專(zhuān)利名稱：用于癌癥治療的新實(shí)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子嵌合體;感染性病毒粒子;其構(gòu)建方法;含有它們的藥物制劑;它們?cè)谥委熒系膽?yīng)用，特別是在病毒指導(dǎo)的酶前藥治療(具體說(shuō)是癌癥的治療，更具體地說(shuō)是肝細(xì)胞癌的治療)上的應(yīng)用;以及可被雜合酶催化成細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物的藥劑(如嘌呤阿拉伯糖苷和取代的嘧啶)在病毒指導(dǎo)的酶前藥治療上的應(yīng)用。
所有的癌癥是全世界的主要病因之一。癌癥化療領(lǐng)域的研究已經(jīng)得到了多種具有不同程度療效的抗腫瘤藥劑。臨床上應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)藥劑包括亞德里亞霉素、放線菌素D、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、順氯氨鉑、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿。但是，已知這些現(xiàn)有的抗腫瘤藥劑有各種缺點(diǎn)，例如對(duì)健康細(xì)胞有毒、某些類(lèi)型的腫瘤產(chǎn)生抗性。其它形式的療法如外科手術(shù)也是已知的。但本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員認(rèn)識(shí)到需要治療腫瘤的新方法和新實(shí)體。
肝細(xì)胞癌(HCC)是當(dāng)今世界主要的惡性疾病之一，其中發(fā)病率最高的是日本、中國(guó)、亞洲的其它地區(qū)和非洲的亞撒哈拉地區(qū)。最近的證據(jù)表明，歐洲和北美的肝細(xì)胞瘤發(fā)病率在上升。估計(jì)這種疾病每年造成高達(dá)大約1，250，000人的死亡，或者這一死亡人數(shù)與該疾病有關(guān)，因而從數(shù)字上看這是世界上主要的惡性疾病之一。
肝細(xì)胞癌的預(yù)后總是很差，遍布世界的發(fā)病率幾乎與死亡率相等。診斷后的平均生存時(shí)間低于四個(gè)月。只偶爾見(jiàn)到長(zhǎng)期生存(定義為診斷后生存一年以上)。大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者或者死于伴隨或不伴隨大量出血的肝衰竭并發(fā)癥，或者死于巨大的腫瘤負(fù)荷的一般作用，這些作用伴有惡病質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)不良、感染和膿毒癥。雖然會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移(高達(dá)90%的患者在死亡時(shí)有轉(zhuǎn)移腫瘤)，但最經(jīng)常限制生存的仍是區(qū)域性疾病。因此，雖然人們會(huì)認(rèn)識(shí)到轉(zhuǎn)移性疾病的治療也具有重要意義，但旨在控制肝腫瘤的治療才是適當(dāng)?shù)?Kew M.C.Postgraduate Medical Journal 59(Suppl.)78-87，1983;Berk.P.(Ed)Seminars in Liver Disease 4(2)，Thieme Stratton Inc.N.Y.N.Y.，1984)。
臨床醫(yī)師現(xiàn)有的療法從整體上說(shuō)并不是這種疾病的有效療法(Nerenstone等，Cancer Treatment Reviews 151-31，1988)。迄今為止，外科手術(shù)一直是唯一的有效療法。但在作出診斷時(shí)，絕大多數(shù)患者不能承受徹底的外科手術(shù)。在某些研究(Nerenstone等，同上)中發(fā)現(xiàn)，能夠承受外科手術(shù)的患者不足3%，并且在這個(gè)很小的百分比中，有大約50%出現(xiàn)術(shù)后病變(Nerenstone等，同上)。
體內(nèi)單一或配伍藥劑化療法和放射療法基本無(wú)效，這更增加了對(duì)治療這種疾病的新途徑和新療法的需求。
基因療法涉及把某些新基因穩(wěn)定地整合到特定的靶細(xì)胞中，并在整合后表達(dá)這些基因，從而改變?cè)撎囟ò屑?xì)胞的表型(綜述見(jiàn)Anderson，W.F.Science 226401-409，1984;McCormick，D.Biotechnology 3690-693，1985)。基團(tuán)療法對(duì)涉及一個(gè)缺陷酶或缺失酶的置換的遺傳病的治療可能是有益的，所述的酶有LeschNyhan病中的次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶;嚴(yán)重免疫缺陷疾病中的嘌呤核苷磷酸化酶;嚴(yán)重綜合免疫缺陷病中的腺苷脫氨酶。但基因療法仍未應(yīng)用于臨床，雖然某些類(lèi)型的基因療法可能很快就要應(yīng)用于某些疾病。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有可能用能夠選擇性地轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物的化學(xué)藥劑，選擇性地抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或?qū)⑵錃⑺?。達(dá)到這一目的方法是構(gòu)建一種分子嵌合體，它包含一個(gè)“靶組織特異性”轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序(TRS)，該順序在靶組織如癌細(xì)胞中被選擇性激活，這便控制了一種雜合酶的表達(dá)。此分子嵌合體可通過(guò)合適的載體進(jìn)行操作并摻入感染性病毒粒子中。給患者施用含有分子嵌合體的感染性病毒粒子后，即在靶細(xì)胞內(nèi)選擇性地表達(dá)出酶。這樣便可就地達(dá)到施用這樣一些化合物的目的，這些化合物能被上述酶選擇性地代謝成某些代謝物，而這些代謝物要么被進(jìn)一步代謝成細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性藥劑，要么實(shí)際上是細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性藥劑。
本發(fā)明是普遍適用的，并將就肝細(xì)胞癌來(lái)說(shuō)明。
如上所述，患有肝細(xì)胞癌的絕大部分患者死于原發(fā)腫瘤。但大約有90%的肝細(xì)胞癌患者在死亡時(shí)有明顯的轉(zhuǎn)移性病變。這些轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)出典型的原發(fā)腫瘤表型，因而這些轉(zhuǎn)移也將選擇性地表達(dá)雜合酶，從而將本文限定的所施用的化合物選擇性地激活為細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物。
可以采用多種酶前藥配伍方式，其前提是該酶能夠直接或通過(guò)一種中間體將所施用的化合物激活為細(xì)胞抑制性或細(xì)胞毒性代謝物。同樣，化合物的選擇將取決于所用的酶系統(tǒng)，但必須被該酶直接或間接地選擇性代謝為細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物。這里所用的術(shù)語(yǔ)雜合酶是指一種表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)倪x擇特性的酶。
水痘帶狀皰疹病毒(VZV)編碼一種特異性的胸苷激酶蛋白。該基因已作了克隆及順序測(cè)定和定性(J.Gen.Virol.671759-1816，1986)。與哺乳動(dòng)物酶不同的是，VZV胸苷激酶能選擇性地使特異的嘌呤阿拉伯糖苷和取代的嘧啶化合物單磷酸化。此外，本發(fā)明人還發(fā)明，某些嘌呤和嘧啶類(lèi)似物，特別是下文限定的式(Ⅰ)和(Ⅱ)的化合物，在經(jīng)過(guò)遺傳修飾而能選擇性地表達(dá)VZV胸苷激酶的特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物。例如，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤轉(zhuǎn)化成9-β-D-呋喃阿拉伯糖基腺嘌呤三磷酸(Ara ATP)。
其它酶前藥配伍包括細(xì)菌(例如假單胞菌)酶羧肽酶G2與前藥對(duì)-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲?；劝彼岬呐湮?。由此化合物上切下谷氨酸部分，釋放出一種有毒的苯甲酸芥子。堿性磷酸酶(例如小牛腸堿性磷酸酶)能將無(wú)活性的磷酸化化合物，例如磷酸鬼臼乙叉苷、磷酸阿霉素、磷酸絲裂霉素，轉(zhuǎn)化成有毒的去磷酸化代謝物。青霉素V酰胺酶能將阿霉素和苯丙氨酸氮芥的苯氧乙酰胺衍生物轉(zhuǎn)化成有毒代謝物，真菌(例如尖鐮孢)胞苷脫氨酶能將5-氟胞苷轉(zhuǎn)化成有毒的5-氟尿嘧啶。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，某些基團(tuán)是普遍表達(dá)的。但大多數(shù)基團(tuán)只在一定時(shí)間內(nèi)或在特定組織內(nèi)表達(dá)，或者在對(duì)細(xì)胞外誘導(dǎo)劑作出響應(yīng)時(shí)被激活，例如，某些基因只在特定細(xì)胞類(lèi)型的個(gè)體發(fā)育中的非常準(zhǔn)確的時(shí)間，或者在對(duì)某些誘導(dǎo)性刺激作出響應(yīng)時(shí)才活潑轉(zhuǎn)錄。這種調(diào)控作用部分地是由轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序(例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控DNA順序)與具有DNA結(jié)合作用的順序特異性蛋白轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用介導(dǎo)的。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有可能改變某些哺乳動(dòng)物組織，例如肝組織或轉(zhuǎn)化的肝組織，使其選擇性地表達(dá)如上所限定的雜合酶，例如VZV胸苷激酶。這可通過(guò)在一個(gè)表達(dá)盒中構(gòu)建分子嵌合體來(lái)實(shí)現(xiàn)。
表達(dá)盒本身在分子生物學(xué)領(lǐng)域是公知的。這樣一種表達(dá)盒將含有為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)雜合酶所需的所有必需DNA順序。例如，優(yōu)選的表達(dá)盒將含有一種分子嵌合體，此嵌合體含有VZV胸苷激酶編碼順序、一個(gè)適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物基因多聚腺苷酸化信號(hào)(即能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)起作用的多聚腺苷酸化信號(hào))、以及正確取向的合適增強(qiáng)子和啟動(dòng)子順序。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，編碼信使RNA的基因的完整而有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通常需要兩個(gè)DNA順序啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。啟動(dòng)子位于緊接轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(5′)處。啟動(dòng)子順序?yàn)闇?zhǔn)確而有效的轉(zhuǎn)錄起始所需。不同的基因特異性啟動(dòng)子具有共同的組織形式。典型的啟動(dòng)子包括一個(gè)稱為T(mén)ATA盒的富含AT區(qū)(位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5′端大約30個(gè)堿基對(duì)處)和一個(gè)或多個(gè)上游啟動(dòng)子成分(UPE)。UPE是與順序特異性細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子相互作用的主要靶子。啟動(dòng)子順序的活性由稱為增強(qiáng)子的其它順序來(lái)調(diào)節(jié)。增強(qiáng)子順序可能與位于上游(5′)或下游(3′)的啟動(dòng)子相距很遠(yuǎn)。因而增強(qiáng)子以取向或位置依賴性方式起作用。但由于具有可互換的相似結(jié)構(gòu)組織和功能，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間的絕對(duì)區(qū)別在某種程度上有隨意性。增強(qiáng)子由啟動(dòng)子順序來(lái)提高轉(zhuǎn)錄速度。多半正是由于順序特異性轉(zhuǎn)錄因子與UPE間的相互作用和增強(qiáng)子順序，才使哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了組織特異性基因表達(dá)。結(jié)合在UPE上的這些蛋白轉(zhuǎn)錄因子(組織特異性反式激活因子)和增強(qiáng)子(起順式作用的調(diào)控順序)的存在，使得轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的其它組分，包括RNA聚合酶，能夠以組織特異性選擇性和準(zhǔn)確性啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。
轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序特別是啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的選擇將取決于靶組織。其實(shí)例包括分別特異于正常肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)化肝細(xì)胞的清蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序(例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子);用于胃腸道、肺、乳房和其它組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的癌胚抗原(CEA)轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序;用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤的酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶或神經(jīng)元特異性烯醇化酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序;用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的膠質(zhì)纖維酸性蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序;用于胰腺腫瘤的胰島素轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序。
其它實(shí)例包括用于某些肝腫瘤的特異于γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序，以及用于某些肺腫瘤的多巴脫羧酶。此外，也可使用來(lái)自某些致癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序，因?yàn)檫@些順序多半在某些類(lèi)型的腫瘤中表達(dá)。其中較好的例子包括在乳房腫瘤中表達(dá)的HER-2/neu致癌基因調(diào)控順序、和特異于成神經(jīng)細(xì)胞瘤的N-myc致癌基因的調(diào)控順序。
ALB和AFP基團(tuán)就核酸順序、基團(tuán)結(jié)構(gòu)、氨基酸順序和蛋白二級(jí)折疊而言具有廣泛的同源性(綜述見(jiàn)Ingram等，PNAS 784694-4698，1981)。在個(gè)體發(fā)育中，這些基因彼此獨(dú)立地但交互地表達(dá)。在正常發(fā)育中，ALB的轉(zhuǎn)錄在出生前不久便起始，并持續(xù)于整個(gè)成年期。成年的ALB轉(zhuǎn)錄表達(dá)僅限于肝臟。AFP通常在胎肝、卵黃囊的內(nèi)臟內(nèi)胚層和胎兒胃腸道中表達(dá)，但在出生后不久就下降至檢測(cè)不出的水平，并且在非病原性或非再生性成年肝臟或其它正常成年組織中表達(dá)不顯著。但是，成人肝臟中的AFP轉(zhuǎn)錄在肝細(xì)胞癌中常常大大增強(qiáng)。此外，在睪丸的非精原細(xì)胞癌和混合癌、內(nèi)胚層竇腫瘤、某些畸胎癌以及某些胃腸腫瘤中，AFP的轉(zhuǎn)錄也會(huì)提高。AFP和ALB的肝特異性表達(dá)是由其基因的調(diào)控順序與存在于肝細(xì)胞核提取液中的反式激活轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用造成的。對(duì)產(chǎn)生在分子水平上結(jié)合的基因的肝細(xì)胞瘤特異性或一般肝特異性表達(dá)來(lái)說(shuō)，分別優(yōu)選AFP和ALB轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序，因?yàn)锳FP和ALB基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)控，并且其mRNA屬于肝臟中最豐富的聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄本。
有幾種哺乳動(dòng)物ALB和AFP啟動(dòng)子和增強(qiáng)子順序已得到了鑒定(綜述見(jiàn)Genes and Develop.1268-276，1987;Science 23553-58，1987;The Journal of Biol.Chem.2624812-4818，1987)。這些順序分別使肝細(xì)胞(正常的和轉(zhuǎn)化的)和肝細(xì)胞瘤中的基因得以選擇性地和特異性地表達(dá)。
例如，如表1所示，有一個(gè)哺乳動(dòng)物ALB啟動(dòng)子包含在位于清蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5′端的300bp片段中。包含在距鼠清蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5′端300bp與8，500bp之間的順序，對(duì)肝特異性表達(dá)來(lái)說(shuō)是非必需的。但有一個(gè)肝特異性增強(qiáng)子順序包含在一個(gè)位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5′端8，500bp至10，400bp的片段內(nèi)(圖1A)。如果有了ALB啟動(dòng)子和增強(qiáng)子成分，便可實(shí)現(xiàn)位于正確3′取向的雜合結(jié)構(gòu)基因的肝特異性表達(dá)(圖1B)。如果去掉位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5′端300bp和8，500bp之間的非必需插入順序，則相對(duì)于ALB啟動(dòng)子和增強(qiáng)子順序位于正確取向的3′雜合結(jié)構(gòu)基因仍維持肝特異性表達(dá)(圖1C)。非必需順序的去除用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而得到可用來(lái)直接進(jìn)行VZV胸苷激酶的肝特異性表達(dá)的分子嵌合體。
與ALB基團(tuán)的調(diào)控結(jié)構(gòu)相似，AFP基因的調(diào)控成分在某些肝臟病理現(xiàn)象(如肝細(xì)胞癌)中促進(jìn)AFP的組織特異性表達(dá)(Mol.Cel.Biol.6477-487，1986;Science 23553-58，1987)。哺乳動(dòng)物AFP基因的調(diào)控成分由一個(gè)特異的5′啟動(dòng)子鄰接區(qū)(在某些哺乳動(dòng)物中位于距該基因5′端85和52bp之間)組成。此順序?qū)τ谠诟渭?xì)胞瘤中轉(zhuǎn)錄是必需的。此外，還有一些對(duì)鼠AFP基因非常確定的上游(5′)調(diào)控成分，其行為與經(jīng)典增強(qiáng)子相同(Mol.Cel.Biol.6477-487，1986;Science 23553-58，1987)。這些上游調(diào)控成分定名為成分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，它們位于距鼠AFP基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5′端1，000至7，600bp之間。這三個(gè)增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域在產(chǎn)生AFP的組織特異性表達(dá)時(shí)，在功能上并不等價(jià)。成分Ⅰ和Ⅱ直接進(jìn)行AFP肝特異性表達(dá)的能力最強(qiáng)。應(yīng)該注意的是，甲胎蛋白基因的調(diào)控順序不僅有利地含有可供組織特異性轉(zhuǎn)錄激活的順序，而且有利地含有可供在不該表達(dá)AFP的組織內(nèi)阻遏表達(dá)的順序。人甲胎蛋白基因的調(diào)控區(qū)也已經(jīng)以類(lèi)似的方式被定性(J.B.C.2624812，1987)。在胎肝、肝細(xì)胞瘤、睪丸非精原細(xì)胞癌、某些畸胎癌、某些胃腸腫瘤、以及特異表達(dá)AFP的其它正常和病理組織中，對(duì)AFP調(diào)控順序處于正確取向的結(jié)構(gòu)基因?qū)⑹乖摻Y(jié)構(gòu)基因得以選擇性地表達(dá)。
本發(fā)明提供一種分子嵌合體，該嵌合體包含一個(gè)DNA順序，該順序含有在一個(gè)表達(dá)盒中處于轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序控制下的雜合基因編碼順序;能夠選擇性地在靶癌細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，例如能夠轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞而使其選擇性地表達(dá)VZV胸苷激酶的啟動(dòng)子。
本發(fā)明還在一個(gè)優(yōu)選具體方案中提供一種分子嵌合體，它包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序，特別是一個(gè)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠選擇性地在哺乳動(dòng)物靶組織中被激活，并與VZV胸苷激酶基因編碼順序有效連接。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種分子嵌合體，它包含酶(最好是VZV胸苷激酶)基因DNA編碼順序(包括適當(dāng)?shù)亩嗑巯佘账峄樞?，該順序以3′位以正確的取向與一個(gè)哺乳動(dòng)物靶組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序相連。該表達(dá)盒最好還含有一個(gè)增強(qiáng)子順序。
啟動(dòng)子和增強(qiáng)子順序最好選自下列基因之一的轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序清蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素或γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶、多巴脫羧酶、HER2/neu或N-myc致癌基因，或其它合適的基因。最好分別用ALB或AFB的調(diào)控順序來(lái)直接進(jìn)行肝特異性或肝細(xì)胞瘤特異性表達(dá)。
本發(fā)明的分子嵌合體可以利用標(biāo)準(zhǔn)的DNA重組技術(shù)來(lái)制備。例如，將VZV胸苷激酶基因(見(jiàn)圖2A和2B)的編碼順序和多聚腺苷酸化信號(hào)置于相對(duì)于必需的ALB和AFP轉(zhuǎn)錄調(diào)控成分正確的3′取向。這些分子嵌合體使VZV胸苷激酶得以分別在正常表達(dá)ALB或AFP的細(xì)胞中選擇性表達(dá)(圖3A和3B)。在哺乳動(dòng)物肝臟、肝細(xì)胞瘤、某些胃腸道腫瘤、睪丸非精原細(xì)胞癌、某些畸胎癌和其它腫瘤中，VZV胸苷激酶基因的表達(dá)將使這里限定的相對(duì)無(wú)毒的阿拉伯糖苷和嘧啶類(lèi)能夠選擇性地代謝成細(xì)胞毒性和/或細(xì)胞抑制性代謝物。
因此，本發(fā)明的第二方面提供一種構(gòu)建分子嵌合體的方法，該方法包括將編碼雜合酶(如VZV胸苷激酶)基因的DNA順序與一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子相連接。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種構(gòu)建這里限定的分子嵌合體的方法，該方法包括，將一個(gè)編碼雜合酶(例如VZV胸苷激酶)基因編碼順序和多聚腺苷酸化信號(hào)的DNA順序，與一個(gè)哺乳動(dòng)物組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序(如啟動(dòng)子順序和增強(qiáng)子順序)相連接。
VZV胸苷激酶編碼順序和3′多聚腺苷酸化信號(hào)位于大約1，381bp的AccI/NdeI限制性核酸內(nèi)切酶片段內(nèi)(見(jiàn)圖2)。
最好是用含有VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化信號(hào)的1381bp AccI/NdeI片段與哺乳動(dòng)物組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子順序連接，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以采用含有VZV胸苷激酶的其它DNA片段。此外，VZV胸苷激酶多聚腺苷酸化信號(hào)可以用其它合適的多聚腺苷酸化信號(hào)來(lái)代替，例如SV40病毒或其它哺乳動(dòng)物基因的多聚腺苷酸化信號(hào)。
啟動(dòng)子和增強(qiáng)子順序最好選自下列基因之一的轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序清蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素、γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶、多巴脫羧酶、HER2/neu或N-myc致癌基因，或其它合適的基因。
這些分子嵌合體可以用一個(gè)釋放系統(tǒng)釋放到靶細(xì)胞上。為給患者施用，必須提供一個(gè)能將分子嵌合體穩(wěn)定整合到細(xì)胞中的有效體內(nèi)釋放系統(tǒng)。已知的方法所利用的技術(shù)有磷酸鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移、射彈法(Ballistic barrage)或還原病毒感染。這方面的綜述見(jiàn)Biotechnique 6(7)，1988。
整合合成基因的細(xì)胞還原病毒感染技術(shù)，采用了本領(lǐng)域已知的還原病毒穿梭載體(參見(jiàn)例如Mol.and Cell Biol.1986年8月號(hào)，2895頁(yè))。還原病毒穿梭載體基本上是用包含在質(zhì)粒中的DNA形式的還原病毒產(chǎn)生的。這些質(zhì)粒還含有選擇和在細(xì)菌中生長(zhǎng)所必需的順序。還原病毒穿梭載體已去除了內(nèi)源性親本還原病毒基因(如gag、pol和env)，并插入所要的DNA順序，如上述的分子嵌合體。但它們含有可供病毒包衣殼作用、原病毒對(duì)靶基因組的插入、信息拼接、終止和多聚腺苷酸化的適當(dāng)?shù)倪€原病毒調(diào)控順序。還原病毒穿梭載體已從莫洛尼氏鼠白血病毒(Mo-MLV)得到，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，也可使用其它還原病毒，例如密切相關(guān)的莫洛尼氏鼠肉瘤病毒。某些DNA病毒也可作為釋放系統(tǒng)使用。牛乳頭瘤病毒(BPV)在染色體外復(fù)制，因此以BPV為基礎(chǔ)的釋放系統(tǒng)有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即所釋放的基因以非整合方式保持。
本發(fā)明的第三方面提供一種含有如前面所限定的分子嵌合體的還原病毒穿梭載體。
還原病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于基因高效率地釋放到靶組織中、病毒基因組進(jìn)行順序特異性整合(在5′和3′長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)順序處)、所釋放的DNA與其它DNA釋放系統(tǒng)相比很少有重排。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案提供一種還原病毒穿梭載體，該載體包含一個(gè)DNA順序，其中含有一個(gè)5′病毒LTR順序、一個(gè)順式作用的潑西(psi)包衣殼順序、一個(gè)如前面所限定的分子嵌合體、以及一個(gè)3′病毒LTR順序(圖4A和圖4B)。
為有助于消除分子嵌合體的非組織特異性表達(dá)，一個(gè)優(yōu)選的具體方案是將該分子嵌合體置于與5′還原病毒LTR相反的轉(zhuǎn)錄取向(圖4A和圖4B)。此外，還可以加入一個(gè)由5′LTR順序轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)的顯性可選擇標(biāo)記基因。這樣一個(gè)顯性可選擇標(biāo)記基因可以是細(xì)菌的Ⅱ型新霉素抗性基因NEO(氨基糖苷3′磷酸轉(zhuǎn)移酶)，該基因賦予真核細(xì)胞對(duì)新霉素類(lèi)似物G418硫酸(商標(biāo)為genetiein)的抗性(圖4A和4B)。NEO基因有助于含有這些順序的包裝細(xì)胞的選擇(見(jiàn)下文)。
實(shí)施例中所用的還原病毒載體是以莫洛尼氏鼠白血病毒為基礎(chǔ)的，但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，也可使用其它載體。這些含有NEO基因作為可選擇標(biāo)記的載體已有記載，例如N2載體(Science 2301395-1398，1985)。
與還原病毒穿梭載體有關(guān)的理論問(wèn)題是，還原病毒LTR調(diào)控順序有可能激活位于宿主基因組中整合位點(diǎn)處的細(xì)胞致癌基因的轉(zhuǎn)錄。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)產(chǎn)生一個(gè)SIN載體(圖4A)來(lái)消除。SIN載體是一些自我失活載體，它們?cè)谶€原病毒LTR中含有一個(gè)包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)在內(nèi)的缺失。SIN載體的LTR順序不激活5′或3′基因組順序的轉(zhuǎn)錄。病毒LTR順序的轉(zhuǎn)錄失消除了相鄰的靶細(xì)胞DNA順序的插入激活，同時(shí)也有助于所釋放的分子嵌合體的選擇性表達(dá)。SIN載體是通過(guò)在3′病毒LTR順序中去除大約299bp而產(chǎn)生的(Biotechniques4504-512，1986)。
因此，本發(fā)明的還原病毒穿梭載體最好是SIN載體。
由于已從這些穿梭載體中去除了親本還原病毒的gag、pol和env基因，可以利用輔助病毒系統(tǒng)提供還原病毒的gag、pol和env中間基因產(chǎn)物，從而將還原病毒載體包裝或包衣殼成感染性病毒粒子。這是利用特化的“包裝”細(xì)胞系來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這些細(xì)胞系能夠產(chǎn)生感染性的合成病毒，但仍缺乏產(chǎn)生任何可檢測(cè)的野生型病毒的能力。這樣，人工合成病毒便含有一個(gè)本發(fā)明的嵌合體，該嵌合體包裝在不含野生型輔助病毒的人工合成感染性病毒粒子中。這根據(jù)的是如下的事實(shí)穩(wěn)定整合到包裝細(xì)胞中的輔助病毒含有病毒結(jié)構(gòu)基因，但缺乏潑西位點(diǎn)，后者是一個(gè)順式作用的調(diào)控順序，必須包含在要包衣殼成感染性病毒顆粒的病毒基因組RNA分子中。
因此，本發(fā)明的第四方面提供一種感染性病毒粒子，它包含一個(gè)如上所述的還原病毒穿梭載體，所述載體被包衣殼在病毒蛋白內(nèi)，從而產(chǎn)生感染性的復(fù)制缺陷型人工還原病毒。
還原病毒穿梭載體所包含的穿梭載體中，最好包含一個(gè)具有AFP或ALB轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序的分子嵌合體。具體地說(shuō)，穿梭載體含有AFP/VZV胸苷激酶嵌合體或ALB/VZV胸苷激酶嵌合體。
除了去除潑西位點(diǎn)外，還可對(duì)輔助病毒LTR調(diào)控順序作其它改變，以確保輔助病毒不被包裝在病毒粒子中，并在逆轉(zhuǎn)錄和病毒整合水平上被阻斷。
此外，也可將輔助病毒結(jié)構(gòu)基因(即gag、pol和env)分別地、彼此獨(dú)立地轉(zhuǎn)移到包裝細(xì)胞系中。由于這些病毒結(jié)構(gòu)基因在包裝細(xì)胞的基因組內(nèi)被分隔開(kāi)，所以很少有發(fā)生暗重組而產(chǎn)生野生型病毒的機(jī)會(huì)。
本發(fā)明的第五方面提供一種制備本發(fā)明的感染性病毒粒子的方法，該方法是將含有如上所述的本發(fā)明分子嵌合體的人工還原病毒穿梭載體釋放至包裝細(xì)胞系中。
包裝細(xì)胞系中可以穩(wěn)定地整合有一個(gè)缺乏潑西位點(diǎn)的輔助病毒和如上所述的其他調(diào)控順序，也可以對(duì)包裝細(xì)胞系進(jìn)行而改造而使其在基因組中含有輔助病毒結(jié)構(gòu)基因。
本發(fā)明還提供一種如上所述的感染性病毒粒子，用于治療，特別是用于治療癌癥，特別是用于治療肝細(xì)胞癌、睪丸非精原細(xì)胞癌、某些畸胎癌和某些胃腸腫瘤。
利用組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控(如增強(qiáng)子和啟動(dòng)子)順序來(lái)實(shí)現(xiàn)雜合酶特別是VZV胸苷激酶基因的選擇性表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)肝細(xì)胞的選擇性感染進(jìn)一步改進(jìn)選擇性。存在于包裝細(xì)胞系中的還原病毒env基因確定了對(duì)宿主感染的特異性。對(duì)用于構(gòu)建包裝細(xì)胞系的env基因進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生能選擇性地感染肝細(xì)胞的人工感染性病毒粒子。例如，可以對(duì)導(dǎo)入包裝細(xì)胞中的還原病毒env基因進(jìn)行某種方式的修飾，使人工感染性病毒粒子的被膜糖蛋白能通過(guò)由乙型肝炎病毒(HBV)所利用的特異受體介導(dǎo)的結(jié)合作用而選擇性地感染肝細(xì)胞。
HBV主要通過(guò)特異受體介導(dǎo)的結(jié)合作用來(lái)感染肝細(xì)胞。由前S1和前S2順序編碼的HBV蛋白在HBV與肝細(xì)胞的附著中起主要作用(HepadnaViruses，Robinson等編，189-203，205-221，1987)。對(duì)包裝細(xì)胞的env基因進(jìn)行修飾，使其含有HBV大S被膜蛋白的肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。導(dǎo)入包裝細(xì)胞的env基因的這些修飾，可以用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行，這些修飾將有利于靶組織對(duì)病毒的吸收。
本發(fā)明的感染性病毒粒子可以用本領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行配制，并可作為與藥用載體配成的制劑存在。在這種情況下，藥用載體可包含一種適于作為媒液使用的液體介質(zhì)，以將感染性病毒粒子導(dǎo)入患者體內(nèi)。這樣一種載體的例子是鹽水。感染性病毒粒子可以是在這樣一種媒液中的溶液或懸浮液。在這些藥物制劑中還可以有穩(wěn)定劑和抗氧化劑和/或其它賦形劑，這些制劑可以用任何常規(guī)方法如口服或腸胃外途徑給哺乳動(dòng)物施用。具體地說(shuō)，感染性病毒粒子可以通過(guò)靜脈或動(dòng)脈輸入來(lái)施用。在治療肝細(xì)胞癌時(shí)，用肝動(dòng)脈輸入法可能較為有利。
因此，本發(fā)明提供一種藥物制劑，該制劑包含感染性病毒粒子與藥用載體的混合物。
此外，本發(fā)明還提供制備這里所述的藥物制劑的方法，包括使含有分子嵌合體的人工感染性病毒粒子與藥用載體混合。
雖然可以利用可被酶選擇性轉(zhuǎn)化的任何適當(dāng)?shù)幕衔铮景l(fā)明還提供式Ⅰ或Ⅱ的化合物用于一種藥物的制備，這種藥物可用于治療能夠表達(dá)VZV胸苷激酶的癌癥，特別是用于治療肝細(xì)胞癌。
已知如下所示的式(Ⅰ)的6-取代嘌呤阿拉伯糖苷、它的鹽和有生理功能的等價(jià)物，可作為抗VZV和細(xì)胞肥大病毒藥劑，它們的應(yīng)用和合成描述于已公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0294114中。
其中R1為鹵素、C1-5烷氧基、鹵素取代的C1-5烷氧基、被C1-5烷基單取代或二取代的氨基、被一個(gè)或多個(gè)氟原子取代的C1-5烷基、C3-6環(huán)烷基、或含有C4-7碳原子和或有或無(wú)的雙鍵的含氮雜環(huán);R2為氫、鹵素或氨基。
式Ⅱ化合物如下所示
其中X代表1，2-亞乙烯基或亞乙炔基;R1代表氧或亞氨基;R2代表氫原子、C1-2烷基、C3-4支鏈烷基或環(huán)烷基，例如異丙基或環(huán)丙基;R3代表氫原子或?；?，例如C1-4鏈烷酰基或可被例如一個(gè)或多個(gè)鹵素、烷基、羥基或烷氧基取代基取代的苯甲?；?R4代表氫原子或羥基;條件是(a)當(dāng)R2、R3和R4各代表氫原子時(shí)，R1不代表氧。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，當(dāng)R3不為?；鶗r(shí)，式(Ⅰ)或(Ⅱ)的化合物可以以其互變異構(gòu)形式存在。特別優(yōu)選的式Ⅰ和Ⅱ化合物是9-β-呋喃阿拉伯糖基-6-甲氧基-9H-嘌呤和1-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-丙基尿嘧啶。
這些化合物及其合成方法已在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0272065中公開(kāi)，這些化合物被認(rèn)為具有抗VZV活性。
上述嘧啶核苷和嘌呤阿拉伯糖苷，還包括這些化合物的可藥用衍生物，即任何可藥用鹽、酯或該酯的鹽，或在施用于人體后能提供(直接地或間接地)活性代謝物或其殘基的任何其它化合物。該化合物最好在口服時(shí)有效。
治療哺乳動(dòng)物時(shí)的劑量和準(zhǔn)確方案，當(dāng)然要由主治醫(yī)師決定，這將取決于包括欲治療癥狀的類(lèi)型和嚴(yán)重程度在內(nèi)的各種因素。但對(duì)肝細(xì)胞癌來(lái)說(shuō)，以每毫升感染性病毒粒子2×105至2×107集落形成單位(CFU/ml)的效價(jià)肝動(dòng)脈輸入人工感染性病粒子可能會(huì)適于一般的腫瘤。所輸入的病毒粒子的總量將取決于腫瘤的大小，并最好以分劑量給予。
藥物治療在用感染性病毒粒子感染后，施用本發(fā)明的化合物，這些化合物在合成代謝中轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物時(shí)，關(guān)鍵性的第一個(gè)磷酸化步驟特異地需要VZV胸苷激酶活性。
藥物的劑量最好在每天每千克患者體重0.1到250毫克范圍內(nèi)，最好是每千克體重0.1至100毫克。
下列實(shí)施例用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)誤認(rèn)為是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1清蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶分子嵌合體的構(gòu)建用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)含有VZV胸苷激酶基因組的約2200bp EcoRI/BamHI片段的約4896bp質(zhì)粒(稱為22TK)(Virology 1491-9，1986;由J.Ostrove NIH，Bethesda，Md.供給)進(jìn)行消化，用洗脫捕獲(elutrap)電泳室(Schleicher and Schuell，Keene NH，USA)以電洗脫法純化出含有VZV胸苷激酶基因編碼順序和多聚腺苷酸化信號(hào)的約1381bp AccI/Nde I DNA片段(所有限制酶得自Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg MD，USA;New England Biolabs，Mass，USA;或Promega，Madison，Wi，USA;所有酶反應(yīng)都按供貨商的說(shuō)明進(jìn)行)。純化出的DNA片段含有完整的VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化信號(hào)，但不包括任何VZV胸苷激酶啟動(dòng)成分(見(jiàn)圖2A和2B)。
用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，MD，USA)和脫氧核苷三磷酸(dNTP)進(jìn)行處理，使純化出的1381bp Acc I/Nde I VZV胸苷激酶片段的5′伸出端成為平末端。
由Richard Palmiter(華盛頓大學(xué)，美國(guó)華盛頓州西雅圖市)得到含有約2300bp ALB E/P順序的約5249bp質(zhì)粒，稱為2335A-1。此構(gòu)建體含有肝特異性表達(dá)所必需的順序，但缺乏非必需的插入順序。在相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)+23位處，有一個(gè)唯一的BamHI限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI消化2335A-1，并如上所述用Klenow酶和dNTP處理使5′伸出端成為平末端。
用T4 DNA連接酶(BRL，Gaithersburg，MD)將含有VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化順序的平末端AccI-NdeI片段連接到2335A-1的平末端BamHI位點(diǎn)中，產(chǎn)生pCR73，從而構(gòu)建出ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體(圖5)。與上述所有連接相似，用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶消化，從而確定連接后片段的取向。與所有實(shí)施例中所述的所有質(zhì)粒相似，pCR73含有在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制所需的以及適于用本領(lǐng)域公知方法進(jìn)行擴(kuò)增的必需順序。用電洗脫法從pCR73中純化出ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體，其形式為約3880bp的SstI/KpnI限制性核酸內(nèi)切酶片段(圖5)。用T4 DNA聚合酶和dNTP進(jìn)行處理，使3′伸出端成為平末端。然后將這個(gè)SstI/KpnI平末端限制片段導(dǎo)入莫洛尼氏鼠白血病毒還原病毒穿梭載體系統(tǒng)(見(jiàn)下面的實(shí)施例3)。
pCR73已于1989年8月18日保藏于ATCC，登記號(hào)為ATCC 68077。
實(shí)施例2甲胎蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶的構(gòu)建分離出VZV胸苷激酶編碼順序和多聚腺苷酸化位點(diǎn)，其形式為pCR73的約3，300bp BamHI-XmnI限制性核酸內(nèi)切酶片段(圖6)。用Klenow酶和dNTP進(jìn)行處理使BamHI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的5′伸出端成為平末端。此DNA片段含有VZV胸苷激酶基因的完整編碼順序和多聚腺苷酸化位點(diǎn)，但不含有任何增強(qiáng)子或啟動(dòng)子順序。從加拿大卡爾加里大學(xué)的T.Tamaoki處得到含有約5，100bp人AFP5′鄰接DNA的約9996bp質(zhì)粒pAF5.1-CAT。通過(guò)用XmnI消化和用HindⅢ部分消化，從pAF5.1-CAT中分離出一個(gè)從人AFP基因的約-5.1kb至+29kb的DNA片段。用T4 DNA連接酶使該XmnI/HindⅢ片段與BamHI/XmnI VZV胸苷激酶片段連接，形成pCR77(圖6)。用電洗脫法從pCR77中純化出AFP E/P VZV胸苷激酶嵌合體，其形式為約6699bp AatⅡ/PstⅠ限制性核酸內(nèi)切酶片段。然后如實(shí)施例1所述將此片段用T4 DNA聚合酶和dNTP處理，產(chǎn)生平末端限制片段。
pCR77已于1989年8月18日保藏于ATCC，登記號(hào)為ATCC 68079。
實(shí)施例3含有實(shí)施例1的分子嵌合體的還原病毒穿梭載體構(gòu)建體的構(gòu)建將pCR73的純化的SstI/kpn I平末端片段連接到稱為N2(XM5)的莫洛尼氏鼠白血病還原病毒載體中(Science 2301395-1398，1985，得自S.Karrlson，NIH，Bethesda，MD，USA)，從而構(gòu)建出含有ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體的還原病毒穿梭載體pCR 74。在用T4 DNA連接酶連接到pCR 73的SstI/KpnI片段中之前，用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI消化N2(XM5)，并用Klenow酶和dNTP進(jìn)行處理，使5′伸出端成為平末端(圖5)。
含有ALB E/P VZV胸苷激酶嵌合體的還原病毒穿梭載體pCR 74已通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析和DNA順序分析進(jìn)行了定性，從而證實(shí)了它的一級(jí)順序。鄰接ALB E/P與VZV胸苷激酶順序連接點(diǎn)處的順序示于圖7。
pCR 74已于1989年8月18日保藏在ATCC，登記號(hào)為ATCC68078。
實(shí)施例4含有實(shí)施例2的分子嵌合體的還原病毒穿梭載體構(gòu)建體的構(gòu)建將含有AFP E/P VZV胸苷激酶嵌合體的pCR77的純化的AatⅡ/PstⅠ片段連接到N2(XM5)中，從而構(gòu)建出還原病毒穿梭載體pCR78(圖6)，N2(XM5)已如實(shí)施例3所述用XhoI進(jìn)行了消化并用T4 DNA聚合酶和dNTP處理成平末端。含有AFP E/P.VZV胸苷激酶嵌合體的還原病毒穿梭載體pCR 78已通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析和DNA順序分析進(jìn)行了定性，從而證實(shí)了它的一級(jí)順序。鄰接AFP E/P與VZV胸苷激酶連接點(diǎn)的順序示于圖8。
pCR 78已于1989年8月18日保藏在ATCC，登記號(hào)為ATCC68080。
實(shí)施例5病毒的生產(chǎn)從ATCC(ATCC CRL 9078)得到前述的稱為PA 317的包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系有三個(gè)包含在5′LTR、潑西調(diào)控順序和3′LTR內(nèi)的變異(Mol.and Cell Biol.6(8)2895-2902，1986)。通過(guò)電穿孔或感染將實(shí)施例3和4中所述的人工還原病毒構(gòu)建體放入包裝細(xì)胞系中。進(jìn)行電穿孔時(shí)，將20微克線性化的質(zhì)粒DNA電穿孔到磷酸緩沖蔗糖中的二百萬(wàn)個(gè)PA 317細(xì)胞中，采用280伏、25微法拉的電容，總體積為0.8毫升。能夠得到至少150個(gè)G418抗性集落/20微克質(zhì)粒DNA/二百萬(wàn)個(gè)PA 317細(xì)胞。進(jìn)行感染時(shí)，將20微克線性化的質(zhì)粒DNA電穿孔到二百萬(wàn)生態(tài)適應(yīng)性(ecotroplc)包裝細(xì)胞(如Psi 2細(xì)胞)中。兩天后，用培養(yǎng)上清液感染兼性適應(yīng)性(amphotropic)包裝細(xì)胞系PA 317，并分離出418抗性集落。電穿孔和感染技術(shù)都是將G418抗性集落用有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆，并用Southern印跡法進(jìn)行分析，在NIH 3T3細(xì)胞(ATCC)中進(jìn)行滴定，從而鑒定出全長(zhǎng)病毒產(chǎn)量最高的克隆。對(duì)含有pCR 74的PA 317細(xì)胞分離出17個(gè)單細(xì)胞克隆，從其中的10個(gè)克隆中提取DNA。利用不同的限制性核酸內(nèi)切酶，并用NEO和VZV胸苷激酶順序作為放射性雜交探針，對(duì)這10個(gè)DNA樣品進(jìn)行深入的Southern印跡分析。在所分析的10個(gè)克隆中，有兩個(gè)沒(méi)有顯現(xiàn)出任何截短的跡象，因而被認(rèn)為是全長(zhǎng)的。對(duì)含有pCR 78的PA 317細(xì)胞分離出29個(gè)單細(xì)胞克隆，并從25個(gè)克隆中得到DNA。利用不同的限制性核酸內(nèi)切酶，并用AFP、NEO和VZV胸苷激酶順序作放射性雜交探針，對(duì)這25個(gè)樣品進(jìn)行深入的Southern印跡分析。在所分析的25個(gè)克隆中，有5個(gè)沒(méi)有顯現(xiàn)出任何截短的跡象，因而被認(rèn)為是全長(zhǎng)的。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在胸苷激酶-/-的NIH3T3細(xì)胞中對(duì)含有全長(zhǎng)病毒順序的每個(gè)包裝細(xì)胞系進(jìn)行滴定。
實(shí)施例6用實(shí)施例5的含有ALB/VZV胸苷激酶或AFP/VZV胸苷激酶的全長(zhǎng)感染性病毒粒子感染人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(陽(yáng)性對(duì)照)，然后測(cè)定VZV胸苷激酶活性、ara ATP的生成和藥物敏感性用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體或AFP/VZV胸苷激酶嵌合體的復(fù)制缺陷型全長(zhǎng)人工還原病毒，感染稱為Hep G2(ATCC HB8065)的人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系。感染并在1毫克Geneticin(商標(biāo))/毫升上進(jìn)行選擇后，測(cè)定細(xì)胞的VZV胸苷激酶活性。此外，在3H標(biāo)記的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤(下表和附圖中稱為ara-m)存在下培養(yǎng)細(xì)胞，然后測(cè)定ara ATP。最后在上述化合物存在下培養(yǎng)細(xì)胞，并測(cè)定IC50(生長(zhǎng)抑制)。未用病毒感染的細(xì)胞或用N2病毒感染的細(xì)胞作為這些實(shí)驗(yàn)的對(duì)照樣品。N2病毒不含VZV胸苷激酶遺傳物質(zhì)。
表1證實(shí)，用含有pCR 74或pCR 78的病毒感染的人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞的VZV胸苷激酶活性，分別比對(duì)照細(xì)胞強(qiáng)904倍或52倍。
9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤(稱為ara-m)可被VZV胸苷激酶選擇性地單磷酸化，并在隨后的合成代謝中轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性的ara ATP。圖9證實(shí)，用含有pCR 74或pCR 78的病毒感染并在3H標(biāo)記的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞，形成大量的細(xì)胞毒性3H-ara ATP。
用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶(pCR 78)嵌合體的復(fù)制缺陷型全長(zhǎng)人工還原病毒感染的Hep G2細(xì)胞，在不同量的9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下培養(yǎng)5天，并測(cè)定生長(zhǎng)抑制作用，以細(xì)胞數(shù)和DNA含量來(lái)量度。
表2證實(shí)，在對(duì)照細(xì)胞和用N2感染的Hep G2細(xì)胞中，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC50(50%生長(zhǎng)抑制)高于2000μM。用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶(pCR 78)嵌合體的復(fù)制缺陷型全長(zhǎng)人工還原病毒感染的Hep G2細(xì)胞，其IC50分別為5μM和175μM。含有AFP/VZV胸苷激酶(pCR 78)嵌合體的Hep G2細(xì)胞的單細(xì)胞克隆表明，9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC50水平可進(jìn)一步降至約40μM。
實(shí)施例7VZV胸苷激酶表達(dá)的選擇性取五個(gè)人非肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系，用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)的復(fù)制缺陷型全長(zhǎng)人工還原病毒進(jìn)行感染。這些細(xì)胞系是WiDR(ATCC CCL218)、IMR90(ATCC CCL186)、MCF7(ATCC HTB22)、Detroit 555(ATCC CCL110)和SW 480(ATCC CCL228)。在感染并在Geneticin(商標(biāo))上進(jìn)行選擇后，如上所述測(cè)定這些細(xì)胞的VZV胸苷激酶活性和在9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤存在下的生長(zhǎng)抑制作用。在這五個(gè)用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)的復(fù)制缺陷型全長(zhǎng)人工還原病毒感染的非肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，其VZV胸苷激酶活性或?qū)?-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的藥物敏感性，比未感染的親本細(xì)胞系沒(méi)有提高。這證實(shí)了VZV胸苷激酶在肝細(xì)胞瘤中表達(dá)相對(duì)于在非肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)的選擇性。


圖1清蛋白增強(qiáng)子和啟動(dòng)子順序與清蛋白基因(IA)、雜合基因(IB)和不帶非必需順序的雜合基因之間關(guān)系的圖示。
圖2A水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因的簡(jiǎn)圖。
圖2BVZV胸苷激酶基因一級(jí)順序。
圖3A清蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶分子嵌合體。
圖3B甲胎蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序/VZV胸苷激酶分子嵌合體。
圖4A含有甲胎蛋白/VZV胸苷激酶分子嵌合體的原病毒形式的還原病毒。
圖4BpCR 78。
圖5顯示pCR 74構(gòu)建過(guò)程的流程圖。
圖6顯示pCR 78構(gòu)建過(guò)程的流程圖。
圖7pCR 74中鄰接ALB E/P與VZV胸苷激酶的順序。
圖8pCR 78中鄰接AFP E/P與VZV胸苷激酶的順序。
圖9用對(duì)照、pCR 74和pCR 78感染的細(xì)胞中ara ATP的生成。
表1用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 78)的復(fù)制缺陷型全長(zhǎng)人工還原病毒感染的Hep G2細(xì)胞中VZV胸苷激酶的活性。VZV胸苷激酶的活性定量為每30分鐘、每毫克細(xì)胞蛋白中被磷酸化的araM的量。
病毒 VZV胸苷激酶活性 提高倍數(shù)(ara MP(毫微摩爾)/微克蛋白/30分)無(wú) 9 0N2 4 0pCR 74 4521 904pCR 78 258 52表2用含有ALB/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 74)或AFP/VZV胸苷激酶嵌合體(pCR 78)的復(fù)制缺陷型全長(zhǎng)人工還原病毒感染的Hep G2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。
病毒 9-(β-D-呋喃阿拉伯糖基)-6-甲氧基-9H-嘌呤的IC50無(wú) ＞2000μMN2 ＞2000μMpCR 74 5μMpCR 78 175μM
權(quán)利要求
1.一種分子嵌合體，它包含一個(gè)能夠在哺乳動(dòng)物靶組織中被選擇性激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序、一個(gè)與該轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序有效連接并編碼一種雜合酶的DNA順序，所述酶能夠催化一種對(duì)靶組織有毒的藥劑的生成。
2.如權(quán)利要求1所述的嵌合體，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序包含一個(gè)啟動(dòng)子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的嵌合體，它還包含一個(gè)位于編碼雜合酶的DNA順序下游的多聚腺苷酸化信號(hào)。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的嵌合體，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序還包含一個(gè)增強(qiáng)子順序。
5.如權(quán)利要求2或4中任一項(xiàng)所述的嵌合體，其中啟動(dòng)子選自下列基因的啟動(dòng)子清蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素、γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶、多巴脫羧酶、HER/neu和N-myc致癌基因。
6.如權(quán)利要求4所述的嵌合體，其中增強(qiáng)子選自下列基因的增強(qiáng)子清蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、酪氨酸羥化酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、膠質(zhì)纖維酸性蛋白、胰島素、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶、多巴脫羧酶、HER/neu和N-myc致癌基因。
7.如權(quán)利要求1或6中任一項(xiàng)所述的分子嵌合體，其中酶選自水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶、羧肽酶G2、堿性磷酸酶、青霉素V酰胺酶、非哺乳動(dòng)物胞苷脫氨酶。
8.如權(quán)利要求1或7中任一項(xiàng)所述的分子嵌合體，其中酶為水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶。
9.一種分子嵌合體，它包含一個(gè)編碼水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因的DNA順序，該順序與清蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序有效連接。
10.一種分子嵌合體，它包含一個(gè)編碼水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶的DNA順序，該順序與甲胎蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序有效連接。
11.一種還原病毒穿梭載體，它含有如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的分子嵌合體。
12.如權(quán)利要求11所述的載體，它包含一個(gè)5′病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)順序、一個(gè)順式作用的潑西包衣殼順序、權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的分子嵌合體和一個(gè)3′病毒LTR順序。
13.如權(quán)利要求12所述的載體，其中分子嵌合體的取向與5′還原病毒LTR的方向相反。
14.如權(quán)利要求12或13所述的載體，它還包含一個(gè)編碼顯性可選擇標(biāo)記的DNA順序，該順序與5′LTR順序有效連接。
15.如權(quán)利要求14所述的載體，其中可選擇標(biāo)記順序是一個(gè)NEO基因。
16.如權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的載體，它是一個(gè)自我失活載體(SIN)。
17.一種感染性病毒粒子，它包有一個(gè)如權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)所述的載體。
18.如權(quán)利要求17所述的感染性病毒粒子，它已被改造在能選擇性地感染一種靶組織。
19.如權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)所述的感染性病毒粒子，它是復(fù)制缺陷型。
20.如權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的感染性病毒粒子，其中該病毒粒子的env基因被修飾成能促進(jìn)細(xì)胞結(jié)合作用。
21.如權(quán)利要求20所述的感染性病毒粒子，其中env基因被修飾成含有HBV大S被膜蛋白的肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。
22.如權(quán)利要求1或10中任一項(xiàng)所述的分子嵌合體，它用于醫(yī)療。
23.一種藥物制劑，它包含一個(gè)如權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)所述的感染性病毒粒子和適用的藥用載體。
24.如權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)所述的感染性病毒粒子，它用于醫(yī)療。
25.如權(quán)利要求17或21中任一項(xiàng)所述的感染性病毒粒子在一種藥物的制備中的應(yīng)用，所述藥物用于治療哺乳動(dòng)物的癌癥。
26.一種化合物在一種藥物的制備中的應(yīng)用，所述藥物用于治療能夠表達(dá)一種雜合酶的癌癥，所述化合物能被該酶直接地或通過(guò)一種中間體而選擇性地催化成一種細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物。
27.一種化合物或其鹽或其有生理功能的衍生物在一種藥物的制備中的應(yīng)用，所述藥物用于治療能夠表達(dá)VZV胸苷激酶的癌癥，其中所述化合物具有式Ⅰ或式Ⅱ
其中R1為鹵素、C1-5烷氧基、鹵素取代的C1-5烷氧基、被C1-5烷基單取代或二取代的氨基、被一個(gè)或多個(gè)氟原子取代的C1-5烷基、C3-6環(huán)烷基、或一個(gè)含有C4-7碳原子和或有或無(wú)的雙鍵的含氮雜環(huán);R2為氫、鹵素或氨基;
其中，X代表1，2-亞乙烯基或亞乙炔基;R1代表氧或亞氨基;R2代表氫原子、C1-2烷基、C3-4支鏈烷基或環(huán)烷基，例如異丙基或環(huán)丙基;R3代表氫原子或?；缈杀灰粋€(gè)或多個(gè)鹵素、烷基、羥基或烷基取代基取代的C1-4鏈烷?；虮郊柞；?R代表氫原子或羥基;條件是(a)當(dāng)R2、R3和R4各代表氫原子時(shí)，R1不代表氧。
28.如權(quán)利要求17至21所述的感染性病毒粒子和一種化合物一同用于醫(yī)療中的應(yīng)用，所述化合物能夠被一種雜合酶選擇性地催化成細(xì)胞抑制性或細(xì)胞毒性代謝物。
29.pCR73、pCR74、pCR77或pCR78中的任一個(gè)。
全文摘要
描述了用DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的新的分子嵌合體。它們包含一個(gè)連于其上的靶組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序，該順序控制一種雜合酶如水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因的表達(dá)。將分子嵌合體包裝到能夠感染哺乳動(dòng)物組織的合成還原病毒顆粒中。該顆粒則可以給患者施用，轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序?qū)⒃诎薪M織(如癌組織)中被選擇性地轉(zhuǎn)錄激活。施用能被酶選擇性代謝的化合物，將就地產(chǎn)生細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性代謝物，從而選擇性地殺傷靶細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61K38/45GK1050899SQ9010734
公開(kāi)日1991年4月24日 申請(qǐng)日期1990年8月29日 優(yōu)先權(quán)日1989年8月30日
發(fā)明者布賴恩·休伯·達(dá)勒姆, 辛西婭·安·理查德斯, 托馬斯·安東尼·克倫尼斯基 申請(qǐng)人:惠爾康基金會(huì)集團(tuán)公司