專利名稱：大腸桿菌疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種保護(hù)個(gè)體免受大腸桿菌(E.Coli)感染的疫苗，在該疫苗中使用的一種毒素以及該毒素純化的方法。
大腸桿菌(E.Coli)是一種普遍存在的細(xì)菌，它們?nèi)杭诖蠖鄶?shù)動(dòng)物的消化道。通常，這種菌的繁殖不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的反作用，在大多數(shù)情況下，該細(xì)菌起著對(duì)寄主有利的作用。但是，大腸桿菌(E.Coli)偶爾也引起嚴(yán)重的疾病，尤其是在年幼動(dòng)物。這種情況在鳥(niǎo)類和商業(yè)上進(jìn)行的家禽繁殖中也會(huì)出現(xiàn)。感染后引起傳染病，導(dǎo)致嚴(yán)重的弱質(zhì)病或年幼鳥(niǎo)類的大批死亡。
自然，已經(jīng)嘗試過(guò)用接種方法控制E.Coli感染家禽。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，已用菌苗(失活的大腸桿菌)接種成年雞(Avian Disease 29(4)，1108-17(1985))。菌苗的缺點(diǎn)是伴隨有嚴(yán)重副作用。再者，菌苗接種后開(kāi)始時(shí)產(chǎn)生抗脂多糖的抗體，該抗體僅對(duì)E.Coli O血清型有特異性，因而不能保護(hù)個(gè)體免受其它血清型的E.Coli的感染。
另外，常使用以E.Coli菌的繖毛為基礎(chǔ)的疫苗抵抗該菌的感染。但是，這些疫苗僅產(chǎn)生有限的保護(hù)作用，受保護(hù)的個(gè)體數(shù)不超過(guò)接種個(gè)體的80%，基于這個(gè)原因，大腸桿菌疫苗常包含另外一種毒性因子成份失活的E.Coli毒素。
許多種類的E.Coli含有對(duì)菌體游動(dòng)起作用的鞭毛，以前由于沒(méi)有認(rèn)識(shí)到E.Coli的鞭毛可作為一種毒性因子，因而沒(méi)有用于E.Coli疫苗中。
根據(jù)本發(fā)明，業(yè)已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌鞭毛與對(duì)Vero細(xì)胞的極強(qiáng)毒性有關(guān)(這種相關(guān)性至今沒(méi)有被認(rèn)識(shí))，且這些鞭毛蛋白毒素是一個(gè)重要的毒性因子。
基于上述發(fā)現(xiàn)，已制備出源于E.Coli鞭毛的疫苗。根據(jù)本發(fā)明所述，可利用E.Coli的完整鞭毛，也可以是所說(shuō)鞭毛的亞結(jié)構(gòu)單位，如鞭毛蛋白或鞭毛蛋白片段或集合體，它們能保護(hù)接種個(gè)體免受E.Coli感染。
在用大量E.Coli菌株進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中(這些菌株主要是從雞也包括從其它動(dòng)物和人體中分離到的)，發(fā)現(xiàn)鞭毛與對(duì)Vero細(xì)胞的毒性有關(guān)。這種毒性能被該鞭毛的抗體中和。經(jīng)進(jìn)一步證明發(fā)現(xiàn)，用于研究的所有E.Coli菌株的鞭毛毒性可被一種菌株的鞭毛的單一抗血清所中和。
基于這一發(fā)現(xiàn)，期望能用來(lái)自于單一E.Coli菌株的鞭毛接種個(gè)體而使之免受所有具有鞭毛的E.Coli菌株的感染。
基于上述考慮，本發(fā)明所述的疫苗是以在E.Coli中發(fā)現(xiàn)的一類新毒素為基礎(chǔ)的，其特征是它們具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)，且存在于鞭毛中和/或與鞭毛相關(guān)聯(lián)，由SDS-PAGE測(cè)得的分子量在30～100KD之間，沒(méi)有結(jié)合糖殘基，對(duì)Vero細(xì)胞和一日齡小雞有毒，在100℃加熱1小時(shí)仍保持毒性。
兼有上述特性使這些新毒素和本領(lǐng)域內(nèi)已知的E.Coli毒素相區(qū)別。
在大量E.Coli菌株中存在有上述的毒素，由于該毒素明顯地存在于鞭毛結(jié)構(gòu)中，本文將此命名為鞭毛毒素(FT)。一般情況，這些鞭毛比正?？櫭?典型繖毛直徑為7nm，最長(zhǎng)長(zhǎng)度為1μm)大得多，最大可達(dá)25nm粗，7μm長(zhǎng)。
根據(jù)實(shí)施例1概述的步驟，本發(fā)明所述的毒素種類之一是從小雞E.Coli CH7(015∶K14∶H10)菌株中分離到的。分離出的CH7-FT以幾種形式存在可以是H10型的天然鞭毛，或是游離毒素，或由游離的毒素重新結(jié)合成的針狀細(xì)絲。除前面介紹的一般特性外，CH7-FT的典型特性是由SDS-PAGE測(cè)得的亞單位的分子量約47KD，等電點(diǎn)PH值約為4.8，NH2-末端的部分氨基酸序列Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(？)-Thr-Gln。(CH7-FT的特性見(jiàn)實(shí)施例2的描述)。
抗CH7-FT的抗血清與用于試驗(yàn)的所有其它E.Coli菌株的FT發(fā)生交叉反應(yīng)(見(jiàn)實(shí)施例3)，因此，CH7-FT的抗血清能用于對(duì)本發(fā)明所述的所有其它FT進(jìn)行定性。再者，制備的單克隆抗體或者是特異性的或者與試驗(yàn)用的所有其它E.Coli菌株的FT發(fā)生交叉反應(yīng)。
本發(fā)明也包括具抗E.Coli感染的免疫活性的疫苗，該疫苗的活性成分是一種本發(fā)明所述的失活的毒素。
該疾苗適當(dāng)?shù)睾兴f(shuō)的毒性鞭毛，通過(guò)在有利于鞭毛形成的條件下培養(yǎng)E.Coli細(xì)菌，從細(xì)菌中分離出鞭毛或不含細(xì)胞的上清液可很容易地獲得這種鞭毛;然后利用超過(guò)濾和/或分子篩色譜法除去上清液中低分子量成分進(jìn)一步純化FT。
在純化過(guò)程中，利用FT與CH7-FT的單克隆抗體的反應(yīng)性監(jiān)測(cè)富含F(xiàn)T的部分。
本發(fā)明所述疫苗還包括能保護(hù)接種個(gè)體免受E.Coli感染的FT的一個(gè)片段。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗中摻入的FT可通過(guò)化學(xué)合成，從E.Coli細(xì)胞培養(yǎng)物中純化或通過(guò)重組DNA技術(shù)得到。
在后一種情況，例如可通過(guò)用誘導(dǎo)出的抗FT的多克隆或單克隆抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)，篩選E.Coli基因組DNA文庫(kù)中含有所說(shuō)核酸序列的各個(gè)克隆而識(shí)別出編碼上述蛋白質(zhì)或其片段的核酸序列。將該核酸序列連接到能進(jìn)行各種表達(dá)的DNA序列上，產(chǎn)生一個(gè)能轉(zhuǎn)化到合適寄主的所謂的重組核酸分子。這樣的雜交DNA分子來(lái)自于，例如質(zhì)粒、噬菌體或病毒核酸序列。寄主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌，也可以是真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的寄主細(xì)胞能產(chǎn)生FT，分離該蛋白質(zhì)，隨后將它摻入本發(fā)明的疫苗中。
在另一個(gè)實(shí)施例中，制備的一種活載體疫苗，含有非病原性微生物，如含有編碼FT基因的病毒或細(xì)菌。
除了FT，本發(fā)明疫苗還可含有一種水介質(zhì)或一種水懸液和/或如為提高活性和/或延長(zhǎng)活性成分壽命而加入的其它成分。這些成分可以是鹽，以及使FT毒性失活而保持免疫特性的試劑(如福爾馬林)，PH緩沖液，乳化劑和增強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑(如礦物油，胞壁酰雙肽，氫氧化鋁，皂苷、聚陰離子和兩親物質(zhì))。
本發(fā)明疫苗用于免疫溫血?jiǎng)游?包括人)，免受E..Coli感染，尤其是用于鳥(niǎo)類抗E.Coli感染。
為達(dá)到上述目的，優(yōu)選方法是將該疫苗通過(guò)非腸胃方法施用于個(gè)體，如通過(guò)皮下或肌肉。以這種方式施用疫苗，使接種后的鳥(niǎo)類獲得主動(dòng)免疫，對(duì)下蛋的鳥(niǎo)類接種后，可使后代獲得被動(dòng)免疫能力。對(duì)下蛋鳥(niǎo)類免疫后，它的體內(nèi)產(chǎn)生的抗體理所當(dāng)然地引入到鳥(niǎo)蛋蛋黃中，隨后，進(jìn)入孵化出的小鳥(niǎo)中。
疫苗組成和接種系統(tǒng)可根據(jù)需要保護(hù)的動(dòng)物類型、動(dòng)物的年齡和體重，需要保護(hù)的時(shí)期，用藥方式，以及期望產(chǎn)生主動(dòng)免疫或借助母體的抗體產(chǎn)生被動(dòng)免疫這些情況而變化。用于家禽非腸胃接種時(shí)，疫苗活性成分的最適有效量大約是10-100μg/劑量。本發(fā)明疫苗也可以和其他適當(dāng)?shù)囊呙缃Y(jié)合使用。
實(shí)施例1E.ColiCH7菌株鞭毛毒素的分離A.鞭毛毒素的制備E.Coli CH7(015∶K14∶H10)菌株在裝有12升含有14%PO2的胰蛋白酶豆湯(B.B.L)的BiostatE發(fā)酵器(Braun)中以100-500rpm變速攪拌培養(yǎng)一夜，在帶有HVLP濾器的Pellicon濾器系統(tǒng)(Millipore)中將培養(yǎng)物濃縮至約1升，將細(xì)菌以10，000rpm(GSA轉(zhuǎn)頭，Sorvall)離心30分鐘，得到的上清液通過(guò)0.45μm濾器過(guò)濾后，加到HVLP濾液中。
將濾液濃縮至大約1升并利用PTTK濾器，用1升0.2mol/升TrisHCl緩沖液洗濃縮物3次。
將大約110-160ml的部分PTTK濃縮物通過(guò)高度為10Cm，面積為154cm2(Amicon model P140×250)，用含有0.1%NaN3作為保存劑，PH＝7.2的50mmol/升磷酸緩沖液(PB)平衡過(guò)的Sepharose 4B-Cl柱(Pharmacia，Uppsala Sweden)后，反復(fù)洗脫。柱子用PB洗脫至記錄儀上的基線為零。
收集含有高分子量分子的第一峰的洗脫物，然后在YM-100超過(guò)濾器(φ62mm Amicon，With Amicon UF model 202)上濃縮到蛋白質(zhì)濃度約為2-3mg/ml，濃縮物在含有0.1%NaN3作為保存劑的5升20mmol/升PH7.5的Tris.Hcl緩沖液中透析兩次。
B游離毒素的制備利用Laemmli的方法(Nature 227，680-4;1970)將濃縮物進(jìn)行制備電泳。將濃縮物在含有20ml甘油，20ml Tris-HCl緩沖液(0.5mol/l，PH6.8)，20ml 10%SDS，5ml 2-巰基乙醇(ME)和2ml0.05%溴酚藍(lán)的樣品緩沖液中以1∶1.67稀釋。
然后，在水中將樣品煮沸5分鐘，冷卻，在16×0.6cm的12%(Acr∶bis＝30∶0.8)制備聚丙烯酰胺平板膠上電泳。典型的樣品負(fù)載量大約是15-23mg蛋白質(zhì)/膠(7.5ml濃縮物和5.0ml樣品緩沖液)。在Protean細(xì)胞模型1423(Bio-Rad，Richmond USA)或模型SE600(Hoefer，San Francisco，USA)上進(jìn)行電泳。當(dāng)前沿物質(zhì)從凝膠中走出后，繼續(xù)在220V進(jìn)行電泳1小時(shí)。從膠上切下寬約1.5-2mm的薄片。
在室溫下用10ml 0.89%Nacl溶液+0.1%NaN3浸提蛋白質(zhì)3小時(shí)，在4℃連續(xù)攪拌過(guò)夜。取出薄片，將溶液通過(guò)一個(gè)0.45μ的濾器過(guò)濾。收集含有純毒素亞單位的部分，貯存于-20℃。
用改良Folin-Ciocalteu分析方法(J.Biol.Chem.73，627;1927)，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量，根據(jù)Dubois利用的苯酚硫酸酯分析方法(Anal.Chem.28，350-6，1956)測(cè)定多糖量。
實(shí)施例2E.Coli CH7菌株的毒素的特性A.對(duì)一日齡小雞的致死率第一個(gè)實(shí)驗(yàn)是用0.2-0.5ml各種E.coli毒素制劑給一日齡SPF的小雞(GVP，Doorn)進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，將0.5ml毒素制劑靜脈內(nèi)注射到3周齡小雞體內(nèi)。注射后7天記錄死亡數(shù)。
結(jié)果如表1所示，來(lái)自于雞E.Coli菌株CH2和CH7的毒素制劑通過(guò)腹膜內(nèi)注射后能使一日齡小雞死亡對(duì)于CH7菌株，不論是它的上清液或胞溶物都有毒，而對(duì)于CH2菌株，胞溶物尤其有毒性。
表1一日齡小雞的致死率腹膜注射E.Coli菌株的上清液或胞溶物
＊菌株CH2和CH7是從雞中分離出的E.Coli菌株;
菌株ZF24是來(lái)自人糞的無(wú)毒E.Coli分離株。
用同樣試劑靜脈注射3周齡小雞完全沒(méi)有作用(數(shù)據(jù)未列出)。
B.Vero試驗(yàn)在5%CO2氣體和補(bǔ)充有5%胎牛血清(FCS)和200μ/ml青霉素和200μg/ml鏈霉素，過(guò)濾除菌后再補(bǔ)充2μg/ml兩性霉素B的基質(zhì)6(每升含有85mlMEM Eagle，100ml胰蛋白
磷酸鹽肉湯，50ml4.4%NaHCO3)中37℃培養(yǎng)Vero細(xì)胞，胰蛋白酶作用后，以在每孔中加入200μl含有2×105個(gè)細(xì)胞/升的完全培養(yǎng)基6，而將細(xì)胞接種于96孔的平底聚苯乙烯培養(yǎng)平板(Greiner)。培養(yǎng)一夜后形成單層細(xì)胞。移走培養(yǎng)基，加入200μl/孔不含F(xiàn)CS但補(bǔ)充了10μg/ml黃嘌呤(3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤，Sigma)的培養(yǎng)基6。隨后，每孔中加入20μl系列稀釋毒素制劑。培養(yǎng)5天后記錄細(xì)胞病理學(xué)作用(CPE)。
篩選產(chǎn)毒菌株的試驗(yàn)，首先在每孔中加入20μl未稀釋或稀釋了1∶2的上清液。其次，對(duì)于在Vero試驗(yàn)中上清液顯示陰性的菌株，將該菌株的50μl未稀釋或1∶2稀釋的溶菌物加入每孔中，測(cè)定這些菌株產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)毒素。
結(jié)果首先將列于表2的菌株進(jìn)行產(chǎn)毒試驗(yàn)。其中一些菌株分泌毒素于上清液中，其他菌株產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)毒素和/或具有用超聲波破碎細(xì)胞后才能檢測(cè)到的毒素。對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞病理學(xué)影響的測(cè)定值是近似的，且有不同程度的波動(dòng)。但在大多數(shù)情況下，細(xì)胞單層仍保持完整。
表2不同E.Coli菌株對(duì)Vero細(xì)胞的毒性
＊JA221是一個(gè)E.Coli K-12菌株;ZF24見(jiàn)表1;CH菌株是雞中分離出的菌株。
＊＊毒素效價(jià)定義為具毒性作用的最后稀釋度的倒數(shù)值。
C.毒素的穩(wěn)定性通過(guò)測(cè)定毒素制劑對(duì)各種處理的敏感度，對(duì)已識(shí)別的毒素進(jìn)行初步定性。pH敏感度試驗(yàn)是將毒素PH值調(diào)至3-10，在室溫下培養(yǎng)一夜后中和，然后進(jìn)行毒性試驗(yàn)。
對(duì)熱敏感性試驗(yàn)，是將毒素制劑在各種溫度下加熱進(jìn)行的。SDS和ME對(duì)毒素的影響的測(cè)定是分別在1%SDS和1%SDS+2.5%ME存在時(shí)加熱毒素，然后在鹽水中透析。對(duì)ureum(尿素)敏感性的試驗(yàn)，是將6M ureum加入到毒素制劑中1小時(shí)后，在鹽水中透析。
對(duì)福爾馬林的敏感度試驗(yàn)是將不同濃度的福爾馬林加到毒素制劑中，在不同溫度培養(yǎng)一夜，透析，用Vero細(xì)胞分析試驗(yàn)進(jìn)行毒性測(cè)定。胰蛋白酶敏感度試驗(yàn)是加入100μg/ml胰蛋白酶(來(lái)自牛胰，Millipore)，在37℃培養(yǎng)4小時(shí)，然后加入150μg/ml胰蛋白酶抑制劑(黃豆，Sigma)在37℃抑制30分鐘，再進(jìn)行毒性試驗(yàn)。
結(jié)果在對(duì)Vero細(xì)胞的毒性試驗(yàn)中，由于不同齡的Vero細(xì)胞的狀況不同，不能重復(fù)地測(cè)得精確的雞毒素效價(jià)。這里列出的結(jié)果僅證明典型實(shí)驗(yàn)的情況。
將CH5和CH7的上清液PH值調(diào)至3到10(包括10)時(shí)毒性不受影響，毒素效價(jià)是不變的值分別是32-64和128-256。
對(duì)熱敏感性和對(duì)SDS或SDS+ME處理的敏感性顯示在表3中。
在長(zhǎng)時(shí)間置于較高溫度下，CH2胞溶物(Lys)和CH5以及CH7上清液(Sup)的毒性稍有下降，在120℃加熱后，毒性完全消失，但仍認(rèn)為該毒素具相對(duì)熱穩(wěn)定性。在SDS或SDS+ME存在時(shí)，加熱10分鐘對(duì)CH5和CH7上清液的毒性沒(méi)有影響。
用6M ureum處理后CH2胞溶物和CH5、CH7上清液對(duì)各個(gè)的VT效價(jià)絲毫沒(méi)有影響。
如表4所示，在室溫和37℃時(shí)加入福爾馬林能使CH7上清液毒性消失。
用胰蛋白酶處理后，CH5和CH7上清液毒性完全消失，假處理和單獨(dú)用胰蛋白酶抑制劑處理后，對(duì)毒性沒(méi)有絲毫影響。
D分子量測(cè)定利用Laemmli的方法在12%凝膠(AcrBis 300.8)進(jìn)行分析凝膠電冰后，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比，決定CH7菌株毒素的分子量。
用考馬斯亮蘭(CBB)染色凝膠，利用凝膠掃描器CS-930型和DR-2記錄儀(Shimadzu，Kyoto Japan)進(jìn)行掃描。


圖1表示，載有分子量標(biāo)記物的凝膠電冰后，用考馬斯亮蘭染色后的掃描圖。與1-6個(gè)峰相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分子量分別是78000，66000，45000，30000，17200和12300dal(LKB1860-12 Bromma，Sweden)。
圖2和圖3分別表示從實(shí)施例1的步驟A和步驟B得到的產(chǎn)品的掃描圖。
在這些實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的E.ColiCH7菌株的毒素亞單位的分子量約為47KD。
E.等電點(diǎn)測(cè)定毒素等電點(diǎn)的測(cè)定是將從實(shí)施例1步驟A得到的3ml E.ColiCH7菌株毒素與PH3-7的0.5ml Servalytes(分析純級(jí)，Hei delberg Germany)和46.5ml水的混合物在12W振動(dòng)5小時(shí)(Rotofor，Bio-Rad Richmond USA)進(jìn)行等電聚焦。分析凝膠電泳結(jié)果測(cè)定毒素含量。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果概括于表5中從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，E.ColiCH7菌株的毒素的等電點(diǎn)pH值為4.8。
結(jié)果
F.糖含量從實(shí)施例1步驟B得到的E.ColiCH7菌株的毒素既不含多糖也沒(méi)有用Dubois等的苯酚硫酸酯分析(Analytical Chemistry 28，350-356;1956)測(cè)得的糖存在。在LimulusAmoebocyte(鱟變形細(xì)胞)溶解物試驗(yàn)(Pyrotell，MA，USA)中沒(méi)有檢測(cè)到有效的LPS(內(nèi)毒素)活性。
G氨基酸分析利用Chang的液相DABITC方法(Methods Enzymology 91，455-466;1983)測(cè)定N-末端氨基酸序列。利用薄層層析法識(shí)別DABTH-氨基酸。用Janssen等人描述的PTC技術(shù)(Chromatographia 22，345-358;1986)測(cè)定氨基酸組成，假定亞單位分子量為47KD的CH7-FT相對(duì)應(yīng)的氨基酸總數(shù)為446個(gè)。
結(jié)果從實(shí)施例1步驟A和步驟B得到的E.ColiCH7菌株的毒素的N末端氨基酸序列如下Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(？)-Thr-Gln該序列與Kuwajima等(Journal of Bacteriology 168，1479-1483;1986)描述的E.Coli K-12鞭毛蛋白的N末端氨基酸序列相同。
表6顯示毒素的氨基酸組成，也表示與E.Coli K-12鞭毛蛋白具有很大程度的同源性。
表6CH7-FT氨基酸組成的測(cè)定和與E.Coli K-12鞭毛蛋白的氨基酸組成的比較每個(gè)亞單位的氨基酸數(shù)目(%)
KPTC方法測(cè)定(Chromatographia 22，345-358;1986)2DNA序列分析法測(cè)定(Journal of Bocteriology 168 1479-1483;1986)
實(shí)施例3篩選FT表達(dá)型雞E.Coli菌株和FT血清學(xué)特征檢測(cè)來(lái)自于世界各地的總計(jì)為124個(gè)雞E.Coli分離菌的毒性、游動(dòng)性和細(xì)菌表面FT抗原的表達(dá)，用多克隆和單克隆抗體顯現(xiàn)FT且研究交叉反應(yīng)。
方法毒性試驗(yàn)和毒素中和作用如實(shí)施例2B描述的方法，測(cè)定各菌株對(duì)Vero細(xì)胞的毒性。中和作用試驗(yàn)，是將毒素制劑與稀釋后的抗血清在37℃一起培養(yǎng)2小時(shí)，然后進(jìn)行毒性試驗(yàn)。
游動(dòng)性試驗(yàn)在含有低瓊脂濃度(0.25%)的營(yíng)養(yǎng)肉湯的U形試管中測(cè)定菌株的游動(dòng)性。在這些U形管一端接種一個(gè)E.Coli菌株，37℃培養(yǎng)一夜后，記錄菌株向試管另一端的遷移情況。
抗血清的制備根據(jù)實(shí)施例1A描述的方法，在兔和雞中制備抗E.ColiCH7菌株的FT的抗血清。用按實(shí)施例1B中描述的方法制得的CH5和CH7菌株毒素生產(chǎn)單克隆抗體(MoAb)。在制備MoAb時(shí)，將來(lái)自于免疫鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，用ELISA方法，從得到的雜交瘤中分離出抗毒素抗體分泌物。將克隆后的雜交瘤由腹膜內(nèi)注射到鼠體，取出腹水液，在56℃加熱10分鐘使腹水失活后，用1，1，2-三氯三氟乙烷(Merck)萃取脂類，用50%飽和度的硫酸銨沉淀MoAbs。
E.Coli菌株的FT抗原表達(dá)在室溫下用無(wú)毒E.Coli RDEC-1(O15K14)菌株吸附CH7菌株(O15K14H10)FT的兔抗血清24小時(shí)，根據(jù)下面進(jìn)行的完整細(xì)菌ELISA方法，用這些吸附的抗血清篩選表達(dá)FT的菌株。
將細(xì)菌在TSB中不攪拌培養(yǎng)6小時(shí)，然后3000rpm離心15分鐘(Sorvall RT6000)再懸浮于CBB緩沖液(1.59g/l Na2CO3，2.93g/l NaHCO3;0.2g/l NaN3，pH9.6)，達(dá)到在660nm處OD值為0.140-0.180。將該細(xì)菌懸液以每孔100μl的濃度接種于平底聚苯乙烯微滴平板，在50℃干燥一夜。用自來(lái)水沖洗平板，在室溫下，在每孔中加入100μlPBS-T-N(0.04M PBS;PH7.2;0.5%Tween80;15%新生牛的血清)阻遏1小時(shí)。隨后，每孔中加入100μl系列稀釋的吸附過(guò)的血清(在PBS-T-N中稀釋，起始稀釋度為1100)，每個(gè)菌株設(shè)置加入PBS-T-N的2個(gè)孔作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，洗滌平板，每孔中加入100μl在PBS-T-N中適當(dāng)稀釋的過(guò)氧化物酶結(jié)合的羊抗兔IgG(H+L)，37℃培養(yǎng)30分鐘后，再次洗滌平板。所結(jié)合的抗體通過(guò)在每孔中加入100μl含有脲過(guò)氧化氫(Ureum Peroxide)(Organon Teknika，Oss)和溶于NaAc-檸檬酸緩沖液(PH5.5)的3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺的TMB底物緩沖液，然后用比色法測(cè)定。在黑暗中放置10分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)，加入50μl4N H2SO4中止反應(yīng)，用Microelisa讀數(shù)器在450nm處測(cè)定，測(cè)得的最高稀釋度為抗血清的效價(jià)，此時(shí)A450值至少是空白A450的2倍。
在每一個(gè)試驗(yàn)中，CH7和RDEC-1菌株分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
Western吸印試驗(yàn)基本上按照Muilerman等(Anal.Biochem.120，46-51;1982)描述的方法，進(jìn)行免疫吸印和Western吸印試驗(yàn)。將細(xì)菌在胰蛋白酶豆湯中攪拌培養(yǎng)6小時(shí)，制備菌體的FT粗制品。在充分混合后，離心移走菌體，通過(guò)乙醇測(cè)定法將上清液濃縮約40倍(1份上清液+2份96%乙醇，4℃培養(yǎng)過(guò)夜，離心后，將沉淀溶于0.04mol/升PBS，PH7.2)，得到的FT粗制品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)吸到硝酸纖維濾膜上，通過(guò)與抗體，過(guò)氧化物酶結(jié)合的適當(dāng)種類的抗IgG(H+L)以及脲過(guò)氧化氫和3，3′-二氨基聯(lián)苯胺.4HCl一起連續(xù)培養(yǎng)后，檢測(cè)抗原。
Immunogold-電子顯微術(shù)(IG-EN)基本上按照Alphen等(Infect.Immun.56，1800-6;1988)描述的方法進(jìn)行IG-EM試驗(yàn)，簡(jiǎn)單地說(shuō)，在胰蛋白酶豆湯中生長(zhǎng)的細(xì)菌與在PBS+1%BSA+0.05%Tween20(PBS-B-T)稀釋的抗體一起培養(yǎng)，用PBS洗三次，然后與用金顆粒標(biāo)記的蛋白質(zhì)A一起在PBS-B-T中培養(yǎng)，用PBS再洗三次后，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到聚乙烯醇縮甲醛樹(shù)脂包裹的網(wǎng)格中，用1%乙酸雙氧鈾或磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染色。
結(jié)果從世界各地收集的124個(gè)雞E.Coli菌株中，73個(gè)菌株(占59%)能分泌對(duì)Vero細(xì)胞有毒性的可檢測(cè)量的毒素活性成分。另有37個(gè)菌株(占30%)在細(xì)菌細(xì)胞溶解后對(duì)Vero細(xì)胞有毒。在完整細(xì)菌ELISA試驗(yàn)中，52個(gè)菌株(占42%)與CH7-FT的抗血清反應(yīng)，在ELISA試驗(yàn)中顯示陽(yáng)性的所有菌株也產(chǎn)生胞外Vero毒素(表7)。
在Vero毒素的分泌和菌株游動(dòng)性之間具強(qiáng)烈相關(guān)性(見(jiàn)表8)。
上述結(jié)果進(jìn)一步證明Vero毒性存在于鞭毛中，也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)過(guò)U形管遷移后提高了Vero毒性。上述結(jié)果也表明不同菌株的毒素具血清學(xué)交叉反應(yīng)。
進(jìn)一步研究不同菌株毒素的交叉反應(yīng)。表9中顯示菌株CH7的FT兔和雞抗血清能中和試驗(yàn)的所有其它有毒菌株的Vero毒性。抗菌株CH5和CH7FT的MoAbs絲毫不中和該毒性。
表10顯示FT粗制品與不同抗血清的Western吸印試驗(yàn)結(jié)果。CH7-FT的兔和雞抗血清(分別是K07577和BB1-2)與所有試驗(yàn)中其余FT制劑反應(yīng)，雖然這些菌株的譜帶分子量不同。利用抗H10鞭毛凝集抗血清能得到同樣結(jié)果。CH5-FT的MoAb Int12-13在Western吸印反應(yīng)中也顯示相同型式。CH7-FT的MoAb Int1-7僅與47KD的CH7-FT譜帶反應(yīng)。顯然，與各種具H型鞭毛菌株相應(yīng)的鞭毛蛋白的分子量幾乎與各自的FTs的表觀分子量相一致。許多帶H10型鞭毛的菌株，來(lái)自于RIVM(Bilthoven)，在用多克隆抗血清進(jìn)行的Western吸印試驗(yàn)中顯示有45KD或47KD的譜帶。MoAb Int1-7僅與H10型鞭毛菌株的47KD譜帶反應(yīng)。當(dāng)將菌株先經(jīng)過(guò)U形管遷移，再制備的FT粗制品，用于Western吸印試驗(yàn)中能提高出現(xiàn)的譜帶強(qiáng)度。
在IG-EM試驗(yàn)中，利用CH7-FT的多克隆抗血清，將CH5和CH7菌株的類鞭毛絲狀體用金顆粒標(biāo)記。用CH7-FT的MoAb Int1-7進(jìn)行的同樣試驗(yàn)中，只有CH7菌株的類鞭毛絲狀體能用金顆粒標(biāo)記，而不能標(biāo)記CH5菌株的此類鞭毛。利用實(shí)施例1B描述的制備SDS-PAGE制備CH5-FT的MoAb Int12-13進(jìn)行IG-ME試驗(yàn)時(shí)，不能有效地標(biāo)記類鞭毛絲狀體，僅在CH5和CH7菌株細(xì)胞表面能觀察到這樣的金顆粒。事實(shí)上，MoAb Int12-13僅與離解的FT反應(yīng)(Western吸印試驗(yàn)，ELISA)而不與完整FT反應(yīng)(IG-EM，ELISA)。
所有這些結(jié)果表明Vero毒性存在于鞭毛中，或者FT與鞭毛完全相同。再者，不同菌株的FTs具有血清學(xué)上的高度交叉反應(yīng)性和交叉中和作用。
實(shí)施例4通過(guò)被動(dòng)免疫對(duì)小雞的保護(hù)作用用按實(shí)施例1A描述的方法制得的CH7-FT接種小雞制備CH7-FT的抗血清。收集來(lái)自于不同雞的抗血清，在56℃加熱10分鐘使之失活。
用1ml上述CH7-FT抗血清靜脈注射三周齡小雞(Euribrid，Boxmeer，The Netherlands)。在抗血清注入小雞后1小時(shí)內(nèi)，將0.2ml細(xì)菌懸液注射入右后胸氣囊中使雞感染。細(xì)菌在血瓊脂基質(zhì)平板(Oxoid)上培養(yǎng)一夜后，懸浮于PBS中，稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?。?shí)驗(yàn)所用的E.Coli菌株全是從患有大腸桿菌病的雞的感染心臟中分離到的。用同樣劑量的細(xì)菌感染作為對(duì)照的雞，該對(duì)照用的雞沒(méi)有施用抗血清或僅注射陰性對(duì)照血清，在雞中注入抗原激發(fā)(免疫應(yīng)答)后，將它們安置于有一般食物和水的減壓隔離器中。接種后7天，記錄死亡率。
如表11所示，由CH7-FT抗血清給雞帶來(lái)的被動(dòng)免疫作用能有效地保護(hù)雞免受由5個(gè)試驗(yàn)的E.Coli菌株中的3個(gè)菌株進(jìn)行的免疫激發(fā)。三個(gè)菌株對(duì)雞的感染由于抗血清的有效保護(hù)作用而受阻，該三個(gè)菌株中的2個(gè)菌株在培養(yǎng)上清液中分泌毒性，一個(gè)菌株對(duì)Vero細(xì)胞的毒性僅在于細(xì)菌溶胞物中。也可看到二個(gè)菌株對(duì)雞的感染不能被抗血清有效地保護(hù)，這兩菌株的毒性都只存在于細(xì)菌溶胞物中。顯然，抗血清僅對(duì)游動(dòng)菌株的感染能提供有效保護(hù)。
權(quán)利要求
1.保護(hù)個(gè)體免受E·Co1i感染的疫苗，其特征在于它來(lái)源于E·Co1i的鞭毛。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的疫苗，其特征在于其中的鞭毛具有抗Vero細(xì)胞毒性。
3.具有抗E.Coli感染溫血?jiǎng)游锏拿庖呋钚缘亩舅?，其特征在于a)由一條單一多肽鏈組成;b)用SDS-PAGE測(cè)得的分子量為30-100KD;c)以絲狀集合體形式存在和/或與之有關(guān);d)天然狀態(tài)不與糖殘基結(jié)合;e)對(duì)Vero細(xì)胞和一日齡小雞具毒性;f)在100℃加熱1小時(shí)仍保持毒性，或者是該毒素的片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所說(shuō)的毒素，可通過(guò)下列方法從E.Coli血清型H10菌株中得到a.在胰蛋白酶豆湯中培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)菌;b.用截止值為30KD的濾器濃縮培養(yǎng)物的不含細(xì)胞上清液;c.用20mmol/升Tris.HCl緩沖液沖洗濾器上面的物質(zhì);d.將上述洗過(guò)的物質(zhì)在一個(gè)Sepharose4B柱子上分離;e.收集高分子量洗脫物;f.將上述洗脫物在預(yù)制的凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE，或是該毒素的片段。
5.保護(hù)個(gè)體免受大腸桿菌感染的疫苗，其特征在于它來(lái)源于權(quán)利要求3-5所說(shuō)的毒素。
6.保護(hù)個(gè)體免受大腸桿菌感染的疫苗，其特征在于它含有一個(gè)轉(zhuǎn)化的微生物，該轉(zhuǎn)化體能表達(dá)一個(gè)編碼權(quán)利要求3-5的毒素的DNA序列;或是該毒素的片段。
7.純化權(quán)利要求3的毒素的方法，其特征在于利用如超過(guò)濾，離心和/或分子篩色譜法除去上清液中低分子量成分，而純化出與CH7菌株毒素的抗體具反應(yīng)性的E.Coli的不含細(xì)胞的洗脫物，通過(guò)它與所說(shuō)抗體的反應(yīng)性選出含有毒素的部分。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種新穎E·Coli毒素或一種免疫原片段，該毒素或片段能用于制備溫血?jiǎng)游?，尤其是鳥(niǎo)類的疫苗。所說(shuō)毒素存在于粘附在細(xì)菌上的鞭毛結(jié)構(gòu)中，這些鞭毛或游離毒素在失活后，能用于免疫動(dòng)物，使之免受E·Coli感染。
文檔編號(hào)A61K39/02GK1049523SQ90107108
公開(kāi)日1991年2月27日 申請(qǐng)日期1990年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1989年8月18日
發(fā)明者約翰·富朗西斯科·凡·單·博石 申請(qǐng)人:阿克佐公司