專利名稱:改進(jìn)的神經(jīng)節(jié)苷脂類及其功能性衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及改進(jìn)的神經(jīng)節(jié)苷脂類及其功能性衍生物,更確切地講是N-酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類,N'-?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類和N,N'-二酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類(在這些化合物中,?;鶑闹咀澹枷阕?,芳脂族,脂環(huán)類或雜環(huán)類有機(jī)酸衍生而來,其中至少在兩個酰基中的一個不是脂肪族的),它們的酯類,內(nèi)酯類,酰胺類,和羥基全?;锛捌潲}類。
本發(fā)明也針對含上述一種或一種以上神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物或其鹽的藥物制劑,以及它們的治療應(yīng)用和制備方法。
本發(fā)明的新衍生物的基本神經(jīng)節(jié)苷脂可以是從天然產(chǎn)物,特別是從脊椎動物中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),也可是從腎上腺髓質(zhì),紅細(xì)胞,脾臟或其它器官,提取出來的神經(jīng)節(jié)苷脂類的一種。它們是較佳提純的神經(jīng)節(jié)苷脂,雖然不是單一的化合物,但可以看作是相同的,由于近似的分子式,其中包括低聚糖部分(對每一種神經(jīng)節(jié)苷脂一般在化學(xué)上是特定的),唾液酸部分(即由一種或一種以上唾液酸組成)和神經(jīng)酰胺部分,后兩部分通常由各種唾液酸和各種N-?;窠?jīng)鞘氨醇的混和物構(gòu)成,各種N-酰基神經(jīng)鞘氨醇在其脂肪鏈長度上不同,并帶有從較高級脂肪酸而來的各種酰基。這樣一種神經(jīng)節(jié)苷脂的大致分子式表示如下
其中唾液酸的一般分子式為
其中一個或一個以上伯羥基或仲羥基也可?;漉;鶃碜砸宜峄蛞掖妓??!吧窠?jīng)酰胺”殘基系對應(yīng)于下面兩個分子式之一
其中n=6-18,?;鶃碜跃哂?6-22個碳原子的飽和和不飽和脂肪酸或來自相應(yīng)的羥基酸。本發(fā)明的新型衍生物在?;谋举|(zhì)方面是不同的。這里,酰基基團(tuán)是單一的,而在神經(jīng)節(jié)苷脂中它是具有16-22個碳原子的來自各種脂肪酸的混和物。另一個區(qū)別是,和神經(jīng)節(jié)苷脂相反,酰基屬于非天然存在的羧基酸系列,即屬于芳香族、脂環(huán)類或雜環(huán)類系列。因之,它們是含有非天然存在的神經(jīng)酰胺的半合成神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物。
存在于神經(jīng)節(jié)苷脂中的唾液酸數(shù)目通常從1至5不等。唾液酸殘基通過2-位上的羥基和低聚糖的羥基形成的酮糖型鍵連接在低聚糖上。
當(dāng)幾個唾液酸連接在一起時,它們分子的連接是由兩個唾液酸分子的2-位和8-位羥基之間形成的酮糖鍵來完成的。神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸,包括如以前所述進(jìn)行純化的那些唾液酸,是各種化學(xué)上一元酸的混和物,例如,N-乙酰神經(jīng)氨糖酸和N-乙醇酰神經(jīng)氨糖酸,以前者為主,可能有一種或一種以上它們的O-酰基衍生物,如8-0-酰基衍生物。
低聚糖由最多5個單糖或它們的帶有酰胺基的衍生物所組成,特別是己糖和它們的上述類型衍生物。無論如何在低聚糖中有至少1個葡萄糖或半乳糖分子。作為上述糖的酰胺基衍生物的最常見殘基是N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺。
為了更好地闡明包括在分子式(Ⅰ)中的神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu),這基本上是本發(fā)明的衍生物的主要結(jié)構(gòu),特別是糖部分,唾液酸和神經(jīng)酰胺之間的鍵的特性,在此一起,作為一個整體提供含一個單唾液酸(以N-乙酰神經(jīng)氨糖酸或N-乙醇酰神經(jīng)氨酸為代表)的“純”神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的分子式
對于依照本發(fā)明的神經(jīng)節(jié)苷脂“GM1”,分子式基本上是相同的,帶有被相應(yīng)的“人造”神經(jīng)酰胺取代的神經(jīng)酰胺殘基,其N-?;鶃碜苑枷阕澹h(huán)或雜環(huán)系列酸中的一個。
術(shù)語“溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”被用在文獻(xiàn)中來稱呼從天然神經(jīng)節(jié)苷脂消除其中神經(jīng)鞘氨醇上的酰基得到的化合物。它可用酶法消除,例如,將神經(jīng)節(jié)苷脂暴露在乙醇酰神經(jīng)鞘酯-神經(jīng)酰胺-脫?;傅淖饔孟?。這種類型的水解使神經(jīng)氨酸殘基上的酰胺基和酰羥基保持完整。為了使這些基團(tuán)也脫酰基,從而得到在神經(jīng)鞘氨醇上的氮和神經(jīng)氨上的氮上都有游離氨基的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物,必須用化學(xué)水解,例如用稀氫氧化鉀。以此處描述的方法對神經(jīng)氨氮脫?;玫降纳窠?jīng)節(jié)苷脂衍生物,通常以專門名詞“去N-?;?神經(jīng)節(jié)苷脂”見于文獻(xiàn)中,在此位置上的?;且阴;?。神經(jīng)鞘氨醇?xì)埢蜕窠?jīng)氨殘基上的兩個氮原子分別稱作N和N',術(shù)語“N'-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”也可用于上述的去N-乙?;?神經(jīng)節(jié)苷脂,同樣,術(shù)語“溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”也可用于在神經(jīng)鞘氨醇?xì)埢蠋в坞x氨基的衍生物,因之更精確地用術(shù)語“N-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”來認(rèn)定。另一方面,術(shù)語“N-N'溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”指帶兩個都是游離氨基的化合物。此命名法被用于本申請書的始終。
按本發(fā)明所得衍生物的上述定義包括神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物的基團(tuán),這種衍生物在神經(jīng)氨氮上有個乙?;?在神經(jīng)鞘氨醇上有個芳香族,芳香脂肪族,脂環(huán)族或雜環(huán)族酰基。
本發(fā)明也包括從酶學(xué)法得到的上述溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生出來的這種N-酰基-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,后者因之在其唾液酸中含有存在于天然神經(jīng)節(jié)苷脂的?;饕獊碜砸宜岷洼^少程度的乙醇酸的酰胺基混和物,以及可能有酯化羥基的酰基。術(shù)語“N-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”或“N-酰基-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”將用于本發(fā)明的以下介紹中,既用于可定性為“天然的”(如,天然N-溶解性GM1)這些衍生物,也用于在神經(jīng)氨氮上具有單一乙酰基的那些衍生物,它們在本介紹之外或更可取地被稱作N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類,例如,N-乙?;?N'-苯甲?;?N,N'-二-溶解性GM3。
術(shù)語“?;?二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂”此后將用來表示本發(fā)明的所有新化合物。如以后將詳述的,可單單在神經(jīng)氨糖酸的氮上和羥基上選擇性地將神經(jīng)節(jié)苷脂脫?;?,例如,用稀堿氫氧化物。用從乙?;?和乙醇?;?開始的不同酰基來?;@些化合物上神經(jīng)氨殘基的氨基,得到仍保留神經(jīng)節(jié)苷脂天然部分的N,N'-二?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,此天然部分即在神經(jīng)鞘氨醇氮上的來自較高級脂肪酸的混和?;_@些衍生物構(gòu)成按本發(fā)明所得新化合物中最佳的一組,它們將被稱作N'-酰基-N'-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,例如,N'-苯甲?;?N'-溶解性GM1。
眾所周知,神經(jīng)節(jié)苷脂在神經(jīng)系統(tǒng)起重要作用,最近證明,他們在外周神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)的治療上是有用的[Acta Psychiat.Scand.,55,102,(1977);Eur.Medicophys.,13,1,(1977);Ric.Sci.Educ.Perm.Suppl.9,115,(1978);Adv.Exp.Mcd.Biol.,71,275(1976);Electromyogr.Clin.Neurophy siol.,19,353,(1979);Minerva Medica,69,3277,(1978);Minerva stomat.,27,177,(1978);Med,del Lavoro,68,296,(1977);Brain Res.197,236,(1980)]。神經(jīng)節(jié)苷脂的治療作用主要在于刺激神經(jīng)細(xì)胞發(fā)芽現(xiàn)象和激活與神經(jīng)刺激的傳導(dǎo)有關(guān)的酶,如Na+,K+-ATP腺苷三磷酸酶[Brain Res.,197,236,(1980),J.of Neurochem.37,350,(1981)]。神經(jīng)節(jié)苷脂刺激的神經(jīng)元發(fā)芽促進(jìn)受損的或毀壞的神經(jīng)組織的功能性恢復(fù)。
我們已進(jìn)行進(jìn)一步的研究以發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)的治療上可能比神經(jīng)節(jié)苷脂更有效的化合物。這些研究導(dǎo)致例如神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)酯類的發(fā)現(xiàn),在這類化合物中,糖部分的一個或一個以上羥基和唾液酸部分的一個或一個以上羧基發(fā)生酯化(分子內(nèi)反應(yīng)),生成同樣數(shù)目的內(nèi)酯環(huán),這種內(nèi)酯類在促進(jìn)神經(jīng)元抽芽和激活與神經(jīng)刺激傳導(dǎo)有關(guān)的膜酶如Na+、K+-ATP酶上比神經(jīng)節(jié)苷脂本身更有效(如,見美國專利4,476,119,4,593,091和4,716,223)。
神經(jīng)節(jié)苷脂的“外”酯,即唾液酸的羧基官能團(tuán)和脂肪族、芳香脂肪族、脂環(huán)類或雜環(huán)類的各種醇生成的酯,對神經(jīng)元發(fā)芽和神經(jīng)刺激的傳導(dǎo)也顯示了活性的改善。神經(jīng)節(jié)苷脂的酰胺類也具有同樣的性質(zhì),如酰胺類,酯類和單純神經(jīng)節(jié)苷脂的全?;苌锬菢?。所有這些衍生物,如美國專利4,713,374中介紹的,也被認(rèn)為是本發(fā)明的?;?二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類的基礎(chǔ)物質(zhì)。
本發(fā)明的新化合物是半合成的神經(jīng)節(jié)苷脂類似物,它們不同于現(xiàn)有技術(shù)的分子,由于在神經(jīng)鞘氨醇氮和神經(jīng)氨氮上均有N-?;?。它們不是“天然的”,因之至少有一個來自芳香族、芳香脂肪族,脂環(huán)類或雜環(huán)類的酰基。
此外,它們不同于天然的神經(jīng)節(jié)苷脂(上述“天然的”N-?;?N-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂和N'-?;?N'-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂例外),由于?;菃我坏?,定義確切的這樣一個事實。含有在神經(jīng)氨氮上從乙?;鸩煌;哪切┭苌?,可以是存在于天然神經(jīng)節(jié)苷脂上那種類型的酰基,即較高級脂肪酸如硬脂酸或棕櫚酸的混和物。
在本發(fā)明基礎(chǔ)上的發(fā)現(xiàn)是,新的“半合成”神經(jīng)節(jié)苷脂也具有與天然神經(jīng)節(jié)苷脂及其酯類、酰胺類、內(nèi)酯類和所有這些化合物的全?;苌锘鞠嗤乃幚碜饔?,就很多參數(shù)而論其作用范圍是改變的,如神經(jīng)元抽芽作用的“啟動”、持續(xù)時間和強(qiáng)度(這可按酰基組分親脂性或親水性的大小進(jìn)行調(diào)節(jié)),或副作用的類型和程度(有時可證明它是負(fù)性的或正性的,根據(jù)要處理的治療問題而定)。對蛋白激酶C的抑制作用是一例,在神經(jīng)傳遞功能正常機(jī)制失平衡的某些情況下,它可以是不希望出現(xiàn)的負(fù)性作用。通過增加興奮性氨基酸如谷氨酸和/或天門冬氨酸的濃度而觸發(fā)激活作用。在上述異常條件下,這些酸對神經(jīng)元細(xì)胞具有直接的毒性作用。本發(fā)明產(chǎn)品的一大優(yōu)點是(這些產(chǎn)品置身于其它蛋白激酶C抑制劑如神經(jīng)節(jié)苷脂類本身或神經(jīng)鞘氨醇之外),包括在于它們預(yù)防和對抗上述神經(jīng)毒作用的能力。
重要的是強(qiáng)調(diào),本發(fā)明的產(chǎn)品,和鈣拮抗劑及谷氨酸受體拮抗劑(特別是NMDA)不一樣,只在異常情況下起作用,因而限制了局部神經(jīng)毒性,保持神經(jīng)可塑性,從而使受損的生理功能更容易地恢復(fù)。在很多情況下,有可能使用本發(fā)明的衍生物,使對應(yīng)于特定?;乃岜旧淼淖饔枚玫嚼?,可避免神經(jīng)節(jié)苷脂部分的特異作用,這時神經(jīng)節(jié)苷脂起了載體的作用。例如這樣的情況,在新型的神經(jīng)節(jié)苷脂中其N-?;鶃碜詫χ袠谢蛲庵苌窠?jīng)系統(tǒng)有活性的一種酸,如麥角酸及其類似物,或煙酸和異煙酸。這些酸在體外有一定的作用,但在體內(nèi)幾乎很少或一點也沒有作用。當(dāng)它們按本發(fā)明引入神經(jīng)節(jié)苷脂分子時,其作用在體內(nèi)顯示完全的程度。
本發(fā)明的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物因而可被用來取代天然產(chǎn)物或上述已知的半合成衍生物,它們在病人不能對常規(guī)產(chǎn)品起滿意的反應(yīng)或存在個體特異反應(yīng)或過敏反應(yīng)性的情況下是很有價值的。此外,由于對應(yīng)于N-?;乃岬奶厥馑幚碜饔?,它們可被用作載體。
充作按本發(fā)明制備新的?;?二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂基礎(chǔ)的溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類是可以從見于天然產(chǎn)物的神經(jīng)節(jié)苷脂脫?;@得的上面所有那些神經(jīng)節(jié)苷脂類,特別是在脊椎動物中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),也在腎上腺髓質(zhì),紅細(xì)胞、脾臟或其它器官發(fā)現(xiàn)的。它們可以是純化的神經(jīng)節(jié)苷脂類,如在文獻(xiàn)中以此術(shù)語定義的和以糖部分單一結(jié)構(gòu)所代表的,或者可以是多種神經(jīng)節(jié)苷脂的混和物。在被用作本發(fā)明衍生物的起始基礎(chǔ)的最重要的神經(jīng)節(jié)苷脂類中,可以提到的是那些例如在其分子中低聚糖由最多4個己糖殘基組成,糖的部分是單一的神經(jīng)節(jié)苷酯。己糖最好從由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成的一組(神經(jīng)節(jié)苷脂A組)中選擇。這組神經(jīng)節(jié)苷脂是例如從脊椎動物腦中提取的,見于“Gangliosides of the Nervous Systcm”in“Glycolipid Methodology”,Lloyd A.,Witting Ed.,American Oil Chemists Society,Champaign,Ⅲ.187-214(1976)(特別看表1),例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM4,GM3,GM2,GM1-Glc NAc,GD2,GD1a-Gal NAC,GTlC,GQ和GT1,特別是那些其低聚糖含有至少一個葡萄糖殘基或半乳糖殘基,含N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺,最好是下面的(神經(jīng)節(jié)苷脂B組)GM1Gal(1→3)GalNAC(1→4)Gal(1→4)Glc(1→1)神經(jīng)酰胺
GD1nGal(1→3)GalNAC(1→4)Gal(1→4)Glc(1→1)神經(jīng)酰胺
GD1bGal(1→3)GalNAC(1→4)Gal(1→4)Glc(1→1)神經(jīng)酰胺
GT1bGal(1→3)GalNAC(1→4)Gal(1→4)Glc(1→1)神經(jīng)酰胺
其中Glc代表葡萄糖,Gal NAC代表N-乙酰半乳糖胺,Gal代表半乳糖,NANA代表N-乙酰神經(jīng)氨酸。
本發(fā)明也包括新的N-?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類混和物,特別是從各種動物組織提取物(如“總”提取物或各種不同提取組份)中的神經(jīng)節(jié)苷脂混和物得到的N-酰基-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類混和物,如文獻(xiàn)中所述。此種文獻(xiàn)的例子包括前面提到的論文或上述刊物,P159-186(1976)中的論文“Extraction and analysis of materials containing lipid bound sialic acid”以及同一出版物p187-214,和德國專利No.2549680中的“Gangliosides of theNervous System”。在這些新混和物中,神經(jīng)節(jié)苷脂混和物的N-?;糠直簧鲜鲺;械囊粋€所取代,它們可按本發(fā)明的方法以獲得,如下文所公開的,通過神經(jīng)節(jié)苷脂混和物的脫酰化和隨后的再?;蛘哌x擇性地從神經(jīng)節(jié)苷脂的唾液酸部分的其它脫?;鶊F(tuán)的再酰化。在用作起始物的最重要的神經(jīng)節(jié)苷脂混和物中,有從神經(jīng)系統(tǒng),特別是從腦和已得到的含神經(jīng)節(jié)苷脂GM1,GD1a,GD1b和GT1b的神經(jīng)組織中得到的神經(jīng)節(jié)苷脂提取物。
如上所述,在本發(fā)明的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),在此處描述的半合成神經(jīng)節(jié)苷脂類似物及它們的上述功能性衍生物或鹽,基本上具有和天然神經(jīng)節(jié)苷脂或其類似物功能性衍生物相同的藥理作用,而就很多參數(shù)來說,其作用范圍不同。
這些改進(jìn)的神經(jīng)節(jié)苷脂對蛋白激酶C的激活也有抑制作用。
本發(fā)明的改進(jìn)的神經(jīng)節(jié)苷脂的上述藥理學(xué)性質(zhì)可用以下實驗加以說明。
在神經(jīng)元細(xì)胞的原始培養(yǎng)物中,刺激興奮性氨基酸(EAA)受體,促進(jìn)Ca+2流入增加和移位,隨后激活蛋白激酶C(PKC)從胞漿移向細(xì)胞膜。在顆粒細(xì)胞的原始培養(yǎng)物中加入谷氨酸鹽或暴露于缺氧條件下,引起細(xì)胞損毀,導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。急性腦局部缺血之后谷氨酸能神經(jīng)傳遞改變,觸發(fā)了一系列變化,如體外試驗所見,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
已知將神經(jīng)元原始培養(yǎng)物預(yù)先暴露于三唾液酸酰基-N-四糖基神經(jīng)酰胺(GT1b)或單唾液酸?;?N-四糖基神經(jīng)酰胺(GM1),可抑制PKC移位并防止谷氨酸鹽引起的細(xì)胞死亡。
結(jié)合試驗表明神經(jīng)節(jié)苷脂的作用機(jī)制與受體拮抗并無聯(lián)系。
這兒報告的是用下列神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物進(jìn)行的實驗,N'-3,4,5-三甲氧基苯甲酰基-N'-溶解性GM1(Ligade 5),N-(2-呋喃甲酰)-N-溶解性GM1(Ligade 34),N-(1-甲基-2-吡咯-羰基-N-溶解性GM1(Ligade 38),N-(2-噻吩乙?;?-N-溶解性GM1(Ligade 45),N,N'-二-苯乙酰基-二-溶解性GM1(Ligade 82),,N,N'-二-(2-吡啶乙酰基)-二-溶解性GM1(Ligadc 84),和N,N'-二-(5-甲基-2-噻吩羧基)-二-溶解性GM1(Ligade 85),這些化合物適用于評價對谷氨酸鹽引起的神經(jīng)元死亡的拮抗能力。
材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)用出生8天的Sprague Dawley大鼠的小腦顆粒細(xì)胞的原始培養(yǎng)物,含>90%的顆粒細(xì)胞,約5%的GABA能神經(jīng)元和<5%的膠質(zhì)細(xì)胞。在這些實驗中,細(xì)胞在培養(yǎng)的第12天使用。
用谷氨酸鹽誘發(fā)的神經(jīng)毒性將谷氨酸鹽(100μm,用無Mg+2洛氏液配制)加入至細(xì)胞中,室溫下放置15分鐘(對照組無谷氨酸);用洛氏液將培養(yǎng)物洗3次以除去過量谷氨酸,然后在原始培養(yǎng)基上重新輔成平板。
化合物的增溶、培養(yǎng)和分析方法將Ligade 5,34,38,45,82,84和85溶于氯仿/甲醇(2∶1),在氮氣中干燥,再懸于加Mg+2洛氏液,終濃度為5×10-6M,然后在誘發(fā)神經(jīng)毒性前15分鐘加入37℃培養(yǎng)物中。GM1同樣地增溶,終濃度1×10-4M,在暴露于-L-谷氨酸鹽前120分鐘加入細(xì)胞中。
24小時后,用MTT((3-4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑)比色法(D.O.570-630)估測細(xì)胞存活情況。
結(jié)果實驗表明Ligade 5,34,38,45,82,84和85在濃度為5×10-6M時(GM1在濃度1×10-4M時用于對照),在預(yù)防谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性上證明是有效的(P<0.05)(表1)。
應(yīng)當(dāng)注意的是,Ligadc衍生物在低于GM1所需濃度10倍的劑量下在短得多的時間后是有效驗的。
討論實驗所得結(jié)果清楚地表明,名為Ligade 5,34,38,45,82,84和85的新型神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物能夠拮抗在小腦顆粒細(xì)胞原始培養(yǎng)物上谷氨酸誘發(fā)的神經(jīng)毒性。
新衍生物的效應(yīng)特別令人感興趣,因為這是在相應(yīng)效應(yīng)水平上比GM1濃度低10倍以上時,并且在較短時的預(yù)培養(yǎng)后觀察到的。
關(guān)于這一效應(yīng),本發(fā)明的衍生物可被推薦用于谷氨酸能型損傷的急慢性病理學(xué)上,例如大腦局部缺血,創(chuàng)傷、癲癇、舞蹈病、巴金森氏疾病、老熟和癡呆,以及腦部疾病,低血糖和缺氧。在腦損害基礎(chǔ)上的某些機(jī)制,特別是關(guān)于神經(jīng)毒性,對于其它系統(tǒng)的損害也是常見的,例如神經(jīng)心血管系統(tǒng)。
表1.在小腦顆粒細(xì)胞原始培養(yǎng)物中外源性谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性模型上Ligade 5,34,38,45,82,84和85的保護(hù)作用。
細(xì)胞存活化合物 MTT(DO570-630)對照含Mg+2洛氏液 0.156±0.021L-谷氨酸 0.103±0.004L-Glu+Ligade 5 0.147±0.01434 0.126±0.00338 0.131±0.00345 0.138±0.00682 0.165±0.00684 0.151±0.00785 0.126±0.008
+GM10.133±0.018顆粒細(xì)胞在培養(yǎng)的第12天使用,在室溫下暴露于100μM L-谷氨酸鹽(L-Glu)15分鐘。在神經(jīng)毒性誘導(dǎo)前15分鐘,加入溶于洛氏液,終濃度為5×10-6M的Ligade衍生物,而GM1為1×10-4M預(yù)培養(yǎng)120分鐘。GM1和Ligade衍生物相對于L-Glu P<0.05。
鑒于上面描述的藥理學(xué)性質(zhì),上述半合成神經(jīng)節(jié)苷脂類似物可被用作治療下列疾病的藥物。大腦局部缺血,代謝性腦病如低血糖和缺氧,毒物源性腦病,創(chuàng)傷,衰老,癲癇、神經(jīng)變性性疾病如巴金森氏疾病和亨廷頓舞蹈病,以及精神性疾病。
最好配成適當(dāng)緩沖的水溶液,注射給藥,肌注,皮下注射,靜注,經(jīng)皮或經(jīng)肺給藥。將該藥物配制成含衍生物的溶液,和其它可選擇的輔助成分放于小瓶中,可確保其安全貯存。如下文在本發(fā)明的藥物制劑實例中所示。為治療或也可能作為預(yù)防,上述胃腸外途徑應(yīng)用,其劑量宜在每天每公斤體重0.05mg-5mg內(nèi)變動,特別是在每天每公斤體重0.05mg 2mg之間。
雖然根據(jù)本發(fā)明,新的治療應(yīng)用一般適合于和神經(jīng)傳導(dǎo)損害相關(guān)聯(lián)的全部病理過程,但可特別提及下面這些眼球后視神經(jīng)炎,眼球運(yùn)動神經(jīng)麻痹、三叉神經(jīng)痛、而神經(jīng)麻痹、面癱、Garcin's綜合癥,外周神經(jīng)創(chuàng)傷性損害、糖尿病性和酒精性多神經(jīng)炎、產(chǎn)科性麻痹、麻痹性坐骨神經(jīng)痛、運(yùn)動神經(jīng)元疾病、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓病性肌萎縮、進(jìn)行性延髓性麻痹、重癥肌無力和Lambert Eaton's綜合癥、肌營養(yǎng)障礙,中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)突觸神經(jīng)傳遞減弱,意識缺陷如精神混亂、震蕩、血栓形成和栓塞。
本發(fā)明也包括以下化合物新?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類的唾液羧基功能性衍生物,即酯類和酰胺類,和在唾液羧基與低聚糖的羥基間有內(nèi)酯鍵的內(nèi)酯類,與神經(jīng)節(jié)苷脂類衍生物及神經(jīng)節(jié)苷脂羥基上的全?;苌锵嗨?,酰基-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類和上述它們的功能性衍生物,所有新酰基-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類及其功能性衍生物的鹽。這些唾液酸功能性衍生物可用相應(yīng)神經(jīng)節(jié)苷脂上述各專利中介紹的方法,從新的?;?二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類獲得。
本發(fā)明也特別包括這些衍生物的混合物,如按本發(fā)明從?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類混和物得到的,后者又是從上述神經(jīng)節(jié)苷脂混合物得到的。
本發(fā)明的新N-酰基-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物的酯基特別來源于下列醇(1)脂肪族類尤其是有最多為12個碳原子主要是有6個碳原子的醇,(2)芳脂族的醇,最好只帶一個苯環(huán),可任意被1-3個低級烷基(C1-4)如甲基取代,在脂肪鏈上最多有4個碳原子,(3)脂環(huán)類或脂肪族脂環(huán)類的醇,只帶一個環(huán)脂肪族環(huán),最多14個碳原子,(4)雜環(huán)類醇,有最多12個主要是6個碳原子,只有一個雜環(huán),上面只有一個由N,O和S組成的基團(tuán)上來的雜原子。本發(fā)明的N-?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物上羧基功能團(tuán)的酰胺基來自于氨和任一類胺,最好有最多12個碳原子。
上述醇類和胺類可以是未取代的或取代的,尤其是被來自下列基團(tuán)的化合物的功能團(tuán)所取代羥基,在烷基上有最多4個碳原子的氨基或烷氧基,在烷基殘基上有最多4個碳原子的羧基或烷酯基,在其烷基上有最多4個碳原子的烷氨基或二烷氨基,上述醇和胺可以是飽和的或不飽和的,尤其是只帶一個雙鍵的。
使本發(fā)明所得N-?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的羧基功能基團(tuán)酯化的醇可以是單價或多價的,特別是二價。在脂肪族的醇中應(yīng)特別提及有最多6個碳原子的低級醇,如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇、正丁醇、異丁醇和叔丁醇,以及二元醇乙二醇和丙二醇。在芳香脂肪族中的醇應(yīng)特別提及有一個單苯環(huán)的,如苯甲醇和苯乙醇。在脂環(huán)類醇中優(yōu)先權(quán)應(yīng)給予只有一個環(huán)脂肪族環(huán)的醇,如環(huán)己醇或萜烯醇,如
烷醇或香芹
醇,或萜品醇或薄荷醇之一。
在雜環(huán)類的醇中,應(yīng)特別提及四氫呋喃醇或四氫吡喃醇。為了酯化N-?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的羧基,還可用取代的脂肪醇,如被氨基功能團(tuán)取代,例如氨基醇,如最多帶有4個碳原子的氨基醇尤其是帶有二烷基(C1-4)-氨基的氨基醇,如二乙氨基乙醇。
按照本發(fā)明的羧酰胺功能團(tuán)來自氨(在這種情況下酰胺是未取代的-CONH2)或來自伯胺或仲胺,尤其是含最多為12個碳原子的。這些胺可以是芳香族的,雜環(huán)類或脂環(huán)類的,但最好是脂肪族的。本發(fā)明的最佳對象是有最多12個碳原子的脂肪族胺類的羧酰胺衍生物,其中的胺可以是開鏈、直鏈或支鏈的或環(huán)狀的,例如來自有1-6個碳原子的烷基的烷胺,如甲胺、乙胺、丙胺、己胺、二甲胺、二乙胺、二-異丙胺、二己胺,或來自有3-6個碳原子的直鏈亞烷基的亞烷胺類,或相應(yīng)的鏈被1-3個甲基取代的,如吡咯烷、哌啶和氮雜草。這些胺的烷基或亞烷基,在碳原子鏈上可被中斷或被其它雜原子特別是氮原子所取代。這樣的話,本發(fā)明的酰胺來自二胺類,如乙二胺、丙二胺或哌嗪。如果烷基或亞烷基被氧或硫原子中斷或取代,酰胺就代表氨基醇的衍生物,例如氨基乙醇或氨基丙醇,或從嗎啉或硫代嗎啉得來的氨基醇。
依照本發(fā)明,特別有趣的是來自上述神經(jīng)節(jié)苷脂A組和B組的N-?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類及其混合物的酯和酰胺。
本發(fā)明也包括在此所述的酯和酰胺的糖部分,唾液酸和神經(jīng)酰胺的羥基上全?;难苌铩_@些衍生物中,酰基可來自于脂肪族、芳香族、芳脂族、脂環(huán)類或雜環(huán)類的酸。它們最好來自有最多10個碳原子特別是6個碳原子的脂肪族類,例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸類、戊酸、己酸或癸酸。它們也可來自例如有同樣數(shù)目碳原子但被取代的酸類,特別是被羥基酸如乳酸取代,被氨基酸如甘氨酸取代,或被二元酸如琥珀酸、丙二酸或順丁烯二酸取代。
在芳香族酸中應(yīng)當(dāng)提到只有一個苯核的,特別是苯甲酸及其帶甲基、羥基、氨基或羧基基團(tuán)的衍生物,如對氨基苯甲酸、水楊酸或苯二甲酸。
本發(fā)明也包括前面介紹的N-?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂類及其混合物的全?;苌铮珟в杏坞x的羧基功能團(tuán)。對于這些衍生物,特別重要的是從此處列出的酸中得到的?;苌铩L貏e要提到的一組新衍生物是由在羥基上酯化或轉(zhuǎn)為酰胺或全?;纳窠?jīng)節(jié)苷脂類所組成,它的酯基來自有最多6個飽和碳原子的脂族醇,未被取代或被下列基團(tuán)取代羥基、最多有4個碳原子的烷氨基、氨基、在烷基上最多有4個碳原子的烷氨基或二烷氨基、羧基、在烷基殘端上有最多4個碳原子的烷酯基,或被下列醇類取代至多帶一個雙鍵的相應(yīng)醇類,只帶一個未取代或被1-3個甲基取代的苯環(huán)的芳脂醇,只帶一個環(huán)己烷環(huán)的環(huán)脂肪醇或脂肪基環(huán)脂肪醇(環(huán)上未取代或被1-3個甲基取代,脂肪鏈上最多有4個碳原子)、四氫呋喃醇或四氫吡喃醇。
在此處的酰胺基可能來自氨,或在烷基上最多有6個碳原子、在亞烷基上有4-8個碳原子的烷氨基、二烷氨基或亞烷氨基,其中烷基或亞烷基在碳原子鏈上可被選自由氮、氧和硫形成的基團(tuán)的雜原子所中斷,氨基有時可能是-NH-,這里的氮原子被最多4個碳原子的烷基取代,和/或它們可被選自由氨、最多含4個碳原子的烷氨或二烷氨基團(tuán)形成的化合物的基團(tuán)所取代,或被羥基或在烷基上最多有4個碳原子的烷氧基所取代,或被只有一個苯環(huán)的芳香脂肪胺取代,而此處的酯化羥基的?;鶆t來自最多有6個碳原子的飽和和或不飽和脂肪酸,它也可被由羥基、氨基和羧基形成的化合物的功能團(tuán)或被它們的鹽所取代。
在新的半合成神經(jīng)節(jié)苷脂類似物的功能性衍生物中尤其應(yīng)提及上述新化合物的唾液酸酯,它們來自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、芐基、烯丙基、乙氧羰甲基,或環(huán)己醇,可提及的來自甲胺、乙胺、丙胺、二甲胺、二乙胺、吡咯烷、哌啶、哌嗪、嗎啉,或硫代嗎啉的唾液酸酰胺類,以及它們的全?;?、全丙?;铩⑷□;?、全馬來酰化物,全琥珀?;?,以及上述唾液酸酯類和酰胺類的全酰化類似物。
從芳香族、環(huán)脂族或雜環(huán)類的酸而來的N-酰基基團(tuán)可具有直接、或通過脂肪族的亞烷基(RCH)殘基,連接于神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物的神經(jīng)氨或神經(jīng)鞘氨醇?xì)埢碾寤?NH-CO-上的環(huán)狀系統(tǒng)。因而在本發(fā)明范圍內(nèi),上述術(shù)語既包含象這樣的芳香族、脂環(huán)或雜環(huán)酸的衍生物(即直接連接在脲基上的),也包含芳香脂肪族、脂肪族、脂環(huán)族和脂肪雜環(huán)酸。這些烴基殘基的環(huán)當(dāng)然可接著被脂肪烴基所取代。上述脂肪鏈也可被雜原子中斷,例如選自N、S和O形成的基團(tuán)的雜原子。環(huán)狀系統(tǒng)可為單環(huán)或多環(huán),后者最好是二環(huán)。酸類可以是一元或多元的,在后一種情況最好是二元的。
本發(fā)明的化合物的N-?;鶊F(tuán)最好具有6-24個碳原子,可含一個或一個以上環(huán)狀系統(tǒng),但最好只有一個,環(huán)狀系統(tǒng)本身可選擇地被脂肪族烴基尤其是烷基,最好是含最多6個碳原子的烷基所取代。N-酰基基團(tuán)的烴基殘基,既可在脂肪鏈部分也可在環(huán)上,被下列功能團(tuán)或改變的功能團(tuán)所取代,例如特別是鹵素(如氯、溴和氟)、游離或酯化的羥基、游離或酯化的氨基、或?;?、烷基或亞烷基、游離或催化的氧化基團(tuán)、肟類或取代肟、腙或取代腙、游離或醚化的巰基、游離或取代的硫酰胺基團(tuán)、游離或酯化的磺?;?、亞砜基、硝?;蛳趸?。羥基或氨基的酯可從脂肪類、芳脂類、脂環(huán)類或雜環(huán)類的酸得到。這樣的酯基首先是從治療上可接受的酸而得到。脂肪族酸最好是含最多8個碳原子的較低級酸,如乙酸、丙酸、丁酸、或戊酸如異戊酸,或它們的取代衍生物,例如羥基酸(如羥乙酸,或α-或β-羥丁酸、乳酸),或氨基酸(例如天然氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸,或苯基甘氨酸),或二元酸(如丙二酸、琥珀酸、順丁烯二酸或蘋果酸),它們也可被選擇地取代。
芳香族系列的酸是例如苯甲酸或其被1-3個較低級烷基、羥基或較低級烷氧基、或被鹵素如氯、溴或氟取代的衍生物。在芳香脂肪類酸中首先應(yīng)提及只有一個苯環(huán)的,如苯乙酸或苯丙酸,如前所述可選擇地被取代。脂環(huán)類酸最好是有5或6個碳原子的環(huán),如環(huán)己烷碳酸和環(huán)己烷二碳酸。雜環(huán)類酸是今后要報告的,但最好是只有一個雜環(huán)基團(tuán)的簡單酸,例如,吡啶的衍生物如煙酸或異煙酸或吡咯烷碳酸。
能代表羥基或巰基的醚化基團(tuán)的醚化組份的合適的醇是所有以上所列的關(guān)于唾液酸羧基的酯,以它們功能性衍生物的形式作為本發(fā)明的?;芙庑陨窠?jīng)節(jié)苷脂部分。較佳的是低級脂肪族或芳基脂肪族醇,在其脂肪族部分最多4個碳原子。在氨基上作為取代基,或在取代的縮酮,乙縮醛或酮基中或在酯化羧基中的烷基或芳烷基優(yōu)先在其脂肪族部分最大為4個碳原子和一個苯環(huán),它可任意被取代如前所述。同樣最大數(shù)目的碳原子也存在于所有在以前稱作“較低級”脂肪族基團(tuán)中。較低級亞烷基,能取代氨基,這樣形成飽和雜環(huán)基團(tuán),它系由那些具有4或5個碳原子所組成。
芳香酰基最初從只有一個芳香環(huán)的酸衍生,如苯甲酸及其取代的衍生物,此衍生物由一個或更多個,尤其是1到3個基團(tuán),從由烷基,羥基,氧代,氨基,巰基,羧基和磺基組成的組中選出的,這些基團(tuán)可以是沒有修飾或功能上經(jīng)修飾的,或鹵素,如前所述所取代。這些例子包括苯甲酸、水楊酸,對氨基苯甲酸,甲苯甲酸的三種同分異構(gòu)體,鄰苯二甲酸,間苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿?,對羥基苯甲酸,原兒茶酸,茴香酸,香草酸,藜蘆酸,胡椒基酸,二羥基苯甲酸,苔色酸,焦棓酸,對氨磺酰苯甲酸,2,6-二甲氧基苯甲酸,3,4,5-三甲氧基苯甲酸,2-氯代苯甲酸,3-氯代苯甲酸,4-氯代苯甲酸,4-乙酰胺基苯甲酸,N-乙酰鄰氨基苯甲酸,3-氨基-苯甲酸,4-氨基苯甲酸,2-氨基-4-氯代苯甲酸,4-氨基-2-氯代苯甲酸,3-氨基-4-甲氧基苯甲酸,4-丁氧基苯甲酸,4-丁基苯甲酸,2-氯代-5-甲基硫代苯甲酸,4-氯代苯氧基乙酸,4-氯代-3-氧磺?;郊姿幔?-氰基苯甲酸,2,3-二氯-苯甲酸,2,4-二氯苯甲酸,2,5-二氯苯甲酸,2,6-二氯苯甲酸,3,4-二氯苯甲酸,3,5-二氯苯甲酸,4-二乙基氨基苯甲酸,3,4-二氟苯甲酸,4-乙氧苯甲酸,2-氟代苯甲酸,4-氟代苯甲酸,4-氟代苯氧基乙酸,4-庚基苯甲酸,2-(4-羥基苯氧基)丙酸,4-甲基硫代苯甲酸,苯氧基乙酸,2-磺基苯甲酸,和2-三氟-0-甲苯甲酸。
這些?;部蓮挠袔讉€苯環(huán)的酸衍生而來,苯環(huán)稠合或沒有稠合,或從有苯環(huán)和其它環(huán)狀烴基,如脂環(huán)或雜環(huán)殘基的酸衍生而來,如萘甲酸,對氨基萘甲酸,對羥基萘甲酸,萘二甲酸,二苯基-0,0'-二碳酸,3-甲基茚-2-羧酸和2-乙氧基-1-萘甲酸。
在芳基脂肪族中,可有如上提到只有一個苯環(huán)的,如前所述可選擇地替代的,其中脂肪族鏈優(yōu)先具1到6個碳原子。這些酸可以是直鏈或支鏈的,飽和或未飽和的,也可被前述一個功能或它們的衍生物所取代,和/或能從N,O和S組中選出的雜原子所中斷,或由其它芳香基或雜環(huán)或脂環(huán)核所中斷。此種類型的特定酸有,如苯基乙酸,水溶酸,肉桂酸,苯丙炔酸,胡椒酸,扁桃酸,3-(4-氟代-苯甲?;?-丙酸,α-氟代肉桂酸)-4-氟代肉桂酸,3-氟代-4-羥基苯基乙酸,4-氟代苯氧基乙酸,α-氟代苯基乙酸,4-羥基扁桃酸,(+)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸,1-萘氧基乙酸,苯氧基乙酸,4-苯氧基苯甲酸,3-三氟代甲基肉桂酸,4-三氟甲基扁桃酸,α,α,α-三氟代-對甲苯乙酸,3,4,5-三甲氧基-肉桂酸,苯基甘氨酸,D-4-羥基苯基甘氨酸,α-磺基苯乙酸,4-羥基苯基丙二酸,α-氨基-3,4-二-羥基苯乙酸,4-氨基肉桂酸,N-苯甲?;?L-蘇氨酸,芐基硫代羥基乙酸,4-溴代扁桃酸,氯代乙?;野彼?,2-氯代-6-氟代苯乙酸,4-氯代苯氧基乙酸,反式肉桂酸,3-(4-氟代苯甲酰基)-丙酸,4-氟代苯乙酸,DL-4-羥基扁桃酸,2-(4-羥基苯氧基)-丙酸,(S)-(+)-α-甲氧基苯乙酸,(R)-(+)-α-甲氧基-α-(三氟代甲基)-苯乙酸,和(S)-(-)-α-甲氧基-α-(三氟代甲基)-苯乙酸。
脂環(huán)酰基最初從含1到3個脂環(huán)的酸衍生,脂環(huán)優(yōu)先從那些具5到7個環(huán)碳原子中選出,任意由芳香烴殘基取代,如苯或萘,或脂肪族殘基,如烷基或鏈烯基,優(yōu)先具1到6個碳原子,或由羥基,氧代,氨基或羧基,以上這些基團(tuán)是沒有或經(jīng)功能性修飾的,如前所述。從這些脂環(huán)酸衍生的那些基團(tuán)中,羧基直接取代一個或多個環(huán)上氫原子,或者它可在上述一個脂環(huán)族烴基中發(fā)現(xiàn),因此提供脂環(huán)-脂肪族酸。在此情況下,這些脂環(huán)脂肪族酸中的脂肪族鏈由那些上面為芳基脂肪酸列出的功能所取代,或它能被先前所提到的雜原子所阻斷。對此系列專一的酸有,如環(huán)丙烷羧酸,環(huán)丁烷羧酸,環(huán)己烷羧酸,1-氨基-1-環(huán)己烷羧酸,環(huán)戊烷羧酸,2,2-二氯-1-甲基環(huán)丙烷-羧酸,1-甲基-1-環(huán)己烷羧酸,3-正-金剛烷-羧酸,1-苯基-1-環(huán)丙烷羧酸,(±)-1-苯并環(huán)丁烯羧酸,(1S)-(-)-烷酸,(+)-樟腦羧酸,(-)-異冰片乙酸,(-)-甲氧基-乙酸,5-甲氧基-1-(2,3-二氫-1-茚酮)-3-乙酸,3-甲基-1-金剛烷乙酸,3-甲基茚-2-羧酸,2-降冰片烷乙酸,1,2,3,4-四氫-2-萘甲酸,1-金剛烷乙酸,環(huán)庚烷羧酸,和環(huán)己烷丁酸。
為本發(fā)明目的服務(wù)的特定感興趣的一組包括甾類酸,如膽酸和膽甾烷酸,如膽烷酸,膽酸,石膽酸,脫氧膽酸,及各自相應(yīng)的乙二磺酸(ethio-acids),這些乙二磺酸從雄甾烷或孕烷或從它們在4,5-位未飽和衍生物衍生的。
含?;碾s環(huán)殘基可從此系列酸所衍生,可為三環(huán)或八環(huán)的,優(yōu)先在戊和庚環(huán)烷的之間,以及可含從0,N和S組中選出的一到四個雜原子,可為飽和的或不飽和的,尤其是有一個雙鍵的芳香系統(tǒng)。而且,它們能夠被一或更多組已叫作芳香或脂環(huán)?;幕鶊F(tuán)所取代。尤其它們能被脂肪族烴基取代,特別是最大為6個碳原子的烷基,它們也能在碳鏈中被以上所述的一個雜原子所中斷。此類中的雜環(huán)基團(tuán)也可被脂肪族酸,脂環(huán)或芳基脂肪族酸取代,在這種情況下,同樣地脂肪族鏈可被以上所述基團(tuán)中的一個所取代,如氨基,羥基,沒有或有功能修飾磺基或磺酰胺基,或者它們可以上述方式被其它雜原子所中斷。
尤其需要提到的是從雜環(huán)單環(huán)酸衍生的酰基,如吡咯,吡唑,咪唑,噻吩,呋喃,吡喃,吡啶,嘧啶,吡嗪,噻喃,噁唑,異噁唑,噻唑,異噻唑,三唑,四唑,三嗪和那些由這些雜環(huán)與苯或萘環(huán),或與此類型的幾個芳環(huán)稠合得到的,尤其如吲哚,中氮茚,香豆素,硫茚,咔唑,吲唑,苯并咪唑,苯并異噻唑,苯并噻唑,喹啉,異喹啉,吖啶,菲啶,苯并吡喃,噌啉,2,3-二氮雜萘,喹唑啉,吩嗪,吩噁嗪,吩噻嗪和酚嗪,以及那些由一個或多個上述雜環(huán)化合物與其它雜環(huán)和/或芳環(huán)或苯環(huán)稠合而衍生的。
最后,考慮從生物堿衍生的上述酸類。這些酸優(yōu)先是已知的具生物或治療-藥學(xué)意義的酸。
根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)鞘氨醇和/或神經(jīng)氨糖酸的?;蓮纳鲜鲭s環(huán)類型的酸化合物衍生,其中存在芳香型的雙鍵,如在吡啶或吡唑中的,或從相應(yīng)的衍生物,部分或完全氫化的衍生,如哌啶或哌嗪。以下是這些酸的特定例子2-呋喃甲酸,3-呋喃甲酸,2-噻吩乙酸,2-氨基-4-噻唑乙酸,煙酸,異煙酸,吡啶甲酸,7-茶堿乙酸,2-氨基煙酸,6-氨基煙酸,5-氨基乳清酸,(S)-(-)-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸,5-溴代煙酸,5-氯代吲哚-2-羧酸,6-氯代煙酸,噌啉-4-羧酸,L-組氨酸,N-乙?;?L-組氨酸,N-乙酰基-L-色氨酸,3-氨基-4-吡唑羧酸,3-氨基-1,2,4-三唑-5-羧酸,5-苯并咪唑羧酸,2-苯并呋喃羧酸,(
)-生物素,2-氯代煙酸,2,4-二羥基嘧啶-5-羧酸,5-氟代吲哚-2-羧酸,2-呋喃丙酸,5-乙內(nèi)酰脲乙酸,5-羥基吲哚-3-乙酸,5-羥基-2-吲哚羧酸,6-羥基煙酸,4-咪唑乙酸,5-甲氧基吲哚-3-乙酸,5-甲氧基吲哚-2-乙酸,5-甲氧基-2-甲基-3-吲哚乙酸,4-甲氧基-2-喹啉羧酸,Kinurenic acid,硫代Kinurenic酸,7-氯代Kinurenic酸,氯代硫代Kinurenic酸,氟代硫代Kinurenic酸和三氟甲基硫代Kinurenic酸,1-甲基吲哚-2-羧酸,6-甲基煙酸,N-甲基-L-脯氨酸,1-甲基-2-吡咯羧酸,3-甲基-2-噻吩羧酸,5-甲基-2-噻吩羧酸,niflumic酸,5-硝基-2-呋喃甲酸,(-)-2-氧代-4-噻唑烷羧酸,1-哌啶丙酸,2-吡嗪羧酸,4-吡唑羧酸,4-噠嗪羧酸,2-吡啶基乙酸,3-(3-吡啶基)-丙烯酸,4-吡啶基硫代乙酸,(2-嘧啶基硫代)乙酸,喹哪啶酸,3-喹啉羧酸,4-喹啉羧酸,4-(2-噻吩基)-丁酸,3-噻吩乙酸,2-噻吩乙酸,2-(甲基硫代)-煙酸,4-吡啶基硫代乙酸,四唑-1-乙酸,α-氧代-2-呋喃乙酸,(甲氧基氨基)-2-呋喃乙酸,2-α-(甲氧基氨基)-4-噻唑乙酸,α[[(4-乙基-2,3-二氧代-1-哌嗪)羰基]氨基]-苯乙酸,1,3-二噻烷-2-羧酸,3-(2-氯代苯基)-5-甲基-4-異噁唑羧酸,3-(2-氯代-6-氟代苯基)-5-甲基-4-異噁唑羧酸,和3-(2,6-二氯苯基)-4-異噁唑羧酸。
在本發(fā)明的N-和N'-?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂中,?;且陨纤f的芳基,脂環(huán),芳基脂族或雜環(huán)系列中的基團(tuán)。因此,至少一個酰基,是在神經(jīng)鞘氨醇的氮和神經(jīng)氨糖酸的氮上的兩個,都必須是這個性質(zhì)的。在N,N'-二?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂上,兩個?;伎蓮纳鲜鏊嵫苌瑢Ρ景l(fā)明來說這種化合物尤其重要,因為它們?nèi)菀字苽洹?br>
在N,N'-二?;苌镏校粋€?;部蓮娘柡突虿伙柡椭咀逅嵫苌〈蛭慈〈?,優(yōu)先為1到24個碳原子,這些酸可為具有1到11個碳原子,直鏈或具有支鏈的低級酸,如甲酸,乙酸,丙酸,丁酸,戊酸,尤其如正戊酸和異戊酸,新戊酸,己酸和異乙酸,庚酸,辛酸,壬酸,癸酸和十一酸,二-叔-丁基乙酸和2-丙基戊酸。不飽和酸可為當(dāng)歸酸和惕各酸。合適的較長鏈酸包括那些直鏈的,尤其是有12到16個碳原子的酸,如月桂酸,肉豆蔻酸和棕櫚酸。含更高碳組分的那些包括如油酸,反油酸,十八酸,二十烷羧酸和二十二碳烷酸。在有支鏈的酰基中,支鏈優(yōu)先為最大為4個碳原子的低級烷基,尤其是甲基。
尤感興趣的是N,N'-二酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,其中在神經(jīng)氨糖酸氮上的脂肪族酰基是如在天然神經(jīng)節(jié)苷脂上的混合?;?,即大部分是乙?;?,少數(shù)分是乙醇?;?,其中神經(jīng)氨糖酸殘基上的羥基也任意被酰化。這種衍生物是這樣獲得的在神經(jīng)節(jié)苷脂的神經(jīng)鞘氨酸氮上進(jìn)行選擇性水解,同以上所述芳香族,芳基脂肪族,脂環(huán)或雜環(huán)系列中的一種在N位?;鲜霁@得的N'-溶解性神經(jīng)節(jié)苷酯。
相似地,可以選擇性水解神經(jīng)節(jié)苷脂,在神經(jīng)氨糖酸氮上及在獲得的N'-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂中,在此位點用以上所述非脂肪酸的一種?;被?。從較高級脂肪酸衍生的混合?;?,如在天然神經(jīng)節(jié)苷脂中存在的,保留在神經(jīng)鞘氨醇氮上。這是本發(fā)明的較佳目的。
任意存在于神經(jīng)氨糖酸氮或鞘氨醇氮上的脂肪族?;部捎蓻]有功能性或功能性修飾的基團(tuán),優(yōu)先為功能極性基團(tuán)取代。優(yōu)先地,存在1到3個功能基,并從由羥基,氨基,酮基,巰基,羧基,磺基,磺酰胺,亞砜,或砜及硝?;蛳趸羞x出,及從這些基團(tuán)的功能衍生物如羥基,巰基,羧基,磺基,縮酮,縮醛,酮肟,醛氧基和腙基中選出的。這個類型的基團(tuán)可任意地與被具有在脂肪族部分1到6個碳原子,優(yōu)先只有一個苯環(huán)的低級脂肪族或芳基脂肪族烴基取代,如烷基胺,亞烷基胺,烷基巰基,烷基磺酰胺和烷基腙基。烴基的酯中可提到的尤其是那些無機(jī)氫酸,如鹵素,尤其是氯,氟和溴。
在本發(fā)明新的?;?二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂中,特別重要的是從天然神經(jīng)節(jié)苷脂衍生的N-酰基-N-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,如神經(jīng)節(jié)苷酯GM1,GD1a,GD1b,GT1b,GM2和GM3在這些衍生物中,神經(jīng)氨糖酸的酰基是那些存在于神經(jīng)節(jié)苷脂中的,如混合乙酰-乙醇?;阴;瞧胀ù嬖诘模渲型僖核岬牧u基任意由相應(yīng)酸酯化。它們從神經(jīng)節(jié)苷脂處獲得,通過涉及單獨鞘氨醇氮上的去?;拿杆猓巴ㄟ^隨后用芳香族,芳基脂肪族脂環(huán)族或雜環(huán)酸酰化的方法。以下是這些化合物的例子N-2,6-二甲氧基苯甲?;?N-溶解性GM1N-5-甲氧基-2,3-二氫-1-茚酮-3-乙?;?N-溶解性GM1N-苯乙酰基-N-溶解性GM1N-環(huán)丁烷羧基-N-溶解性GM1N-2-降冰片烷乙?;?N-溶解性GM1N-呋喃甲酰基-N-溶解性GM1N-咪唑乙?;?溶解性GM1N-6-甲基煙?;?N-溶解性GM1N-甲基脯氨酰-N-溶解性GM1N-1-甲基-2-吡咯羧基-N-溶解性GM1N-2-吡啶乙?;?N-溶解性GM1
N-4,4-吡啶硫代乙?;?N-溶解性GM1N-3-喹啉羧基-N-溶解性GM1N-四唑基-1-乙?;?N-溶解性GM1N-7-茶堿乙酰基-N-溶解性GM1N-2-噻吩乙?;?N-溶解性GM1N-3-氨基-1,2,4-三唑-5-乙?;?N-溶解性GM1N-乙酰基-DL-色氨酸乙?;?(α,α,α-三氟-甲苯胺)-煙酰-GM1N-5-海因乙?;?N-溶解性GM1N-5-羥基吲哚-3-乙?;?N-溶解性GM1N-2-氯代煙?;?N-溶解性GM1N-5-甲基-2-噻吩乙酰-N-溶解性GM1N-5-苯并咪唑乙?;?N-溶解性GM1N-5-羥基-2-吲哚乙酰-N-溶解性GM1N-3,4,5-三甲氧基苯甲?;?N-溶解性GM1N-環(huán)庚烷乙酰基-N-溶解性GM1N-環(huán)戊烷乙?;?N-溶解性GM1N-5-甲基-2-噻吩乙酰-溶解性GM1以及其它以前所述基本神經(jīng)節(jié)苷脂的相應(yīng)衍生物,以及所有這些化合物的內(nèi)酯。
N,N'-二?;?N,N'二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂是相應(yīng)于上述N-?;?N-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的衍生物,從以前所述的GM1或其它神經(jīng)節(jié)苷脂衍生而來,其中神經(jīng)氨糖酸氮上的氨基也由同樣的酸?;?,如N,N'二-環(huán)庚基乙?;?N,N'-二-溶解性GM1N,N'-二-環(huán)戊基羧基-N,N'-二-溶解性GM1
N,N'二-苯乙?;?N,N-二-溶解性GM1N,N'-二-吡啶乙?;?N,N'-二-溶解性GM1或N,N'-二(5-甲基-2-噻吩乙酰)-二-溶解性GM1從這兒所述的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1和其它基本的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生的N'-單?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的例子包含在例子中提到的?;?,其中?;谏窠?jīng)氨糖酸氮上而不是在鞘氨醇氮上對GM1N-單-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂有專一性。根據(jù)本發(fā)明的另外一組有興趣的化合物是如相應(yīng)于上述N-?;?N-溶解性GM1化合物的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物,其中在神經(jīng)氨糖酸氮上的“天然”混合?;删哂?到6個碳原子的脂肪族酸取代,例如戊酸或新戊酸,或此類型由鹵素取代的酸,即單氯代乙酸或二氯代乙酸,或具有12到18個碳原子的脂肪族酸,如十六酸,油酸或十八酸。
具有功能性修飾的唾液酸羧酸功能的化合物可為從具有1到6個碳原子的低級脂肪醇衍生的酯,如甲酯,乙酯或丙酯,從低級脂肪族胺衍生的酰胺,如甲胺,乙胺或丙胺或環(huán)胺,如哌啶或哌嗪,吡咯烷,所有以上所述特定化合物的內(nèi)酯,全?;铮阴;?,全丙酰化物,和全丁?;?即從具有1到6個碳原子的脂肪族酸衍生的?;?。
本發(fā)明的半合成神經(jīng)節(jié)苷脂類似物可用已知方法制備,通過?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂或它們的N-?;騈'-酰基衍生物,或任意地在鞘氨醇氮和神經(jīng)氨糖酸氮上選擇性將N,N'-二酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂去?;?。
為制備其中酰胺基是從同樣酸衍生的二-?;苌铮瑸楹啽闫鹨?,優(yōu)先在一次操作中用已知方法?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂??蓮纳窠?jīng)節(jié)苷脂或N-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂通過加堿水解得到二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷酯,如用四烷基銨氫氧化物,氫氧化鉀或其它。為制備其中酰胺基是從不同酸衍生的本發(fā)明產(chǎn)物,優(yōu)先用二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的N-或N'-單酰基衍生物做為起始材料。N-單-酰基-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂可通過選擇性?;瘡亩?神經(jīng)節(jié)苷脂獲得,因為鞘氨醇氨基比神經(jīng)氨糖酸氨基更具反應(yīng)活性。根據(jù)已知方法溫和地?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,如用肽化學(xué)中的?;椒ǎ色@得上述在鞘氨醇氮上的單?;苌铩=又詡鹘y(tǒng)方式在神經(jīng)氨糖酸氮上?;T诖饲闆r下獲得本發(fā)明產(chǎn)物的?;襟E包括一個二步?;磻?yīng)。
可用不同方法制備在神經(jīng)氨糖酸氮上衍生單?;幕衔?。可以,如從二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂出發(fā),繼續(xù)對鞘氨醇氨基進(jìn)行居間暫時保護(hù),如通過與卵磷脂的疏水性交互反應(yīng),或通過用合適的保護(hù)基?;S后用欲介入此位的酸的衍生物?;窠?jīng)氨糖酸上的氮,然后在鞘氨醇氮上去保護(hù),也可以用相同的酸酰化二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的二個氨基,然后使二酰基化合物暴露于酶的作用下,這些酶能選擇性地只裂解在鞘氨醇氮上的酰胺基,如用從神經(jīng)節(jié)苷脂獲得溶解性神經(jīng)節(jié)苷酯。一個例子是神經(jīng)鞘糖脂-神經(jīng)酰胺-去?;?見
圖1)
N-單酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂也可通過在神經(jīng)氨糖酸的氮上選擇性化學(xué)水解去酰化N,N'-二酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,如用0.1摩爾醇?xì)溲趸洝?br>
在獲得的?;?二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂中,如需要的話,可以功能性地轉(zhuǎn)換唾液酸的羥基或這些酸的羥基。如,這些基團(tuán)可能轉(zhuǎn)變?yōu)轷セ蝓0?,這些基團(tuán)中的羥基用酸酯化(全酰化物)。
根據(jù)本發(fā)明制備N-?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,N'-酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂和N,N'-二?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的步驟包括用對應(yīng)于上述?;乃狨;疦,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,N-酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷酯或N'-酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂,或在鞘氨醇氮上或神經(jīng)氨糖酸氮上,或這些化合物的混合物上,選擇性地去?;线m的N,N'-二酰基-N,N'-二?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷酯。如需要的話,所獲得的化合物可以轉(zhuǎn)化為酯,酰胺,或內(nèi)酯或羥基全酰化物。這些化合物也可轉(zhuǎn)化為合適的鹽。
根據(jù)上述步驟的N-?;磻?yīng)可以傳統(tǒng)方式進(jìn)行,如使起始產(chǎn)品與?;瘎钪匾氖撬岬墓δ苄匝苌锓磻?yīng),該衍生物的殘基是要導(dǎo)入的。因此,可用酸的功能性衍生物酰胺或鹵化物,?;饔脙?yōu)先在叔堿如吡啶或可力丁的存在下進(jìn)行。反應(yīng)可在無水條件下,在室溫或更高的溫度下進(jìn)行,優(yōu)越地根據(jù)Schotten Baumann方法,在有水條件下在無機(jī)堿存在下進(jìn)行。有些情況下,也可用酸的酯作為反應(yīng)性功能衍生物。?;捎美没罨然苌锏姆椒?,如在肽化學(xué)中所用的,如用混合酐的方法,或用可用碳化二亞胺衍生物獲得的衍生物,或者異噁唑鹽。
在各種方法中,最合適的如以下
1.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與酸的疊氮化物反應(yīng);
2.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與酸的?;溥蚍磻?yīng),該?;溥蚩赏ㄟ^酸與N,N'-羰基二咪唑反應(yīng)而得;
3.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與酸與三氟乙酸的混合酸酐反應(yīng);
4.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與?;确磻?yīng);
5.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與酸在碳化二亞胺(如二環(huán)己基碳化二亞胺)的存在下反應(yīng),也可選擇地使用材料如1-羥基-苯并三唑;
6.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與酸通過加熱反應(yīng),7.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與酸的甲基酯在較高溫度下反應(yīng);
8.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與酸的苯酚酯反應(yīng),如用對硝基苯酚所成的酯;和9.使溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物與一種酯反應(yīng),該酯從酸的鹽和1-甲基-2-氯代吡啶鎓碘之間交換而衍生的。
已注意到現(xiàn)在能夠在鞘氨
氮和神經(jīng)氨糖酸氮兩者上獲得選擇性部分?;?。圖1說明了步驟。
在N,N'-二酰基-N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂上的鞘氨醇的氮上去酰化的酶,如前所述可在用于神經(jīng)節(jié)苷脂的部分去?;臈l件下進(jìn)行,如在J.Biochem.,103,1(1988)中所述。N,N'-二?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的雙重去酰化成N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的反應(yīng)可在同樣方法下可用于制備去-N-?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂。如在下列文獻(xiàn)國所述,Biochemistry 24,525(1985);J.Biol.Chem.255,7657,(1980);Biol.Chem.Hoppe Scylcr 367,241,(1986);Carbohydr Research 179,393(1988);Bioch Bioph Res Comn 147,127(1987)。
以上所述的出版物在Carbohydr Rescarch 179中也描述了一種在神經(jīng)氨糖酸氮上選擇性全?;姆椒?,通過0.1M KOH在90%正丁醇中與神經(jīng)節(jié)苷脂GM3反應(yīng)而獲得。這個去?;饔靡部捎糜诒景l(fā)明的N,N'-二?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂以獲取N-?;?N,N'-二-溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂。當(dāng)然,在本發(fā)明范圍內(nèi)的制備方法還包括對本技術(shù)領(lǐng)域的人是明顯的化學(xué)等效物。
可用已知方法制備根據(jù)上述步驟獲得的新穎酰基溶解性神經(jīng)節(jié)苷酯的羧基或羥基衍生物,除去那些將具有改變神經(jīng)節(jié)苷脂的基本結(jié)構(gòu)的方法。這將排除掉用高度酸性試劑的方法,或者將在劇烈堿性或酸性條件下進(jìn)行的方法,或者也排除那些將導(dǎo)致對糖部分的羥基以不需要的烷基化作用的方法。
N-?;窠?jīng)節(jié)苷脂的酯化或它們的轉(zhuǎn)變成酰胺的反應(yīng)可以用例如關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂的美國專利4,713,374所述的進(jìn)行,本發(fā)明衍生物的內(nèi)酯的形成可以如同制備神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)酯那樣進(jìn)行,例如如美國專利4,593,091和歐洲專利0072722中所述。
這些內(nèi)酯不僅包括通過唾液酸羧基同糖類羥基形成內(nèi)酯化的化合物,還包括那些如包含在唾液酸羧基和唾液酸羥基之間形成內(nèi)酯環(huán)的化合物,因為后者依次與糖類部分結(jié)合,也包括其它可能的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。上述專利形成內(nèi)酯的方法包括使神經(jīng)節(jié)苷脂在不含水有機(jī)溶劑中在無水條件下用內(nèi)酯化試劑處理。合適的有機(jī)試劑包括二甲亞砜,二甲基甲酰胺,環(huán)丁砜,四氫呋喃,二甲氧基乙烷,吡啶或這些溶劑的混合物。合適的內(nèi)酯化試劑包括溶于有機(jī)溶劑中的碳化二亞胺,如二環(huán)己基碳化二亞胺,芐基異丙基碳化二亞胺,芐基乙基碳化二亞胺,2-氯代甲基吡啶的鹽,乙氧基乙炔和Woodward's試劑(N-乙基-5-苯基-異噁唑鎓-3'磺酸鹽)。較舊的方法利用在神經(jīng)節(jié)苷脂和乙酸或三氯乙酸或碳化二亞胺之間的反應(yīng),溶解在水中或者含水介質(zhì)中。所有這些方法也可用于制備新N-?;芙庑陨窠?jīng)節(jié)苷脂的內(nèi)酯中。對于羧基的“外部”酯化,即用上述的醇酯化,如可以使N-酰基溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂同所需醇反應(yīng),在一個離子交換劑的存在下,如Dowex 50-型樹脂,產(chǎn)率受同時形成內(nèi)酯限制,反應(yīng)時間相當(dāng)長。另一種酯化的方法包括使醇通過樹脂,該樹脂是Dowex-50 Wx8型(100-200篩孔,H+型),溶解洗脫液在同樣的醇中用相應(yīng)的重氮基鏈烷烴處理。
另一種合適的酯制備方法包括用醚化劑處理溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物的金屬鹽??捎脡A金屬或堿土金屬鹽,也可用其它任何金屬鹽。作為醚化劑,可用文章所說的那些,如尤其是各種無機(jī)酸的酯,或者是有機(jī)磺酸如氫酸的酯,即換句話說,烴基鹵化物,如碘甲烷,碘乙烷等,或者是烴基的中性硫酸酯或酸,亞硫酸酯,碳酸酯,硅酸酯,亞磷酸酯或烷基磺酸酯,如甲基苯并-或?qū)妆交撬狨?。反?yīng)可在合適的溶劑中,如一種醇中,優(yōu)先是對應(yīng)于欲導(dǎo)入的烷基的那種,但也在非極性溶劑中,如酮或酯中,如二氧雜環(huán)烷和二甲亞砜。
一種特別優(yōu)越的酯化方法包括用所需醇和它的相應(yīng)的醇鹽的混合物處理溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物的內(nèi)酯。反應(yīng)在相應(yīng)于醇的沸點的溫度進(jìn)行,但也可用較低溫度,這種情況下反應(yīng)時間略長。
可通過已知方法制備本發(fā)明溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的酰胺,尤其是通過以下方法(a)使N-?;芙庑陨窠?jīng)節(jié)苷脂衍生物的內(nèi)酯與氨或者胺反應(yīng);
(b)使N-?;芙庑陨窠?jīng)節(jié)苷脂衍生物的羧酸酯與氨或者胺反應(yīng);及(c)使N-?;芙庑陨窠?jīng)節(jié)苷脂衍生物與同氨或者胺活化的羧基反應(yīng)。
反應(yīng)(a)可通過直接處理而進(jìn)行,在有或沒有溶劑的存在下,使神經(jīng)節(jié)苷脂內(nèi)酯與氨或胺反應(yīng),其中酰胺需制備。反應(yīng)也可在較低溫度下進(jìn)行,如-5°到+10°,但優(yōu)先在室溫或更高,如在30°和120°之間反應(yīng)。作為溶劑,可用酮類,芳香族烴,二甲基甲酰胺,二甲亞砜,二氧雜環(huán)己烷或四氫呋喃。反應(yīng)(b)優(yōu)先在為反應(yīng)(a)描述的條件下進(jìn)行。除了為本發(fā)明所描述的酯,也可用其它酯,如帶苯酚的酯。
為根據(jù)(c)在反應(yīng)中活化羧基,可用肽化學(xué)領(lǐng)域中已知的方法,避免用涉及過酸或過堿情況的那些,那些會導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)苷脂分子的分解。如果起始神經(jīng)節(jié)苷脂是以如鈉鹽形式存在,建議首先用離子交換樹脂處理鹽,如Dowex型,或其它一個酸性離子交換劑。也可用在碳化二亞胺存在下縮合的方法,如二環(huán)己基碳化二亞胺,芐基異丙基碳化二亞胺,或芐基乙基碳化二亞胺,在1-羥基苯并三唑,或在N,N'-羰基二咪唑的存在下進(jìn)行。
糖的羥基,唾液酸部分及任意地神經(jīng)酰胺的酰化作用也可用已知的方法進(jìn)行,如用酸的鹵化物或用于?;乃狒?,優(yōu)先在一個叔堿的存在下,如吡啶或可力丁。結(jié)果獲得以上所述全?;苌?。根據(jù)本發(fā)明解釋的方法,也可以使去-N-乙酰溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂受?;饔?,在酰化后恢復(fù)在神經(jīng)氨糖酸上的乙酰氨基,這樣的?;饔靡部梢砸阎绞竭M(jìn)行。在這種情況下為N-?;饔眠x擇相對溫和的方法,這樣神經(jīng)氨糖酸的羥基保持不改變。?;摶鶊F(tuán),在鞘氨醇氮的?;磻?yīng)后進(jìn)行,可通過激烈方法進(jìn)行,如用酸酐。
最后,如前所述,在所有用以上方法獲得的能提供能成鹽的化合物中,可用已知方法使這些基團(tuán)成鹽,以獲取合適鹽衍生物。
本發(fā)明還涉及新衍生制備方法的修飾物,其中一個步驟可在任何階段被中斷,或從中間化合物開始進(jìn)行其余的步驟,或者其中起始化合物在原位形成。
也包括在本發(fā)明內(nèi)的是藥物制劑,其含有一個或多個新?;芙庑陨窠?jīng)節(jié)苷脂作為活性材料,尤其是以上所提到的。這兒提到的藥物制劑可以口服,直腸給藥非腸胃道、局部給藥或經(jīng)皮給藥。因此,它們可是固體或半固體型,如片劑,丸劑,膠狀膠囊,膠囊,栓劑和軟明膠膠囊。非腸道使用時,可用肌內(nèi),皮下或經(jīng)皮給藥形式,或者適合于輸注或靜脈內(nèi)注射的形式。因此,這些制劑可以活性化合物溶液或活性化合物的凍干粉末與一個或多個藥學(xué)上可行的賦形劑或稀釋劑混合,易于上述使用,而且具有與生理液體相適應(yīng)的滲透性。局部使用時,可以以噴霧劑形式,如鼻內(nèi)噴霧,表面供給的乳膏或軟膏,經(jīng)皮使用的合適制備的膏藥。
本發(fā)明制劑可用于動物或人體。對溶液,噴霧劑,軟膏,和乳膏來說優(yōu)先含0.01%到10%活性化合物重量,對固體型制劑優(yōu)先含5%到50%重量活性化合物。所給藥的劑量依賴于個體表征,所需作用及所選擇的給藥途徑。
本發(fā)明的另一方面通過治療上使用新穎?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂和先前所列并已知的那些而顯示。這種治療上使用包括所有以前所列出的情況,對人體用于注射(皮下或肌內(nèi))或經(jīng)皮或口服給藥,每天劑量為每公斤體重用0.05毫克到5毫克活性材料。
以下實施例說明本發(fā)明?;?溶解性神經(jīng)節(jié)苷脂的制備,以及含有它作為活性組分的藥物制劑,及其治療用途,這些實施例是說明性的,不能被認(rèn)為是限制本發(fā)明的。
實施例1N,N'-二-溶解性GM1將10g GM1溶解在200ml,3N氫氧化鉀中,在90℃進(jìn)行水解72小時。
然后冷卻該溶液并用鹽酸調(diào)節(jié)pH到6.5,讓它在4℃靜置18小時,然后把沉淀出來的脂肪酸過濾掉,將所得溶液對水滲析并濃縮至500ml,使它在51丙酮中沉淀。
將產(chǎn)物干燥并使用三氯甲烷/甲醇/氨水5N(55∶45∶10)混合物作為洗脫劑的高效能硅膠色譜層析。將含有產(chǎn)物的提取組分干燥然后再溶解在水中。用0.01N的氫氧化鈉將它的pH調(diào)到10,滲析,濃縮至100mg/ml,并在5倍體積的丙酮中沉淀。N,N'-二-溶解性GM的產(chǎn)量為5.7g(理論值的70%)。用三氯甲烷/甲醇/氨水5N(55∶45∶10)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得產(chǎn)品是單一的化合物,該化合物的比移值Rf=0.05(GM1=0.35)。
實施例2N-溶解性GM1將10g(6.37mM)GM1溶解在200ml 3N的氫氧化鉀中,在90℃進(jìn)行水解72小時。然后將該溶液冷卻并用鹽酸將pH調(diào)到6.5。讓它在4℃靜置18小時,然后把沉淀出來的脂肪酸過濾掉。對水滲析并濃縮到500ml,在5l丙酮中沉淀。
將含有N'-二-溶解性GM1和N,N'-二-溶解性GM1(20%)的產(chǎn)品真空干燥,然后再溶解在100ml二甲基甲酰胺中。將2.15g(6.37mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺溶解在20ml四氫呋喃中,然后將它慢慢加到上述產(chǎn)品溶液中去,在室溫下使其反應(yīng)1小時。其后加入3ml(31.85mM)乙酐和0.9ml(63.7mM)三乙胺。30分鐘以后,把12.5ml哌啶加入以除去保護(hù)基團(tuán)。該混合物在室溫下反應(yīng)18小時,在21丙酮中沉淀并干燥。將這樣得到的物質(zhì)溶解在1M碳酸鈉中,并在60℃保持1小時。使之滲析,濃縮到100mg/ml,并在5倍體積的丙酮中沉淀。
將產(chǎn)品通過一在甲醇中達(dá)到平衡的S瓊脂糖凝膠柱(H+型),它是用甲醇洗滌和通過10mM氯化銨-甲醇洗脫的N-溶解性GM1。收集含有產(chǎn)品的流份加以干燥并然后再溶解在水中。該溶液用0.01N的氫氧化鈉把pH調(diào)到10并滲析,濃縮到100mg/ml,并在5倍體積的丙酮中沉淀。
所得到的產(chǎn)品大約5g(理論值的60%)。用三氯甲烷/甲醇/氨水5N(55∶45∶10)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得該產(chǎn)品是單一的,其Rf=0.11。
實施例3N-環(huán)丁烷羰基-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)的溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在1ml二甲基甲酰胺和1.050ml(7.6mM)的三乙胺中,并將728μl(7.6mM)的環(huán)丁烷羰酰氯在室溫下加入。
縮合反應(yīng)系在室溫下進(jìn)行了四丁小時。反應(yīng)結(jié)束時,將該溶液在10ml乙酸乙酯的飽和水溶液中沉淀,過濾和真空干燥。
然后用硅膠色譜層析提純該產(chǎn)品,該硅膠色譜是以三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作洗脫劑的。
將各純?nèi)〗M分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析并濃縮到5ml,在50ml的丙酮中沉淀。
所得到的產(chǎn)品350mg(理論值的66%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得該化合物是單一的,該化合物的Rf=0.33(GM1=0.43;溶解性GM1=0.24)。
實施例4N-(2-降冰片烷乙?;?-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)的溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml的二甲基甲酰胺中,然后在0℃加入106μl(0.76mM)的三乙胺和降冰片烷乙酐,該降冰片烷乙酐是通過將1.1ml(7.6mM)的2-降冰片烷乙酸和939mg(9.12mM)的二環(huán)己碳化二亞胺溶解在20ml四氫呋喃中,在2小時以后把已形成的二環(huán)己脲過濾除去以后,新制備得到的。
該縮合反應(yīng)是在0℃和攪拌下進(jìn)行了18小時。反應(yīng)結(jié)束時,該溶液濃縮至1ml,在10毫升丙酮中沉淀并真空干燥。
產(chǎn)品隨后用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)的混合物作為洗脫劑作硅膠色譜層析而被提純。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,用蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml,并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品508mg(理論值的92%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得該化合物是單一的,其Rf=0.33(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24)。
實施例5N-苯乙酰-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)的溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,然后,在室溫下將溶解在2.5ml 2-甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)的三乙胺,260mg(1.9mM)的苯乙酸和194.2mg(0.76mM)的1-甲基-2-氯代吡啶碘鹽。
該混合物在室溫下反應(yīng)18個小時,然后在100ml丙酮中沉淀。將其過濾并干燥。產(chǎn)品以三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物為洗脫劑作硅膠色譜提純。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮至5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得到的產(chǎn)品354mg(理論值的65%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得該化合物是單一的,其Rf=0.37(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例6N-(2,6-二甲氧苯甲酰)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM1(按照實施例2制備)溶解在1ml二甲基甲酰胺中,然后在室溫下加入1.056ml(7.6mM)三乙胺和新鮮制備的二甲氧基苯甲酸酐,該二甲氧基苯甲酸酐是由2.76g(15.2mM)的2,6-二甲氧基苯甲酸和1.08g(3.8mM)的1-甲基-2氟吡啶對甲苯磺酸鹽在10ml二甲基甲酰胺/四氫呋喃(1∶1)中進(jìn)行反應(yīng)而制得。
該縮合反應(yīng)是在室溫攪拌下進(jìn)行了4小時。反應(yīng)結(jié)束時,將溶液濃縮至5ml,在50ml丙酮中沉淀,過濾并真空干燥。用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物為洗脫液作硅膠色譜層析。將提純部分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉收集,對蒸餾水滲析并濃縮到5ml,在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品506mg(理論值的90%)用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得該化合物是單一的,其Rf=0.35(GM1=0.43;溶解性GM1=0.24),在254nM讀取螢光訂數(shù)據(jù)。
實施例7N-(2-呋喃甲酰)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)的溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(3.8mM)的三乙胺,210mg(1.9mM)的2-β-呋喃甲酸和194.2mg(0.76mM)的1-甲基-2-氯吡啶碘鹽。
該混合物在室溫下進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在10ml丙酮中沉淀。將它過濾和干燥。該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜層析進(jìn)行提純。將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),以1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮至5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品402mg(理論值的75%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜測得該化合物是單一的,其Rf=0.37(GM1=0.43;溶解性GM1=0.24),在254nM下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例8N-(4-咪唑乙酰基)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)的溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)三乙胺,310mg(1.9mM)4-咪唑乙酸氫氯化物和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2氯吡啶。在室溫下反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,將其過濾和干燥。然后將該產(chǎn)品用用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜層析進(jìn)行提純。將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N的碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品352mg(理論值的65%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得化合物是單一的,其Rf=0.33(GM1=0.43;溶解性GM1=0.24)。
實施例9N-(1-甲脯氨?;?-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)的溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在3.5ml二甲基甲酰胺/水(2.5∶1)中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)的三乙胺,260mg(1.9mM)的N-甲基-L-脯氨酸和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。該混合物在室溫下反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾和干燥。該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作洗脫劑通過硅膠色譜層析進(jìn)行提純。將提純部分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮至5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品380mg(理論值的70%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜測得該化合物是單一的,其Rf=0.33(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24)。
實施例10N-(1-甲基-2吡咯羰基)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)三乙胺,220mg(1.9mM)1-甲基-2-吡咯羧酸及194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,將反應(yīng)混合物過濾并干燥。然后,將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品487mg(理論值的90%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.38(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例11N-(1-四唑乙酰)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)三乙胺,250mg(1.9mM)1-四唑乙酸和194.2mg(0.76mM)的碘化1-甲基-2氯吡啶。
該混合物在室溫下進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀。過濾并干燥。然后,將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑,通過硅膠色譜層析進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來。蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品472mg(理論值的87%)。
用三氯甲烷/甲醇氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得該化合物是單一的,其Rf=0.32(GM1=0.43;溶解性GM1=0.24)。
實施例12N-(2-噻吩乙?;?-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)三乙胺,270mg(1.9mM)噻吩乙酸和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾和干燥。然后,將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑,通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品383mg(理論值的70%)。
用三氯甲烷/甲醇氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.34(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例13N-(6-甲基煙酰)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM1(按照實施例2制備的)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)三乙胺,260mg(1.9mM)6-甲基煙酸和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
該混合物在室溫下進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,將其過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品218mg(理論值的40%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.38(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例14N-(-吡啶乙?;?-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)可溶性GM1(按照實施例2制備的)溶解在3.5ml二甲基甲酰胺/水(2∶5∶1)中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)三乙胺,330mg(1.9mM)2-吡啶-乙酸氫氯化物和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后,將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品327mg(理論值的60%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.35(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例15
N-(4-吡啶硫代乙酰)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM1(按實施例2制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)三乙胺,320mg(1.9mM)4-吡啶硫代乙酸和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品390mg(理論值的70%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.34(GM1=0.43,Lyso GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例16N-(3-喹啉羰基)-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM(按實施例2制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)三乙胺,330mg(1.9mM)3-喹啉羧酸和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
該混合物在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品358mg(理論值的64%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.35(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例17N-(7-茶堿乙?;?-N-溶解性GM1將500mg(0.38mM)溶解性GM1(按實施例2制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(7.6mM)三乙胺,460mg(1.9mM)7-茶堿乙酸和194.2mg(0.76mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品397mg(理論值的68%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.35(GM1=0.43,溶解性GM1=0.24),在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例18N-2,6-二甲氧苯甲酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mm)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向該溶液慢慢加入145mg(0.43mm)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-Succ)。在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物N-FMOC-二-溶解性GM1的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺、甲醇(1∶1),其后在0℃加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和0.40ml(3.96mM)三氟乙酸甲酯。在室溫下使其反應(yīng)三天。
向所得反應(yīng)混合物中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,向其中加入二甲氧苯甲酸酐(通過1.88g(7.6mM)2,6-二-甲氧苯甲酸和5.40mg(1.9mM)對甲苯磺酸氟甲基吡啶1∶1反應(yīng)新鮮制備。)該混合物在室溫下進(jìn)行反應(yīng)18小時,在100ml丙酮中沉淀,用5ml水收集并用0.01N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為9.0。
使其在室溫下反應(yīng)2小時以除去三氟乙?;?。將其滲析,濃縮到3ml并在15ml丙酮中沉淀。
所得的粗制品用三氯甲醇/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
把提純部分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=283mg(理論值的51%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.18。對茚三酮顯色法顯示陽性,并在254nm下讀取螢光計讀數(shù)。
實施例19N-2-吡啶乙?;?二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-Succ)。使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物N-FMOC-di-lyso-GM1的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在0℃加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和0.40ml(3.96mM)三氟乙酸甲酯,使其在室溫下反應(yīng)三天。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)的三乙胺,330mg(1.9mM)2-吡啶乙酸氫氧化物和194.2mg(0.76mM)碘化氯甲基吡啶。
使在室溫下反應(yīng)18小時,在50ml丙酮中沉淀,用5ml水溶解并用0.01N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為9.0。使該溶液在室溫下反應(yīng)2小時以除去三氟乙酰基。將其滲析,濃縮到3ml并在15ml丙酮中沉淀。
所得的粗產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=296mg(理論值的55%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析測得該化合物是單一的,其Rf=0.19,對茚三酮顯色法顯示陽性,并在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例20N-N'-二-環(huán)庚烷羰基-二-溶解性GM1將500mg(0.39mM)二-溶解性GM1(按實施例1制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的0.33ml(2.37mM)三乙胺,162μl(1.18mM)環(huán)庚烷羧酸和0.2g(0.7mM)碘化氯甲基吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶25∶4)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品407mg(理論值的68%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(60∶35∶8)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.32。
實施例21N-N'-環(huán)戊烷羰基-二-溶解性GM1將500mg(0.39mM)二-溶解性GM1(按實施例1制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的0.33ml(2.37mM)三乙胺,1,23ml(1.18mM)環(huán)戊烷羧酸和0.2g(0.79mM)碘化氯-甲基吡啶。
該混合物在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶25∶4)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸鎦水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品277mg(理論值的48%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(60∶35∶8)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.30(GM1=0.43,Lyso GM1=0.24)。
實施例22N-N'-二-苯乙酰-二-溶解性GM1將500mg(0.39mM)二-溶解性GM1(按實施例1制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的0.88ml(6.34mM)三乙胺,430mg(3.17mM)苯乙酸和0.2g(0.79mM)碘化氯-甲基吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶25∶4)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸鎦水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品564mg(理論值的95%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(60∶35∶8)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.32。在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例23N-N'-二-(5-甲氧基-1-(2,3-二氫-1-茚酮)-3-乙酰基)溶解性GM1將500mg(0.39mM)二-溶解性GM1(按實施例1制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的0.88ml(6.34mM)三乙胺,700mg(3.17mM)5-甲氧基-1-(2,3-二氫-1-茚酮)-3-乙酸和0.2g(0.79mM)碘化氯甲基吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶25∶4)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉收集,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品60lmg(理論值的91%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(60∶35∶8)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.33,(GM1=0.43,Lyso GM1=0.24)。在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例24N-N'-(2-吡啶乙酰基)-二-溶解性GM1將500mg(0.39mM)二-溶解性GM1(按實施例1制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的0.88ml(6.34mM)三乙胺,550mg(3.17mM)2-吡啶乙酸和0.2g(0.79mM)碘化氯甲基吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶25∶4)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品268mg(理論值的43%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(60∶35∶8)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.23。在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例25N-N'-二(5-甲基-2-噻吩-羰基)-二-溶解性GM1將500mg(0.39mM)二-溶解性GM1(按實施例1制備)溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的0.88ml(6.34mM)三乙胺,450mg(3.17mM)5-甲基-2-噻吩羧酸和0.2g(0.79mM)碘化氯甲基吡啶。
在室溫進(jìn)行反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶25∶4)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,對蒸鎦水滲析,然后濃縮到5ml并在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品509mg(理論值的85%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(60∶35∶8)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.33。在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例26N-乙?;?N'-2-吡啶乙?;?二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(接實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在室溫加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)三乙胺,330mg(1.9mM)2-吡啶乙酸氫氯化物和194.2mg(0.76mM)碘化氯甲基吡啶,該混合物在室溫下反應(yīng)18小時。
然后向該反應(yīng)混合物中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在30ml三氯甲烷/甲醇/水(1∶1∶0.1)中,其后加入1.1ml(7.92mM)三乙胺和373μl(3.96mM)乙酸酐。使在室溫下反應(yīng)2小時,干燥,用5ml 1M的碳酸鈉處理并在60℃保持1小時。滲析,濃縮到5ml并在5倍體積的丙酮中沉淀。
所得的粗產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=299mg(理論值的54%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.37,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例27N-乙?;?N'-3,4,5-三甲氧苯甲酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后問其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后加入溶解于20ml四氫呋喃中的三甲氧苯甲酐(這是使0.3g<1.9mM>二環(huán)己碳化二亞胺與0.3g<1.4mM>三甲氧苯甲酸在20ml四氫呋喃中反應(yīng),二小時后濾去所形成的二環(huán)己脲而新鮮制備出來的)。
縮合反應(yīng)在25℃攪拌下進(jìn)行18小時。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在30ml三氯甲烷/甲醇/水(1∶1∶0.1)中,然后加入1.1ml(7.92mM)三乙胺和373μl(3.96mM)乙酐。使在室溫反應(yīng)2小時,干燥,以5ml碳酸鈉(1M)處理。并在60℃保持1小時。再將它滲析,濃縮至5ml,并在5倍體積丙酮中沉淀。
所得的粗產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
把各純提取組和匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=286mg(理論值的49%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.39,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例28N-二氯乙?;?N'-2-吡啶乙酰基-二-溶解性GM1將按實施例1制備的500mg二-溶解性GM1(0.39mM)溶解于5ml二甲基甲酰胺中,在這溶液中緩慢加入145mg(0.43mM)的9-芴基甲氧基-羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC)。讓它在室溫反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,將它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后通過硅膠色譜法將產(chǎn)物提純,以60∶30∶6的三氯甲烷/甲醇/水混合物作為洗脫劑。將含有中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥,再溶解于2.5ml的二甲基甲酰胺/甲醇1∶1,然后在室溫下加入1056μl(7.6mM)的三乙胺,330mg(1.9mM)的2-吡啶乙酸氫氯化物和溶于2.5ml中的碘化氯甲基吡啶。讓它在室溫反應(yīng)18小時。
隨后在這反應(yīng)混合物中加入1ml的哌啶以去除芴基。讓它在室溫反應(yīng)18小時并在100ml的9∶1丙酮/水中沉淀,過濾和干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解于1∶1∶0.1的三氯甲烷/甲醇/水中,然后加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和950mg(3.96mM)的二氯乙酐。讓它在室溫反應(yīng)2小時,干燥,以5ml1M的碳酸鈉處理,并在60℃保持1小時。再滲析,濃縮至5ml并在5倍體積的丙酮中沉淀。
將反應(yīng)產(chǎn)物用硅膠色譜法提純,以60∶35∶8的三氯甲烷/甲醇/水混合物作為洗脫劑。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解于2.0ml的1∶1三氯甲烷/甲醇中,并在10ml的丙酮中沉淀。
獲得的產(chǎn)品=267mg(理論值的46%)。
用以50∶42∶11的三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%構(gòu)成的溶劑作硅膠色譜層析,測得化合物是單一的,Rf=0.40,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例29N-二氯乙酰基-N'-3,4,5-三甲氧苯甲酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使所得混合物在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物N-FMOC-di-lyso-GM1的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后向其中加入溶解在10ml四氫呋喃中的三甲氧苯甲酸酐,這是使0.3g(1.9mM)的二環(huán)己碳化二亞胺與0.3g(1.4mM)的三甲氧苯甲酸在10ml四氫呋喃中反應(yīng),二小時后濾掉生成的二環(huán)己脲而新鮮制備出來的。
縮合反應(yīng)在25℃攪拌下進(jìn)行18小時。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使混合物在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在30ml三氯甲烷/甲醇/水(1∶1∶0.1)中,其后加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和950mg(3.96mM)的二氯乙酸酐。使在室溫下反應(yīng)2小時,干燥,用5ml1M的碳酸鈉處理并在60℃保持1小時。將其滲析,濃縮至5ml,并在5倍體積的丙酮中沉淀。
反應(yīng)的粗產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=293mg(理論值的48%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.41,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例30N-2-呋喃甲酰-N'-丁酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(),其后在0℃加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和6.26mg(3.96mM)丁酸酐,使其在室溫反應(yīng)2小時。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(3.8mM)三乙胺,210mg(1.9mM)的2-β呋喃甲酸和194.2mg(0.76mM)的碘化氯甲基吡啶。
使在室溫下反應(yīng)18小時,然后在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。將產(chǎn)物用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜法提純。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解于2.0ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=289mg(理論值的52%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.39,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例31N-2,6-二甲氧苯甲酰-N'-丁酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1),其后在0℃加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和626mg(3.96mM)丁酸酐,使其在室溫反應(yīng)2小時。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在1ml二甲基甲酰胺中,然后在室溫下加入1.056ml(7.6mM)的三乙胺和2,6-二甲氧苯甲酐,(這是使2.76g(15.2mM)的2,6-二甲氧苯甲酸和1.08g(3.8mM)對甲苯磺酸氟甲基吡啶在10ml二甲基甲酰胺/四氫呋喃(1∶1)中反應(yīng)而新鮮制備出來的)??s合反應(yīng)在室溫攪拌下進(jìn)行4小時。在反應(yīng)結(jié)束時,將溶液濃縮至5ml,在50ml丙酮中沉淀,過濾并真空干燥。
以三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)作為洗脫劑進(jìn)行硅膠色譜分離。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),用1N碳酸鈉處理,將其對蒸餾水滲析,然后濃縮到5ml,在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=297mg(理論值的51%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.37,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例32N-2-吡啶乙?;?N'-月桂酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在0℃加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和1.51g(3.96mM)月桂酸酐,使其在室溫反應(yīng)18小時。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)三乙胺,330mg(1.9mM)的2-吡啶乙酸氫氯化物和194.2mg(0.76mM)碘化氯甲基吡啶。使在室溫反應(yīng)18小時并在100ml丙酮中沉淀。
所得的粗產(chǎn)品用三氯甲烷/甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=262mg(理論值的43%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜,測得該化合物是單一的,其Rf=0.61,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例33N-3,4,5-三甲氧苯甲酰-N'-月桂酰-二-溶解性GM1將500mg溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-SUCC),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-id-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在0℃加入1.1ml(7.92mM)的三乙胺和1.51g(3.96mM)月桂酸酐,使其在室溫反應(yīng)18小時。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解于2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,向其中加入溶于10ml四氫呋喃中的三甲氧苯甲酐(這是使0.3g<1.9mM>二環(huán)己碳化二亞胺和0.3g<1.4mM>三甲氧苯甲酸在10ml四氫呋喃中反應(yīng)二小時后濾去生成的二環(huán)己脲而新鮮制備出來的)。
縮合反應(yīng)在25℃攪拌下進(jìn)行18小時,將產(chǎn)物在100ml丙酮中沉淀。
反應(yīng)粗產(chǎn)物用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解于2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=294mg(理論值的46%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得產(chǎn)品是單一的化合物,Rf=0.63。在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例34N-3,4,5-三甲氧苯甲酰-N'-2-吡啶乙酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-Succ),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在室溫下加入溶解于2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)三乙胺和330mg(1.9mM)2-吡啶乙酸氫氯化物和194.2(0.76mM)碘化氯甲基吡啶。使在室溫反應(yīng)18小時。
然后在這反應(yīng)混合物中加入1ml哌啶以去除芴基。使在室溫反應(yīng)18小時,在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解于2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,向其中加入溶于10ml四氫呋喃中的三甲氧苯甲酐(這是使0.3g<1.9mM>二環(huán)己碳化二亞胺和0.3g<1.4mM>三甲氧苯甲酸在10ml四氫呋喃中反應(yīng),二小時后濾去生成的二環(huán)己脲而新鮮制備出來的)。
縮合反應(yīng)在25℃攪拌下進(jìn)行18小時,將產(chǎn)物在100ml丙酮中沉淀。
反應(yīng)粗產(chǎn)物用三氯甲烷/甲醇/水(60∶35∶8)作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解于2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=243mg(理論值的43%)用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得產(chǎn)品是單一的化合物Rf=0.59。在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例35N-2-吡啶乙?;?N'-2,6-二甲氧苯甲酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺(FMOC-Succ),使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,使它在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。然后將該產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將包含中間反應(yīng)產(chǎn)物(N-FMOC-di-lyso-GM1)的流分匯集起來,干燥并再溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)其后加入二甲氧苯甲酐,它是使1.88g(1.6mM)2,6-二甲氧苯甲酸和540mg(1.9mM)對甲苯磺酸氟甲基吡啶在5ml二甲基甲酰胺/四氫呋喃(1∶1)中反應(yīng)而新鮮制備出來的。使其在室溫反應(yīng)4小時。
然后向其中加入1ml哌啶以除去芴基。使在室溫下反應(yīng)18小時并使其在100ml丙酮/水(9∶1)中沉淀,過濾并干燥。
將中間反應(yīng)產(chǎn)物溶解在2.5ml二甲基甲酰胺/甲醇(1∶1)中,其后在室溫下加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的1056μl(7.6mM)的三乙胺,330mg(1.9mM)2-吡啶乙酸氫氯化物和194.2mg(0.76mM)碘化氯甲基吡啶。使在室溫下反應(yīng)18小時,在100ml丙酮中沉淀。
所得的粗產(chǎn)品用三氯甲烷/甲醇/水(60;35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
把各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在10ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=247mg(理論值的41%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,其Rf=0.58,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例36N'-3,4,5-三甲氧苯甲酰-N'-溶解性GM1將500mg(0.33mM)N'-溶解性GM1溶解于50ml三氯甲烷/甲醇/(1∶1)中,在這溶液中加入溶解于20ml四氫呋喃中的三甲氧苯甲酐(這是使0.3g<1.9mM>二環(huán)己碳化二亞胺與0.3g<1.4mM>三甲氧苯甲酸在20ml四氫呋喃反應(yīng),二小時后濾掉生成的二環(huán)己脲而新鮮制備出來的)。
縮合反應(yīng)在25℃攪拌下進(jìn)行18小時。
反應(yīng)結(jié)束時,將產(chǎn)物干燥,用5ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)收集,并在100ml丙酮中沉淀。
這樣得到的粗產(chǎn)物用三氯甲烷/甲醇/水(60∶15∶2)作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在5ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在100ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品=320mg(理論值的56.7%)用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(60∶35∶8)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得產(chǎn)物是熒光的單一化合物,Rf=0.50。
實施例37N'-2-呋喃甲酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解于5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入溶解于2ml四氫呋喃中的145mg(0.43mM)9-芴甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺。使其在室溫反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,在室溫下加入溶解于2.5ml二甲基甲酰胺中的528μl(3.8mM)三乙胺,210mg(1.9mM)2-呋喃甲酸和194.2mg(0.76mM)碘化氯甲基吡啶。使這混合物在室溫反應(yīng)18小時,然后加入2ml哌啶以除去保護(hù)基團(tuán)。再讓它在室溫反應(yīng)18小時,在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。將所得產(chǎn)物溶解于10ml 1M的碳酸鈉中,并在60℃保持1小時。將其滲析,濃縮至5ml,在5倍體積的丙酮中沉淀。
將反應(yīng)粗產(chǎn)物用三氯甲烷/甲醇氨水2.5N(60∶35∶8)作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
將含有純產(chǎn)物的流分干燥,再溶解在5ml水中。用0.01N的氫氧化鈉將溶液的pH調(diào)節(jié)至10,使其滲析,濃縮至5ml,再在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品301mg(理論值的57%)用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得產(chǎn)品是單一的,Rf=0.31,對茚三酮顯色法顯示陽性。在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例38N'-3,4,5-三甲氧苯甲酰-二-溶解性GM1將500mg二-溶解性GM1(0.39mM)(按實施例1制備)溶解在5ml二甲基甲酰胺中,然后向其中慢慢加入溶解于2ml四氫呋喃中的145mg(0.43mM)9-芴基甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺,使該混合物在室溫下反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束時,加入溶解于20ml四氫呋喃中的三甲氧苯甲酐(這是使0.3g<1.9mM>二環(huán)己碳化二亞胺和0.3g<1.4mM>三甲氧苯甲酸在20ml四氫呋喃中反應(yīng),二小時后濾去生成的二環(huán)己脲而新鮮制備出來的)。
縮合反應(yīng)在25℃攪拌下進(jìn)行18小時。然后加入2ml哌啶以去除保護(hù)基團(tuán),使它在室溫反應(yīng)18小時,再在100ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。將所得的產(chǎn)物溶解于10ml 1M的碳酸鈉中并在60℃保持1小時。將它滲析,濃縮至5ml并在5倍體積的丙酮中沉淀。反應(yīng)粗產(chǎn)物用三氯甲烷/甲醇/氨水2.5N(60∶35∶8)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。將含有純產(chǎn)物的流分干燥,再溶解于5ml水中。用0.01N的氫氧化鈉將溶液的pH調(diào)節(jié)至10,并使它滲析,濃縮至5ml,再在50ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品317.5mg(理論值的56%)用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得產(chǎn)物是單一的,Rf=0.35,對茚三酮顯色法顯示陽性,在254nm下讀取熒光計數(shù)據(jù)。
實施例39由牛腦組織提取神經(jīng)節(jié)苷脂混合物(GA混合物)將牛腦皮層從牛身上取出并在磷酸緩沖液中打成勻漿至pH6.8,向其中加入6倍體積的四氫呋喃,將所得混合物離心分離。然后用四氫呋喃將上清液萃取2次。離心分離后,非極性物質(zhì)通過用乙醚分層而去除,而水-四氫呋喃相則被引入用50%乙醇平衡的離子交換柱中。在從離子交換柱出來的產(chǎn)物中加入氫氧化鋇和4倍體積的冰凍乙醇。冷卻18小時后,將沉淀收集起來,溶解于水,并用鹽酸使之輕微酸化。將所得溶液滲析并冰凍干燥。這時的產(chǎn)率是大約每克神經(jīng)組織得到0.6mg粗的神經(jīng)節(jié)苷脂混合物。將冰凍干燥的粉末分散在20倍體積的三氟甲烷-甲醇(2∶1)中,而所得的溶液一旦過濾到完全清徹后,就加入0.2體積的氯化鉀0.88%水溶液使它分層。
將上層分離出來,滲析并冰凍干燥。最后產(chǎn)率是每克腦組織的0.3mg純化的神經(jīng)節(jié)苷脂鹽混合物。所得的神經(jīng)節(jié)苷脂混合和可以用硅酸柱、以甲醇-三氯甲烷洗提而分級分離為代表基本純凈(在上述的意義上)神經(jīng)節(jié)苷脂的各個部分。這樣得到的平均成分約為40%神經(jīng)節(jié)苷脂GD1a,21%神經(jīng)節(jié)苷脂GM1,19%神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b和16%神經(jīng)苷脂GD1b。
實施例40N-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂混合物的2-呋喃甲酰衍生物(1)N-溶神經(jīng)節(jié)苷脂的制備將10g神經(jīng)節(jié)苷脂混合物(按實施例39制得)溶解在200ml 3M的氫氧化鉀中,在90℃水解72小時。將溶液冷卻并用鹽酸調(diào)節(jié)到pH6.5。使它在4℃靜置18小時,將沉淀的脂肪酸濾去。將它對水滲析,濃縮至500ml,并在5升丙酮中沉淀。
將含有N'-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂和N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂(<20%)的產(chǎn)物真空干燥,再溶解于100ml二甲基甲酰胺中。
然后向這溶液緩慢加入溶解于20ml四氫呋喃中的2.15g(6.37mM)9-芴甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺,使在室溫反應(yīng)1小時。最后加入3ml(31.85mM)乙酐和0.9ml(63.7mM)三乙胺。30分鐘后,加入12.5ml派啶以去除保護(hù)基團(tuán)。使在室溫反應(yīng)18小時,在2升丙酮中沉淀,并干燥。將所得物質(zhì)溶解于1M碳酸鈉并在60℃保持1小時。再將其滲析,濃縮至100mg/ml,并在5倍體積的丙酮中沉淀。使產(chǎn)物通過一平衡在甲醇中的S-瓊脂糖凝膠柱(H+型)。以甲醇洗滌,通過用氯化銨(10mM)甲醇溶液洗脫就得到N-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂。
將含有產(chǎn)物的流分干燥,再溶解于水。用氫氧化鈉(0.01N)調(diào)節(jié)至pH為10,使它滲析,濃縮至100mg/ml,并在5倍體積丙酮中沉淀。
(2)2-呋喃甲酰衍生物的制備將500mg(0.31mM)上面制得的N-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂混合物溶解于2.5ml二甲基甲酰胺中,在其中加入溶解在2.5ml二甲基甲酰胺中的431μl(3.1mM)三乙胺,174mg(1.55mM)2-呋喃甲酸和158.4mg(0.62mM)碘化1-甲基-2-氯吡啶。
使在室溫反應(yīng)18小時,隨后產(chǎn)物在10ml丙酮中沉淀,過濾并干燥。通過平衡在甲醇中的S-瓊脂糖凝膠柱(H+型)作色譜分離,將?;a(chǎn)物與未反應(yīng)化合物分離開來。將呋喃甲酰衍生物用甲醇洗脫,干燥,再用碳酸鈉(1N)收集,滲析,濃縮至2.5ml并在25ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品373mg(理論值的72%)。
實施例41N(2-呋喃甲酰)-N-溶性GM的甲酯將500mg(0.36mM)N-(2-呋喃甲酰)-N-溶解性GM1鈉鹽(按實施例7制得)溶解于5ml甲基吡咯烷酮中,在其中加入44.5μl(0.72mM)甲基碘。使在室溫反應(yīng)3小時,在乙酸乙酯中沉淀,過濾并真空干燥。
然后將產(chǎn)物用三氯甲烷/甲醇/水(60∶30∶6)混合物作為洗脫劑通過硅膠色譜進(jìn)行提純。
將各純提取組分匯集起來,蒸發(fā),再溶解在2.5ml三氯甲烷/甲醇(1∶1)中,并在25ml丙酮中沉淀。
所得產(chǎn)品449mg(理論值的89%)。
用三氯甲烷/甲醇/氯化鈣0.3%(50∶42∶11)組成的溶劑作硅膠色譜層析,測得該化合物是單一的,Rf=0.4[N-(2-呋喃甲酰)溶解性GM1=0.37]。
實施例42N-(2-呋喃甲酰)-N-溶性GM1的甲酯的全乙?;锸?00mg(0.36mM)N-(2-呋喃甲酰)-N-溶性GM1(按照實施例41制備的)溶于5ml吡啶,再將2.5ml新鮮蒸餾乙酐加入到該溶液中,混合物在室溫下攪拌72小時。反應(yīng)完畢,使溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā),殘留物被分配在10ml冰水和10ml乙酸乙酯中,在1M冷HCl中,用水和1MNaHCO3溶液洗滌乙酸乙酯。有機(jī)相用硫酸鈉脫水,再蒸發(fā),殘留物通過硅膠色譜法用二氯甲烷/乙酸乙酯/異丙醇(70∶30∶45)提純。收集純餾分,經(jīng)蒸發(fā),再溶于5ml乙醚中,在25ml正己烷中析出沉淀。
所得產(chǎn)物463mg(理論收率的62%)采用由氯仿/甲烷/乙酸乙酯(70∶10∶30)和乙酸乙酯/異丙醇(95∶5)所形成的溶劑的硅膠色譜法表明,產(chǎn)物是分別具有Rf0.45和0.26的單元組分。
實施例43N-(2-呋喃甲酰)-N-溶解性GM1的內(nèi)酯在4℃下,使500mg(0.36mM)N-(2-呋喃甲酰)-N-溶性GM1鈉鹽溶于5mlN-甲基吡咯烷酮,再與55μl(0.4mM)三乙胺和100mg(0.41mM)1-甲基-2-碘化氯吡啶反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)行4小時得到定量收率。通過添加50ml丙酮使產(chǎn)物析出,經(jīng)過過濾,用5ml氯仿/異丙醇(1∶1)收集,再在25ml丙酮中再析出沉淀。
所得產(chǎn)物476mg(理論收率的96%)采用由氯仿/甲烷/0.3% CaCl2(50∶42∶11)所形成的溶劑的硅膠色譜法表明,化合物是具有Rf=0.44的單元[N-(2-呋喃甲酰)-N-溶性GN1=0.37]。
實施例44N-(2-呋喃甲酰)-N-溶性GM1的丁酰胺使500mg(0.36mM)N-(2-糠酰)-N-溶性GM的甲酯(按照實施例41制備的)溶于5ml吡啶,并將2.5ml2-丁胺加入到該溶液中。在室溫下,反應(yīng)72小時,然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥,再用5ml氯仿/甲烷(1∶1)溶解,在25ml丙酮中析出。經(jīng)過濾和真空干燥。
然后,通過硅膠色譜法,用氯仿/甲烷/水(60∶25∶4)作洗脫劑,提純產(chǎn)物。
收集純餾分,進(jìn)行蒸發(fā),再溶于2.5ml氯仿/甲烷(1∶1)中,在25ml丙酮中析出。
所得產(chǎn)物376mg(理論收率的75%)采用由氯仿/甲烷/0.3%CaCl2(50∶42∶11)所形成的溶劑的硅膠色譜法表明,化合物是具有Rf=0.50單元[N-(2-呋喃甲酰)-N-溶性GM1的甲酯=0.42]。
注射溶液的醫(yī)藥制劑實施例45制劑1號-2ml-管含有-活性物質(zhì) 5mg-氯化鈉 16mg用注射用水中pH為6的檸檬酸緩沖劑加至 2ml活性物質(zhì)選自由實施例5和12中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物所組成的組。
制劑2號-2ml一管含有-活性物質(zhì) 50mg-氯化鈉 16mg用注射用水中pH為6的檸檬酸緩沖劑加至 2mg活性物質(zhì)選自由實施例7所述的神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物所組成的組。
制劑3號-4ml一長頸細(xì)口瓶含有-活性物質(zhì) 100mg-氯化鈉 32mg
用注射水中pH為6的檸檬酸緩沖劑加至 4ml活性物質(zhì)選自由實施例27、29、38以及40所述的神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物所組成的組。
雙長頸細(xì)口瓶中制備的醫(yī)藥組合物實施例46本實施例中所述的制劑是在一對長頸細(xì)口瓶中。第一長頸細(xì)口瓶含有凍干粉末狀的活性物質(zhì),其數(shù)量為10%-90%(重量),以及醫(yī)藥上可接受的賦形劑,例如甘氨酸或者甘露糖醇。第二長頸細(xì)口瓶含有溶劑,如氯化鈉溶液以及檸檬酸緩沖劑。在施用之前,立即將二個長頸細(xì)口瓶的內(nèi)容物混合在一起,含有活性物質(zhì)的凍干粉末迅速溶解形成注射液。由含有凍干粉末狀的活性物質(zhì)的一個長頸細(xì)口瓶組成的醫(yī)藥上的形式是本發(fā)明最佳的形式。
系統(tǒng)1號a.2ml 一長頸細(xì)口瓶凍干物質(zhì)含有-活性物質(zhì) 5mg-甘氨酸 30mgb.2ml -管溶劑含有-氯化鈉 16mg-用注射水中檸檬酸緩沖加至 2ml活性物質(zhì)選自由實施例5和12中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物所組成的組。
系統(tǒng)2號a.3ml 一管凍干物質(zhì)含有-活性物質(zhì) 5mg-甘露糖醇 40mgb.2ml 一管溶劑含有
-氯化鈉 16mg-注射用水中檸檬酸緩沖劑加至 2ml活性物質(zhì)選自由實施例5和12中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂所形成的組。
系統(tǒng)3號a.3ml 一管凍干物質(zhì)含有-活性物質(zhì) 50mg-甘氨酸 25mgb.3ml 一管溶劑含有-氯化鈉 24mg-用注射水中檸檬酸緩沖劑加至 3ml活性物選自由實施例18、33及38中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物所形成的組。
系統(tǒng)4號a.3ml 一管凍干物質(zhì)含有-活性物質(zhì) 50mg-甘露糖醇 20mgb.3ml 一管溶劑含有-氯化鈉 24mg-注射水中檸檬酸緩沖劑加至 3ml活性物質(zhì)選自由實施例18、33及38中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物組成的組。
系統(tǒng)5號a.5ml 一長頸細(xì)口瓶凍干物質(zhì)含有-活性物質(zhì) 150mg-甘氨酸 50mg
b.4ml 一管溶劑含有-氯化鈉 32mg-注射水中檸檬酸緩沖劑加至 4ml活性物質(zhì)選自由實施例27、29、38及40中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物組成的組。
系統(tǒng)6號a.5ml 一長頸細(xì)口瓶凍干物質(zhì)含有-活性物質(zhì) 100mg-甘露糖醇 40mgb.4ml 一管溶劑含有-氯化鈉 32mg-注射水中檸檬酸緩沖劑加至 4ml活性物質(zhì)選自由實施例27、29、38及40中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物組成的組。
系統(tǒng)7號a.3ml 一長頸細(xì)口瓶含有-無菌、微粉化的活性物質(zhì) 40mgb.3ml 一管溶劑含有-吐溫80(Tween 80) 10mg-氯化鈉 24mg-注射水中磷酸鹽緩沖劑加至 3ml活性物質(zhì)選自由實施例41、42及43中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物所組成的組。
系統(tǒng)8號a.5ml 一長頸細(xì)口瓶含有-無菌、微粉化的活性物質(zhì) 100mg
b.4ml -管溶劑含有-吐溫80(Tween 80) 15mg-大豆卵磷酯 5mg-氯化鈉 36mg-注射水中磷酸鹽緩沖劑加至 4ml活性物質(zhì)選自由實施例41、42及43中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物所組成的組。
經(jīng)皮膚施用的醫(yī)藥制劑實施例47制劑1號 -一種膏藥含有-活性物質(zhì) 100mg-甘油 1.6g-聚乙烯醇 200mg-聚乙烯吡咯烷酮 100mg-增強(qiáng)經(jīng)皮膚滲透的賦形劑 20mg-水 1.5g活性物質(zhì)選自由實施例22、23及25中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物所組成的組。
制劑2號 -100g軟膏含有-活性物質(zhì)(在5g混合的磷酯脂質(zhì) 4.0g體中)-聚乙二醇酯單硬脂酸 1.5g-甘油 1.5g-對羥基苯甲酸酯 125mg-水 72.9g活性物質(zhì)選自由實施例22、23及25中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂所組成的組。
口服醫(yī)藥制劑實施例48制劑1號 -一片含有-活性物質(zhì) 20mg-微晶纖維素 150mg-乳糖 20mg-酰胺 10mg-硬脂酸鎂 5mg活性物質(zhì)選自由實施例9、13、19及26中任何一例所述神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物所組成的組。
制劑2號 -一丸含有-活性物質(zhì) 30mg-羧甲基纖維素 150mg-酰胺 15mg-蟲膠 10mg-蔗糖 35mg-著色劑 0.5mg活性物質(zhì)選自由實施例9、14及28中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物所組成的組。
制劑3號 -一膠質(zhì)膠囊含有-活性物質(zhì) 40mg-乳糖 100mg-耐胃液外衣 5mg活性物質(zhì)選自由實施例15、24及34中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物所組成的組。
制劑4號 -一軟明膠膠囊含有-活性物質(zhì) 50mg-植物油 200mg-蜂蠟 20mg-明膠 150mg-甘油 50mg-著色劑 3mg活性物質(zhì)選自由實施例15、24及34中任何一例所述的神經(jīng)節(jié)苷脂衍生物所組成的組。
權(quán)利要求
1.一種N-?;?N,N’-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類、N’-?;?N’N-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類以及N,N’-二?;?N,N’-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的制備方法,其特征在于它包括用引入?;南鄳?yīng)的酸使N,N’-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類、N-?;?N,N’-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類或N’-?;?N,N’-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類?;蛘咴谇拾贝嫉?、或在神經(jīng)氨酸氮上或在這些化合物的混合物上,選擇性地使適合的N,N’-二?;?N,N’-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類脫酰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于它進(jìn)一步包括使所得的?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類轉(zhuǎn)變成所得化合物的酯、酰胺、內(nèi)酯和/或羥基全?;苌锏牟襟E。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于使所得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成治療上可接受的鹽類。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所說的?;峭ㄟ^使起始的?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯與相應(yīng)的酸的一活性官能衍生物反應(yīng)來實現(xiàn)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于按照以下各組反應(yīng)中的一種使酰基-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯反應(yīng)(1)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與相應(yīng)的酸的疊氮化物的反應(yīng);(2)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與?;溥虻姆磻?yīng);(3)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與相應(yīng)的酸和三氟乙酸的混合酸酐的反應(yīng);(4)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與相應(yīng)酸的酰氯的反應(yīng);(5)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與在碳化二亞胺存在下和任選在1-羥基苯并三唑存在下的相應(yīng)的酸的反;(6)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與高溫下的相應(yīng)的酸的反應(yīng);(7)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與高溫下相應(yīng)酸的甲酯的反應(yīng);(8)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與高溫下相應(yīng)酸的苯酚酯的反應(yīng);(9)溶性神經(jīng)節(jié)苷酯衍生物與自酸的鹽與碘化1-甲基-2-氯吡啶之間交換產(chǎn)生的酯的反應(yīng);
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法,其特征在于在?;磻?yīng)中,羥基、伯或仲氨基或者游離羧基被暫時保護(hù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于采用肽化學(xué)中所使用的保護(hù)方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求4、5、6或7所述的方法,其特征在于當(dāng)用N'-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯作起始物料時,采用適度的?;椒?。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任何一項所述的方法,其特征在于唾液羧基被酯化或者被轉(zhuǎn)變成酰胺類。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任何一項所述的方法,其特征在于工藝在任何一步中斷或者在中間步驟開始,然后進(jìn)行所余下的步驟。
11.一種醫(yī)藥制劑,其特征在于它含有N-酰基-N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類、N'-酰基-N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類和N,N'-二?;?N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,其中?;芍?、芳族、芳脂族、脂環(huán)族或雜環(huán)族系列的有機(jī)酸衍生,并且其中兩個?;械闹辽僖粋€不是脂族的,它們的唾液羧基的酯類和/或酰胺,和/或它們的內(nèi)脂和/或全?;苌?,和它們的任選的金屬鹽,以及這些化合物的混合物作為活性組份,以及醫(yī)藥上可接受的賦形劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的醫(yī)藥制劑,其特征在于活性組份是以下化合物中的一種酰基-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,?;?溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,N,N'-二?;?N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中化合物的唾液羧基的酯類,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中化合物的唾液羧基的酰胺類,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類化合物的全乙酰化物、全丙?;?、全丁?;铩⑷;锛叭《;?,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的唾液羧酯,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的唾液羧酰胺,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的內(nèi)脂,酰基-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的全乙?;苌铮;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的混合物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的治療上可接受的金屬鹽或它們各自的混合物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽或者它們各自的混合物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的治療上可接受的有機(jī)堿鹽或者它們各自的混合物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的帶有治療上可接受酸的加成鹽或者它們的混合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的醫(yī)藥制劑,其特征在于活性組份是以下化合物中的一種N-2,6-二甲氧基苯甲?;?N-溶性GM1,N-5-甲氧基-(2,3-二氫-茚酮)-乙?;?N-溶性GM1,N-苯乙?;?N-溶性GM1,N-環(huán)丁烷羰基-N-溶性GM1,N-2-降冰片烯乙?;?N-溶性GM1,N-呋喃甲酰-N-溶性GM1,N-咪唑乙?;?GM1,N-6-甲基菸?;?N-溶性GM1,N-甲基脯氨?;?N-溶性GM1,N-1-甲基-2-吡咯羰基-N-溶性GM1,N-2-吡啶乙?;?N-溶性GM1,N-4-4-吡啶硫代乙?;?N-溶性GM1,N-3-喹啉羧基-N-溶性GM1,N-四唑基-1-乙酰基-N-溶性GM1,N-7-茶堿乙?;?N-溶性GM1,N-2-噻吩乙?;?N-溶性GM1,N-3-氨基-1,2,4-三唑-5-乙?;?N-溶性GM1,N-乙?;?DL-色氨酸乙?;?(α,α,α-三氟甲苯胺)-菸?;?GM1,N-5-海因乙酰基-N-溶性GM1,N-5-羥基吲哚-3-乙?;?N-溶性GM1,N-2-氯代菸?;?N-溶性GM1,N-5-甲基-2-噻吩乙?;?N-溶性GM1,N-5-苯并咪唑乙?;?N-溶性GM1,N-5-羥基-2-吲哚乙?;?N-溶性GM1,N-3,4,5-三甲氧基苯甲?;?N-溶性GM1,N-環(huán)庚烷乙?;?N-溶性GM1,N-環(huán)戊烷乙?;?N-溶性GM1,N-5-甲基-2-噻吩乙酰基-溶性GM1。
14.以下的一種化合物N-酰基-N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類、N'-?;?N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類和N,N'-二?;?N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,其中酰基由脂族、芳族、芳脂族、脂環(huán)族或雜環(huán)族系列的有機(jī)酸衍生,并且其中兩個?;械闹辽僖粋€不是脂族的,它們的唾液羧基的酯類和/或酰胺,和/或它們的內(nèi)脂和/或全?;苌?,和它們的任選的金屬鹽,以及這些化合物的混合物用作治療神經(jīng)系統(tǒng)病癥。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的治療應(yīng)用,其中將一種或多種以下化合物施用于需要這樣治療的病人?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,?;?溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,N,N'-二?;?N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中化合物的唾液羧基的酯類,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中化合物的唾液羧基的酰胺類,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類化合物的全乙酰化物、全丙?;?、全丁?;铩⑷;锛叭《;?,酰基-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的唾液羧酯,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的唾液羧酰胺,酰基-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的內(nèi)脂,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的全乙酰化衍生物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類的混合物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的治療上可接受的金屬鹽或它們各自的混合物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽或者它們各自的混合,酰基-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的治療上可接受的有機(jī)堿鹽或者它們各自的混合物,?;?二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類中任何一種的帶有治療上可接受酸的加成鹽或者它們的混合。
16.以下的一種化合物N-?;?N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類、N'-?;?N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類和N,N'-二酰基-N,N'-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷酯類,其中?;芍濉⒎甲?、芳脂族、脂環(huán)族或雜環(huán)族系列的有機(jī)酸衍生,并且其中兩個酰基中的至少一個不是脂族的,它們的唾液羧基的酯類和/或酰胺,和/或它們的內(nèi)脂和/或全酰化衍生物,和它們的任選的金屬鹽,以及這些化合物的混合物用作治療大腦局部缺血,代謝性腦病,如低血糖和缺氧,毒物源性腦病,創(chuàng)傷,老熟,癲癇,神經(jīng)變性性疾病,如巴金森氏疾病和亨廷頓舞蹈病和/或精神性疾病。
17.根據(jù)權(quán)利要求13到16的任何一項的治療應(yīng)用,其中通過胃腸外途徑施用,每天每公斤體重為0.05-5mg活性組份。
全文摘要
本發(fā)明涉及N-?;?N,N′-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂類、N′-?;?N,N′-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂類及N,N′-二?;?N,N′-二-溶性神經(jīng)節(jié)苷脂類,其中?;芍?、芳族、芳脂族、脂環(huán)族或雜環(huán)族系列的有機(jī)酸衍生,并且其中兩個酰基中的至少一個不是脂族的,及其制備。還涉及上述化合物的酯類、內(nèi)酯類、酰胺類及羥基全丙烯酸酯類及其鹽的制備。這些化合物用于治療中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的病癥。
文檔編號A61P25/28GK1051912SQ90109290
公開日1991年6月5日 申請日期1990年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1989年11月14日
發(fā)明者費(fèi)郎切斯科·德拉·瓦萊, 奧雷利奧·羅密歐 申請人:菲迪安股份公司