加入魚精蛋白-瓊脂糖柱中(柱床體積10ml，用含0.1MNaCl及10%(v/v)甘油的緩沖液B平衡)。用40ml平衡緩沖液洗滌柱，然后用120ml含濃度梯度為0.1M至1.5M的NaCl及10%(v/v)甘油的緩沖液B進行梯度洗脫。合并含有純化的PKC部分，并對緩沖液B、甘油(最終濃度為10%v/v)透析，然后加入TritonX100，將該溶液在液氮中凍結，并分成若干等份在-70℃下儲存。用此方法所得之PKC的純度至少達到95%的SDS凝膠電泳純，同時比活為每分鐘每毫克轉移2-3個微摩爾磷酸酯。
C)PKC活力測定α)PKC的活力按Roskoski的方法(R.Roskoski(1983)Methods Enzymol.99，3-6)測定。反應混合物含20mM三乙醇胺pH7.4;4mM乙酸鎂;0.4mg/ml組蛋白IIIS，50mM β-疏基乙醇，20μM ATP其中含有痕量γ-32P-標記的ATP(比活為2-10×106CPm/nmol);1-100nM PKC，在激發(fā)的情況下，還含有0.1mg/ml磷脂酰絲氨酸(多泡狀)以及1μg/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。游離鈣用Ca/EGTA緩沖液調至0.1-100μmol。
β)另一種可用的方法反應混合物含有50mM HEPES(NN-羥乙基哌嗪乙烷磺酸)緩沖液pH7.4;10mM氯化鎂;1mMEGTA;2mM二硫赤鮮糖醇，0.1mg/ml組蛋白IIIS，10μmγ-32P-ATP(比活10-20×107cpm/nmol);1-100nM PKC，在激發(fā)情況下，還含有0.05mg/ml多孔狀磷脂酰絲氨酸以及0.1mM游離鈣。
正常情況下是加入標記的ATP使反應開始，但在動力學試驗情況下是加入PKC使反應開始的。根據實驗情況，在30℃下，反應時間為0.5至10分鐘之間，最好為1分鐘。反應混合物體積為40至100μl，最好為80μl，可根據實驗而定。定量測定按以下方法進行，在一定時間后用移管吸取一整份(30或40μl)反應混合物至磷酸纖維素上(p81，Whatmcm)，洗滌該磷酸纖維素(用0.05%磷酸洗三次)，然后在β-計數器內根據契倫科夫發(fā)射法測定結合的磷酸化組蛋白的放射性。另一種方法是用2%(W/V)SDS終止反應，并按Laemmli的方法(U.K.Laemmli(1970)Nature227，680-685)進行凝膠電泳。在凝膠干燥并經放射性自顯影后，用激光光密度分析儀定量測定其發(fā)黑度。
d)需cAMP(環(huán)腺苷-磷酸)的蛋白激酶的活力測定需cAMP蛋白激酶的催化亞基的活力采用Roskoski的方法(Roskoski，R.(1983)MethodsEnzymol993-6)來測定。
e)抑制的專一性

圖1表明EDTA抑制CCPKⅡ時，其1/2最大濃度為2μM，抑制PKC時，其1/2最大濃度為400μM。EDTA抑制需cAMP的蛋白激酶的催化亞基時，其1/2最大濃度為10mM。
10mM的抑制濃度，如從需cAMP的蛋白激酶所見，相當于所有測定中所存在的鎂離子濃度。鎂離子與EDTA完全絡合即對所有需鎂-ATP過程產生非專一的抑制。
然而，EDTA對CCPKⅡ和PKC的抑制一定是基于一種與上述非專一抑制不同的機制，因為在此情況下，所存在的游離鎂離子濃度仍為10mM。
1mM的游離鈣離子濃度在CCPKⅡ及PKC的測定中同樣明顯高于EDTA的1/2最大抑制濃度值，因此，也排除了鈣離子絡合的抑制機制。
權利要求
1.二乙胺四乙酸(EDTA)或其類似物作為需鈣/調鈣蛋白的蛋白激酶Ⅱ或蛋白激酶C的抑制劑的應用。
2.根據權利要求1中所述的用途，用于治療心血管失調、中樞神經系統疾病、炎癥、癌癥及病毒感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及到EDTA或其類似物作為需鈣/調鈣蛋白的蛋白激酶II或蛋白激酶C的抑制劑的應用。
文檔編號A61P35/00GK1042545SQ8910845
公開日1990年5月30日 申請日期1989年11月9日 優(yōu)先權日1988年11月10日
發(fā)明者弗迪南德·赫喬, 艾麗斯·普賴比萊, 沃納·施伯勤, 多米尼克·特利皮爾, 赫伯特·科格拉爾 申請人:赫徹斯特股份公司