專利名稱：用作興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)拮抗劑的聚胺類化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及某些發(fā)現(xiàn)于棚蛛屬aperta蜘蛛毒液中的聚胺類化合物。這類聚胺及其藥物上可以接受的鹽是興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)拮抗劑，該傳導遞質(zhì)作用于各種生物(包括無脊椎和脊椎類)神經(jīng)細胞在內(nèi)的細胞。本發(fā)明還涉及這類聚胺及其鹽在拮抗興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)中的應用(所述傳導遞質(zhì)作用于諸如生物體神經(jīng)系統(tǒng)細胞之類的細胞)，以及用于治療哺乳動物中由興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)誘發(fā)的疾病和癥狀，防治無脊椎類害蟲，還涉及包括所述聚胺及其鹽的組合物。
文獻中報道了棚蛛屬aperta蜘蛛毒液中至少含有兩種作用于鈣流的有毒物質(zhì)。參見Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci，Abstr.12∶1078(1987)。這些作者公開了一種在該本文稱之為AG2的毒物，其分子量低于1000道爾頓，它似乎在許多組織中抑制鈣流。另有(Further，Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci.Abstr.12∶730(1986))報道了來自棚蛛屬aperta蜘蛛的另一種毒物，該成分的分子量約為6000道爾頓。據(jù)報道該毒物影響傳遞過程中突觸前阻斷，并推測該毒物阻斷與釋放神經(jīng)傳導遞質(zhì)有關的鈣通道。1989年4月28日提交的并轉(zhuǎn)讓給受讓人的申請?zhí)枮?7/346，181的美國專利申請書中公開了發(fā)現(xiàn)于棚蛛屬aperta蜘蛛毒液中的某些聚胺類化合物。在該申請中公開的那些聚胺是作為細胞興奮型氨基酸受體的阻斷劑，在該申請中還公開了一種稱之為B1的上述聚胺作為細胞鈣通道阻斷劑。該申請中公開的聚胺如下所述
和AGEL 504它是具有如下鑒別特征的化合物(a)存在于按如下方式洗脫棚蛛屬aperta蜘蛛毒液粗品所得的級份中c-18 Vydac 22m×250mm，孔徑為300 ，粒度為10μ的柱，流速為15ml/分，采用如下線性梯度程度的溶劑系統(tǒng)5%→20%B，95%→80%A〔0→30分鐘?！?，然后，20%→70%B，80%→30%A〔30→55分鐘?！?，其中A是0.1%TFA水溶液，B是乙腈，滯留時間大約為22.75分鐘;
(b)存在于上述(a)洗脫級份經(jīng)如下方式再洗脫的級份中c-18 Vydac 22mm×250mm，300 孔徑，10μ粒徑的柱，流速為15ml/min.，溶劑系統(tǒng)非線性梯度程序0%→0%B，100%→100%A〔0-5分鐘.〕，然后0%→10%B，100%→90%A〔5-20分鐘〕(Waters曲線1)，然后10%→20%B，90%→80%A〔20→30分鐘〕(Waters曲線6)，然后20%→50%B，80%→50%A〔30→40分鐘〕(Waters曲線11)，其中A是0.1%TFA的水溶液，B是乙腈，滯留時間約為21.5分鐘;和(c)FAB MS高分辨505.3861，經(jīng)計算為C27H48N6O3。
興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)拮抗劑化合物具有多種用途。興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)拮抗劑在臨床上可用于治療下述疾病例如，中風、腦缺血、神經(jīng)退化性疾病，例如，阿耳茨海默氏病和癲癇，尤其可用作精神治療劑。參見Excitatory Amino Acids in Health and Disease，D.Lodge，Ed.，John Wiley and Sons Ltd.，New York.NY 1988，該文引為本發(fā)明的對比文獻。此外，這類化合物還可用于研究細胞(如神經(jīng)細胞)生理，并用于防治無脊椎類害蟲。
本發(fā)明涉及某些存在于棚蛛屬aperta蜘蛛毒液中的聚胺類化合物。本發(fā)明的聚胺如下所述
本發(fā)明所述聚胺類化合物及其藥物上可以接受的鹽是作用于細胞的興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)拮抗劑。因此，所述聚胺類化合物可用于拮抗這類興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)本身。本發(fā)明的聚胺類也可用于防治無脊椎害蟲，用于治療人類由興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)誘發(fā)的疾病。所述聚胺還可用于人類精神病治療劑。
本發(fā)明還涉及包括所述聚胺的組合物和服用所述聚胺的方法。
按照本領域技術人員所熟知的標準方法，即電刺激擠出法，從棚蛛屬aperta蜘蛛制得毒液。所采用的優(yōu)選方法應保護整個毒液不受腹腔反流或血淋巴的污染。這類方法對本領域技術人員而言是已知的。直到按下述方法純化前，由此所得的全部毒液應保持在-78℃左右的冷凍狀態(tài)。
在下述制備或半制備柱上，通過反相高效液相層析(HPLC)純化整個毒液中的各種成分。所述柱包括C-4和C-18 Vydac 柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road.Woburn Massachusetts 01801)，C-18 Baker柱(J.T.Baker Inc.，22Red School Lane，Phillipsburg，NJ08865)和Dynamax Phenyl柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road.Woburn Massachusetts 01801)。在220-230nm處采用單色法進行峰檢測。例如，采用Waters 990二級管列陣檢測器(diode array detector)(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)收集多色UV數(shù)據(jù)，可以對各級份做進一步分析。采用已知方法，例如，使用ISCO/“FOXY”級份收集器和ISCO 2159峰檢測器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)收集來自柱的各級份。將各級份收集在適宜大小的容器中，例如，無菌聚乙烯實驗室制品。然后采用凍干法將來自洗脫液的各級份濃縮，最后凍干除水。然后可以采用下述方法測定所得各構(gòu)成級份的純度即，利用梯度系統(tǒng)采用分析柱進行色譜分析，與各級份最后純化中所使用的系統(tǒng)相比，上述梯度系統(tǒng)是更強的恒溶劑。
按照已知的分析方法，例如，質(zhì)譜法和核磁共振法測定各級份中所包含的結(jié)構(gòu)。
就實施本發(fā)明及使用前文概述的通法而言，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)適用于初分洗脫毒液的柱子是C-18 Vydac 22mm×250mm，孔徑為300 ，柱粒徑為10μ。采用15ml/分的流速洗脫該柱，并采用下述線性梯度程序100%→80%A，0%→20%B〔0→30分鐘〕，其中A是0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液，B是乙腈。按前述方法收集各級份。選出由此所得的六個級份，在本文中分別標為1，2，3，4，5和6，以供進一步分析和/或純化之用。用于分離整個毒液的另一方法包括C-18 Baker柱(4.6mm×250mm，孔徑100 ，粒徑為5μ)，按1ml/分的流速，采用8%B，92%A(A和B如前述)的恒溶條件洗脫該柱。但是，就本發(fā)明的目的而言，優(yōu)選采用C-18 Vydac 柱和前文所述程序進行整個毒液的初分離。
經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)級份1，2和3含有美國專利申請Serial No.07/346，181所描述的聚胺，它們不屬于本發(fā)明。采用不同的柱和條件進一步純化級份4，5和6。下文實施例2，3和4中給出了各粗分物的具體特征及其結(jié)果。
如下文實施例所述，級份AGEL 416.AGEL 464.AGEL 489(A)和AGEL 521所包括的聚胺類化合物結(jié)構(gòu)如下AGEL 416
下文所示反應路線A至C示出了生產(chǎn)下式本發(fā)明聚胺的合成路線
<p>反應路線A.
反應路線B
反應路線C
按照反應路線A，從丁二胺開始，按各步順序反應，制得式Ⅳ聚胺中間體。在實施例5A至G部分，給出了適用于按反應路線A制備式Ⅷ中間體的反應條件。反應路線B解釋了制備式Ⅸ中間體的方法。在實施例5的H部分給出了適用于按反應路線B制備該中間體的反應條件。反應路線C示出了式Ⅻ所示本發(fā)明聚胺化合物的制備方法。在實施例5的I至K部分紿出了適用于將式Ⅷ與式Ⅸ中間體化合物偶合、然后制備式Ⅻ化合物的反應條件。
本發(fā)明聚胺可逆性地拮抗作用于細胞的興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)，所述細胞包括各種生物(包括無脊椎和脊椎類)神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞。貫穿本文所采用的術語“脊椎類”意指包括哺乳類動物、“無脊椎類”包括例如，昆蟲，外寄生蟲和內(nèi)寄生蟲。
按照下述方法，根據(jù)它們在新生大鼠小腦中阻斷N-甲基-D-天冬氨酸誘發(fā)(NMDA)的cGMP上升的能力，可以證實本發(fā)明聚胺類化合物拮抗興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)的能力。所述方法是從10只出生8-14天的Wistar大鼠中迅速切除小腦，并將其置于PH為7.4的溫度為4℃的Krebs/碳酸氫鹽緩沖液中，然后用McIIwain組織切片機(The Nickle Laboratory Engineering Co.，Gomshall，Surrey，England)將其切割成0.5mm×0.5mm的小塊。將所得腦組織碎片移至100ml，37℃、用95∶5 O2/CO2不斷平衡的Krebs/碳酸氫鹽緩沖液中。以這種方式將腦組織碎片保溫90分鐘，并將緩沖液更換3次。然后傾出緩沖液，將該組織離心(1分鐘.，3200r.p.m)，繼之混懸于20ml Krebs/碳酸氫鹽緩沖液中。接著以250μl的等份(約2mg)移出，放入1.5ml的微型離心管中。在這些管中加入10μl受試化合物儲液，然后加入10μl.2.5mM NMDA溶液使反應開始。最終NMDA濃度是100μM。對照組不加NMDA。在振蕩水浴中，于37℃將這些管保溫一分鐘，然后加入750μl 50mM Tris-Cl，5mM EDTA溶液使反應停止。立即將這些管放入沸水浴中持續(xù)5分鐘。然后采用探管近程聲電定位器(proke sonicator)將功率水平設置在3，將每只管中的組份用聲波處理15秒。取出10微升，按Lowry，Anal.Biochem.100∶201-220(1979)所述方法測定蛋白。然后將這些管離心(5分鐘、10000xg)，移出100μl上清液，采用New England Nuclear(Boston，Massachusetts)cGMP測定儀，按廠商提供的方法，測定環(huán)化GMP(cGMP)水平。所得數(shù)據(jù)是每毫克蛋白產(chǎn)生cGMP的皮摩爾數(shù)。
此外，按照下述方法，根據(jù)本發(fā)明聚胺類化合物通過阻斷裂解小腦粒細胞的NMDA/甘氨酸，從而使胞液中游離〔Ca+2〕i增加的能力來證實其對興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)的拮抗能力。所述方法是從出生8天大鼠的小腦中制備小腦粒細胞(Wilkin，G.P.et al.，Brain Res∶115∶181-199，1976)。用聚-L-賴氨酸涂布聚三氟氯乙烯小塊(1cm2)(Proplastics Inc.，5033 Industrial Ave.，Wall，N.J.，07719)，然后置于含有1ml Eagles Basal培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)皿中。將細胞打散，將含有6.25×106細胞的等份加到每個含有聚三氟氯乙烯塊的孔中。接種后24小時加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(終濃度為10μM)。將第6、7和8天的培養(yǎng)物作細胞fura2分析。將細胞(連接于聚三氟氯乙烯塊)移至含有(1ml)于HEPES緩沖液中的2μM fura2/AM(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR，97402)的12孔培養(yǎng)皿中，所述緩沖液含有0.1%小牛血清白蛋白，0.1%右旋糖，pH＝7.4，無鎂離子。將該細胞在37℃保溫40分鐘;移出含fura2/AM的緩沖液，用1ml不含fura2/AM的相同緩沖液代替之。將2.0ml預溫(37℃)過的緩沖液加到一石英杯中。將連接在聚三氟氯乙烯上的細胞放入杯中，將該杯插入裝有磁力攪拌器的恒溫(37℃)箱中，用熒光分光光度計(Biomedical IustrumentGroup，University of Pennsylvania)測定熒光。使熒光信號穩(wěn)定約2分鐘。通過加入50μM NMDA和1μM的甘氨酸可使胞液游離鈣增加，(以熒光增強表示)。將5-20μl受試化合物儲液置磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)中，以適宜濃度加入杯中。采用Grynkiewicz.G.等(J.Biol.Chem.260∶3440(1985))建立的方法標定熒光信號及fura2/AM溢出校正。在完成各步試驗后，加入伊屋諾霉素(35μM)測定最大熒光值(Fmax)，繼之加入EGTA(12mM)將鈣螯合，測定最小熒熒光值(Fmin)。采用前述程序時，根據(jù)加入題目化合物所出現(xiàn)的熒光降低，即表示該化合物拮抗興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)的能力。
本發(fā)明的聚胺本身就可用于拮抗興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)。因此，也可將這類聚胺用于防治無脊椎害蟲，以及用于治療哺乳動物類興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)誘發(fā)的疾病和癥狀，例如，中風，腦缺血，神經(jīng)退化病(如Alzheimer氏病)和癲癇。所述聚胺還可用作哺乳類動物的精神病治療劑。此外，該聚胺還可用于研究包括(但不限于)神經(jīng)細胞在內(nèi)的細胞生理。
本發(fā)明聚胺的藥物上可以接受的鹽也屬于本發(fā)明的范疇。采用本技術領域普通技術人員熟知的方法即可制得這些鹽。例如，采用常規(guī)方法可以制得聚胺的酸成鹽。該聚胺的酸成鹽優(yōu)選例如鹽酸鹽，三氟乙酸鹽。特別優(yōu)選者是鹽酸鹽。
當將本發(fā)明聚胺或其藥物上可以接受的鹽施用于哺乳動物時，即可單獨服用，也可按規(guī)范制藥方法以藥用組合物的形式與藥物上可接受的載體或稀釋劑配伍使用。該類聚胺或其藥物上可以接受的鹽既可口服也可胃腸道外給藥。胃腸道外給藥包括靜脈、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下及外用給藥。
口服使用本發(fā)明聚胺或其藥物上可接受的鹽時，可以下列劑型服用該化合物，例如，片劑或膠囊劑，或者是水溶液或混懸液。就口服片劑而言，通常加入慣用的載體，其中包括乳糖、玉米淀粉，以及潤滑劑，例如，硬脂酸鎂。就用于口服的膠囊劑而言，有用的稀釋劑是乳糖和干燥玉米淀粉。在將含水混懸液用于口服時，將活性成分與乳化劑和懸浮劑混合。如有必要，還可加入某些甜味劑和/或香味劑。
就肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下及靜脈給藥而言，通常配制成活性成分的無菌溶液，并應適當?shù)卣{(diào)整該溶液的pH并制成緩沖液。在用于靜脈注射時，應控制所有溶質(zhì)的總濃度以制成等滲制劑。
在將本發(fā)明聚胺或其鹽用于人類時，一般臨床醫(yī)生即可確定其日劑量。但是，本發(fā)明聚胺適宜的劑量范圍是約3至30mg/kg/天。另外，該劑量可根據(jù)下述因素而變患者本身的年齡、體重和反應、以及患者癥狀的嚴重程度和所服用具體化合物的效力。因此，也可超出上述給定的劑量范圍，并且這也屬于本發(fā)明的范疇。
在將本發(fā)明聚胺或其鹽用于防治無脊椎害蟲時，將所述化合物直接施用于所說無脊椎害蟲，或施于所說無脊椎害蟲的生活環(huán)境。例如，將本發(fā)明化合物的溶液噴灑于所說無脊椎害蟲?？刂扑f無脊椎害蟲所需化合物的量隨害蟲及其生存環(huán)境而異，并且也可由施用該化合物的人員決定。
在將本發(fā)明聚胺或其鹽用于研究細胞生理時，可根據(jù)本領域普通技術人員熟知的方法將所述化合物施用于細胞。例如，以適宜的生理緩沖液將所述化合物施用于細胞。用于這類研究中的本發(fā)明化合物的適宜濃度是100μM。但是，在這類研究中，所述化合物的濃度可以高于或低于100μM。按照眾所周知的方法，本領域普通技術人員可以確定施用化合物的量。
實施例1.棚蛛屬aperta蜘蛛全毒液的初分離將棚蛛屬aperta蜘蛛全毒液(得自Natural Produet.Sciences.Inc.，Salt Lake City，Utah 84108，并在-78℃冷凍貯存)解凍，并將其從10-60μl稀釋至200μl，載于C-18 Vydac (22mm×250mm，孔徑300 ，粒徑10μ)柱，以15ml/min的流速洗脫，采用下述線性梯度程序0%→20%B，100%→80%A〔0→30分鐘〕，其中，A是0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液，B是乙腈。在220nm處進行單色峰檢測，采用ISCO/“FOXY”級份收集器及ISCO 2159峰檢器收集級份。收集0至30分鐘的級份。根據(jù)峰檢測，特別收集了如下級份級份 洗脫時間1 約13.8分鐘2 約19.25分鐘3 約21.0分鐘4 約22.3分鐘5 約23.1分鐘6 約26.0分鐘采用相同的柱及前述條件對級份1作了再分離，不同之處是使用了Waters 990二極管陣列檢測器，結(jié)果發(fā)現(xiàn)級份1含有聚胺AGEL 452。在共同未決的申請?zhí)枮?7/346，181的美國專利申請書中介紹了該聚胺，它并不構(gòu)成本發(fā)明的部分。按照再分離級份1的方法對級份2再分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)級份2含有聚胺AGEL 448和AGEL 468，在上述美國專利申請書(序號為07/346，181)中對兩者均作了介紹。這兩個聚胺均不構(gòu)成本發(fā)明的任何部分。此外，采用C-4 Vydac (22mm×250mm，孔徑300 ，粒徑10μ)柱，對級份3進行了再分離，所采用的線性梯度為5%→10%B，95%→90%A〔0→30分鐘〕，其中，A和B如前所述，并且還采用了Waters 990二極管陣列檢測器?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)級份2含有序號為07/346，181的美國專利申請書所介紹的聚胺504和505，這并不構(gòu)成本申請的部分。
實施例2.對級份4的再分離并確定其中的結(jié)構(gòu)將按實施例1所得的級份4載于C-18 Baker(4.6mm×250mm，孔徑300 ，粒度5μ)柱，以1ml/分的流速洗脫，并采用8%B，92%A的恒溶條件，其中A和B如實施例2所述。采用Waters 990二極管陣列峰檢器(λ＝220nm)進行峰檢測，按實施例1所述收集級份。在大約19.50分洗脫出再分離級份，在此，稱之為AGEL 521。按照標準方法，通過凍干除去洗脫劑，然后再凍干除水來制備供光譜分析用的級份AGEL 521。將凍干的級份AGEL 521化合物充氬下于大約-80℃保存，直到使用。
然后，采用FAB MS測定級份AGEL 521所含化合物的結(jié)構(gòu)。所得數(shù)據(jù)及由此推論出的結(jié)構(gòu)如下AGEL 521FAB MS(高分辨)觀察到(M+H)M/Z＝522.3774，經(jīng)計算為分子式C26H48N7O4(要求值522.3768)。
結(jié)構(gòu)1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(20-氨基-4，8-二羥基-4，8，12，17-四氮雜二十烷-1-基)
實施例3.級份5的再分離并測定其結(jié)構(gòu)將按實施例1所得級份5載于Dynamax Phenyl柱(4.6mm×250mm，孔徑60 ，粒徑8μ)，以1ml/分的流速進行洗脫，采用10%B，90%A的恒溶條件，其中A和B如實施例1所述。按實施例2所述方法進行峰檢測并收集級份。如下所述得到本文稱之為AGEL 464和416的級份級份 洗脫時間AGEL416 約26.47分鐘AGEL464 約37.76分鐘按實施例2所述方法制備并貯存供光譜分析用的級份AGEL 416和AGEL 464。
采用FAB MS測定級份416所含化合物的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下FAB MS(高分辨)觀察到(M+H)M/Z＝417.3336，經(jīng)計算為C23H41N6O4(要求值417.3342)結(jié)構(gòu)1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(16-氨基-4，8，13-三氮雜十六烷-1-基)
采用FAB MS測定了級份AGEL 464所含化合物的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下FAB MB(高分辨)觀察到(M+H)M/Z＝465.3173，經(jīng)計算為C23H41U6O4(要求值465.3189)結(jié)構(gòu)1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(16-氨基-4，8-二羥基-4，8，13-三氮雜十六烷-1-基)
實施例4.將級份6再分離并測定其結(jié)構(gòu)將按實施例1制得的級份6按實施例3方法載于Dynamax Phenyl柱，并洗脫。按實施例2所述方法進行峰檢測并收集級份。如下所示制得本文稱之為AGEL 489(A)和AGEL 489的級份
級份 洗脫時間AGEL 489 約41.95分鐘AGEL 489(A) 約55.27分鐘按實施例2所述方法制備并貯存供光譜分析用的級份AGEL 489(A)和AGEL 489。
采用FAB MB測定了級份AGEL 489(A)所含化合物的結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下FAB MS(高分辨)觀察到(M+H)M/Z＝489.3896，經(jīng)計算為C27H49N6O2(要求值489.3917)。
結(jié)構(gòu)1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(18-氨基-13，13-二甲基-4-羥基-4，8，13-三氮雜十八烷-1-基)。
采用FAB MS測定了級份AGEL 489所含化合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它是申請?zhí)枮?7/346，181的美國專利申請所述化合物AGEL 489。后者并不構(gòu)成本發(fā)明的部分。
實施例5.1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(16-氨基-4，8，13-三氮雜十六烷-1-基)。
按下述方法合成了題目化合物，經(jīng)確定為是實施例3所述級份AGEL 416所含的化合物
按Yamamoto，Hisashi，(J.Am.Chem.Soc.103∶6133-6136(1981))公開的方法，由丁二胺和丙烯腈制得了式Ⅰ化合物。
在氮氣下，將5.78g(0.041mole)式Ⅰ化合物(按前述A部分制得)加到75ml CH3CN和11.48g KF-硅藻土中，并攪拌之。攪拌下，將溶于25ml CH3CN中的9.75g(0.041mole)式Ⅱ化合物(按制備A所述方法制得)加到前述混合物中。將該反應物加熱回流6小時，然后冷卻至室溫，放置過夜。然后濾除KF-硅藻土，用CH3CN充分洗滌濾餅，將濾液減壓濃縮，得到14g粗油產(chǎn)物。將該粗產(chǎn)物在400g硅膠上進行層析，依次采用下述溶劑洗脫500ml二氯甲烷，然后1升85∶15 CH2Cl2/MeOH;繼之1升75∶25 CH2Cl2/MeOH;加有25ml異丙胺的1升75∶25 CH2Cl2/MeOH;加有50ml異丙胺的1升75∶25 CH2Cl2/MeOH;最后是加有75ml異丙胺的400ml 75∶25 CH2Cl2/MeOH。采用薄層層析監(jiān)測級份，經(jīng)NMR確認含有所期產(chǎn)物的級份，收集、減壓濃縮，得到4.7g前述式Ⅲ產(chǎn)物。
在氮氣條件下，將4.7g(15.8mmoles)式Ⅲ化合物(按前文B部分制備)溶解在150ml二氯甲烷中，然后加入7.56g(34.7mmoles)二叔丁基二碳酸酯，將該反應混合物在室溫下攪拌過夜，然后將該反應混合物減壓濃縮，在400g硅膠上進行層析，采用50∶50乙酸乙酯/己烷洗脫，采用TLC(50∶50乙酸乙酯/己烷)監(jiān)測級份，合并含有式Ⅳ產(chǎn)物的級份，減壓濃縮，得到7.9g油狀產(chǎn)物。
在氮氣條件下，將7.85g(15.8mmoles)式Ⅳ化合物(按前文C部分制備)及6.5g Pd(OH2)/炭加到125ml乙酸中。在50p.s.i下將該混合物氫化2小時。濾除催化劑，用乙酸充分洗滌濾餅，將濾液濃縮，移至250ml二氯甲烷中，用100ml 1N NaOH洗滌兩次，用K2CO3干燥。將該溶液過濾，將濾液減壓濃縮，得到7.8g式Ⅴ化合物。
在氮氣條件下，將7.15g(14.2mmoles)式Ⅴ化合物(按前述D部分制備)溶于150ml甲醇中，然后加入1.03ml(15.6mmoles)丙烯腈，將該反應物在室溫下攪拌72小時，然后減壓濃縮，加入二氯甲烷反復濃縮3次，汽提除去溶劑后，得到7.65g油狀式Ⅵ產(chǎn)物。
在氮氣氛下，將6.45g(11.6mmoles)式Ⅵ化合物(按前述E部分制備)溶于125ml二氯甲烷中，在該溶液中加入2.6g(12mmoles)二叔丁基二碳酸酯，并將該反應物在室溫下攪拌過夜。然后將該反應混合物濃縮，在400g硅膠上進行層析，采用50∶50乙酸乙酯/己烷洗脫。將產(chǎn)物級份合并，濃縮，得到6.6g油狀式Ⅷ產(chǎn)物。
在氮氣氛下，將6.6g(10.1mmoles)式Ⅶ化合物(按前述F部分制備及6g pd(OH)2/炭加到150ml乙酸中。在50p.s.i下將該混合物氫化2小時，濾除催化劑，用乙酸反復洗滌濾餅，將濾液濃縮，移入200ml二氯甲烷中，用100ml 1N NaOH洗滌兩次，將濾液減壓濃縮，得到6.5g式Ⅷ產(chǎn)物。
在氮氣氛下，將1.75g(10mmoles)吲哚乙酸，1.15g(10mmoles)N-羥基琥珀酰亞胺，2.06g(10mmoles)二環(huán)己基碳化二亞胺加到75ml四氫呋喃中。在室溫下攪拌該反應混合物，大約5分鐘后出現(xiàn)沉淀。大約1.5小時后，濾除沉淀，用75ml四氫呋喃洗滌濾餅，將該濾餅空氣干燥(1.84g)。合并濾液，濃縮，移至乙酸乙酯中，過濾，用乙酸乙酯洗滌濾餅。濃縮濾液，得到一泡沫狀物，將該泡沫狀物在75ml乙酸乙酯中研制，得到一硬質(zhì)凝膠。然后加入約30ml乙酸乙酯，繼之加入乙醚。過濾分離固體，用乙醚洗滌，在氮氣中干燥，得到1.74g式Ⅸ產(chǎn)物。用石油醚處理母液還可得到0.47g產(chǎn)物。
在氮氣氛下，將0.33g(5mmoles)式Ⅷ化合物(按前述G部分制備)在攪拌下溶于10ml二氯甲烷中，然后加入0.136g(5mmoles)式Ⅸ化合物(按前述H部分制備)。將該反應物在室溫下攪拌過夜。用二氯甲烷將該反應混合物稀釋至35ml，用10ml 0.5N NaOH洗滌，用K2CO3干燥，濃縮。該濃縮物經(jīng)硅膠層析，用4∶1乙酸乙酯/己烷洗脫。將產(chǎn)物級份濃縮，得到0.37g含有式Ⅹ產(chǎn)物及少量乙酸乙酯的白色泡沫狀物體。
在氮氣氛下，將0.37g(0.45mmoles)式Ⅹ化合物(按前述Ⅰ部分制備)溶于10ml二氯甲烷中，然后加入0.218g(1mmole)二叔丁基二碳酸酯，繼之加入12ml(0.1mmole)4-(N，N-二甲基氨基)吡啶。將該反應物在室溫下反應1小時，然后靜置過夜。該反應混合物經(jīng)硅膠層析，用4∶1乙酸乙酯/己烷洗脫，濃縮產(chǎn)物級份，得到0.32g白色泡沫狀式Ⅺ產(chǎn)物。
在氮氣氛下，將0.32g(0.35mmoles)式Ⅺ化合物(按前述J部分制備)加到15ml三氟乙酸中，攪拌15分鐘，然后將該反應混合物減壓濃縮，用乙醚研制，得到0.30g白色粉末狀產(chǎn)物。
制備A.
在氮氣氛下，將34.5g(157.6mmoles)3-溴丙胺·HBr置于600mlN，N-二甲基甲酰胺中，攪拌，在該溶液中加入34.4g(157.6mmoles)二叔丁基二碳酸酯，然后加入32.3ml(236mmoles)三乙胺。立即出現(xiàn)沉淀。將該反應物攪拌過夜，然后用乙酸乙酯將該反應物稀釋至1.5升，用500ml 1NHCl洗滌1次，用500ml水洗滌3次，再用鹽水洗滌1次，最后用Na2SO4干燥。經(jīng)濃縮后，將產(chǎn)物在800g硅膠上進行層析，用4∶1己烷/乙酸乙酯洗脫，采用TLC(KMNO4/I2)監(jiān)測級份，合并含產(chǎn)物的級份，減壓濃縮，用50ml二氯甲烷共蒸餾2次，高真空蒸餾純化，得到25.8g本制備的產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種制備基本純凈的選自下述化合物及其藥學上可以接受的鹽的方法
式中各R相同，并代表H或OH，該方法的特征在于(a)如果期望得到下式化合物
將棚蛛屬蜘蛛(Agelenopsisaperta)的全毒液載于C-18Vydac 柱(22mm×250mm，300 孔徑，粒徑為10μ)，采用15毫升/分的流速進行洗脫，采用下述線性梯度程序溶劑系統(tǒng)0%→20%乙腈、100%→80%0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm處進行單色譜峰檢測，收集在大約26.0分鐘時洗脫出的級份，如果采用DynamaxPheny1柱(4.6mm×250mm，60 孔徑，粒徑為8μ)，以1毫升/分的流速洗脫，采用10%乙腈和90%0.1%三氟乙酸恒溶條件，在220nm處進行峰檢測，則收集在大約55.27分鐘洗脫出的級份，任意地凍干，再混懸于水中，凍干除去水；(b)如果制備下式化合物
將棚蛛屬蜘蛛(Agelenopsis aperta)全毒液載于C-18 Vydac 柱(22mm×250mm，孔徑300 ，粒徑10μ)，采用15毫升/分的流速洗脫，采用下述線性梯度程序溶劑系統(tǒng)0%→20%乙腈、100%→80% 0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm進行單色譜峰檢測，收集大約22.3分鐘洗脫出的級份;如果采用C-18Baker柱(4.6mm×250mm，孔徑300 ，粒徑5μ)，則以1毫升/分的流速進行洗脫，采用8%乙腈和92% 0.1%三氟乙酸水溶液的恒溶條件，在220nm處進行峰檢測，收集大約19.5分鐘洗脫出的級份;任意地凍干，再混懸于水中，凍干除去水; (c)如果制備下式化合物
式中各R是羥基，將棚蛛屬蜘蛛(Agelenopsis aperta)全毒液載于C-18 Vydac 柱(22mm×250mm，孔徑300 ，粒徑10μ)，采用15毫升/分的流速洗脫，采用下述線性梯度程序溶劑系統(tǒng)0%→20%乙腈，100%→80% 0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm進行單色譜峰檢測，收集大約23.1分鐘洗脫出的級份;如果采用Dynamax Phenyl柱(4.6mm×250mm，孔徑60 ，粒徑8μ)，則以1毫升/分的流速進行洗脫，采用10%乙腈和90% 0.1%三氟乙酸水溶液的恒溶條件，在220nm處進行峰檢測，收集大約37.76分鐘洗脫出的級份;任意地凍干，再混懸于水中，凍干除去水; (d)如果制備下式化合物
式中各R是H將棚蛛屬蜘蛛(Agelenorsis aperta)全毒液載于C-18Vydac
柱(22mm×250mm，孔徑300
，粒徑10μ)，采用15毫升/分的流速洗脫，采用下述線性梯度程序溶劑系統(tǒng)0%→20%乙腈，100%→80% 0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm進行單色譜峰檢測，收集大約23.1分鐘洗脫出的級份;如果采用Dynamax Phenyl柱(4.6mm×250mm，孔徑60
，粒徑8μ)，則以1毫升/分的流速進行洗脫，采用10%乙腈和90% 0.1%三氟乙酸水溶液的恒溶條件，在220nm處進行峰檢測，收集大約26.47分鐘洗脫出的級份;任意地凍干，再混懸于水中，凍干除去水;或者，另一方法是在反應惰性溶劑中，在惰性氣氛下，下式(Ⅸ)化合物與式(Ⅷ)化合物反應，
使其產(chǎn)物在惰性氣氛下與二叔丁基二碳酸酯反應，然后與4-(N，N-二甲基氨基)吡啶反應，并使其產(chǎn)物在惰性氣氛中與三氟乙酸反應;任意地采用眾所周知的已知方法，將所述化合物轉(zhuǎn)化為藥物上可以接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及某些發(fā)現(xiàn)于棚蛛屬aperta蜘蛛毒液中的聚胺類化合物。這類聚胺及其鹽拮抗興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)，該傳導遞質(zhì)作用于各種生物的細胞，并可用于拮抗興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)本身，以及用于治療由興奮型氨基酸神經(jīng)傳導遞質(zhì)誘發(fā)的疾病和癥狀，防治無脊椎類害蟲，還涉及包括所述聚胺及其鹽的組分物。
文檔編號A61P25/00GK1053059SQ90110248
公開日1991年7月17日 申請日期1990年12月31日 優(yōu)先權(quán)日1990年1月2日
發(fā)明者尼古拉斯·A·薩科曼諾, 羅伯德·A·福爾克曼 申請人:美國輝瑞有限公司, 自然產(chǎn)品科學有限公司