專利名稱：含水蛭素衍生物的分泌物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由大腸桿菌分泌型突變株獲得水蛭素衍生物的方法，并涉及N-末端的氨基酸序列為Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物。
水蛭素是一種多肽，具有65個氨基酸，原由藥用水蛭濾液中分離得到，其功能是與凝血酶形成穩(wěn)定的復合物從而對于凝血酶具有高度特異的抑制作用，因此有許多可能的治療作用，特別是抗凝血治療。(F.Markquardt，Biomed.Biochim.Acta 44(1985)，1007-1013)。
已經(jīng)發(fā)表的完整水蛭素氨基酸序列(J.Dodt et al.，F(xiàn)EBS LETTERS 165(2)，(1984)，180-184)是用重組DNA技術并在微生物中表達來制備水蛭素的必要條件。
EP-A-0 158 564(Transgene)揭示了在宿主細胞，特別是在細菌細胞中表達水蛭素或水蛭素類似物的克隆載體。在本案中，藥用水蛭濾液中，以mRNA開始進行cRNA的合成來獲得水蛭素的基因編碼，特別強調地描述了具有N-末端序列為Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物及其獲得該衍生物的方法。
EP-A-0 168 342(Ciba Geigy)揭示了編碼水蛭素自然氨基酸序列的DNA序列，其氨基酸N-末端序列是Val-Val-Tyr-Thr-Asp。水蛭素在大腸桿菌和啤酒酵母菌的細胞內表達。
EP-A-0 171 024(Hoechst AG)公開了制備有水蛭素活性的多肽基因工程的方法，特別是在大腸桿菌內制備，并裂解細胞，從細胞提取物中獲得具有水蛭素活性的多肽。在適當位置由蛋白分解或化學分解而剪切融合蛋白，純化剪切后的水蛭素分子。
DE-A 34 45 571(GEN-BIO-TEC)涉及一種具有水蛭素生物活性蛋白DNA序列編碼，以及從大腸桿菌細胞獲得該蛋白的方法，由適當重組載體轉化大腸桿菌，并溶解該大腸桿菌細胞而獲得水蛭素活性蛋白。
Bergmann等(Biol，Chem，Hoppe，Seyler 367(1986)，731-740)描述了在大腸桿菌內合成水蛭素，水蛭素的釋放是通過甲苯處理細胞，但產(chǎn)量低，大約500mg/l A578細胞單位。
EP-A-0 200 655(Transgene)、Ep-A-0 252 854(Transgene)和EP-A-0 225 633(Ciba Geigy)披露了由真核宿主生物分泌獲得有水蛭素活性的蛋白，特別是酵母，在這里載體發(fā)生了表達，該載體含有一個DNA序列，該序列在結構基因的上游含有一個信號肽。具有N-末端序列為Val-Val-Tyr-Thr-Asp和Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物能夠由酵母中分泌，據(jù)報道在這種情況下，產(chǎn)量達到100mg/l。
DE-A 39 00 626(Hoechst AG)公開了一種具有N-末端Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp序列的水蛭素衍生物。該衍生物優(yōu)選在酵母內得以表達利用酵母信息素基因MFα的啟動子和信號序列表達和分泌水蛭素的衍生物。
然而上述制備水蛭素衍生物的方法均有其各自的缺點。當酵母作為宿主生物時，水蛭素被分泌到培養(yǎng)基中，能獲得相對高的產(chǎn)量，但酵母培養(yǎng)時間和要求條件比細菌(如大腸桿菌)時間長和條件苛刻。而用大腸桿菌作為宿主生物時，其產(chǎn)量相對低并且需要復雜的純化手段和裂解程序。
因此本發(fā)明的目的在于研制一種直接獲得水蛭素衍生物的方法，并且該方法不必裂解細胞而能獲得高產(chǎn)量的水蛭素衍生物。
本發(fā)明涉及一種由大腸桿菌分泌型突變株獲得水蛭素衍生物的方法，包括(1)以編碼水蛭素衍生物的基因定位于編碼細菌信號肽的DNA片段下游的方式構建重組載體，(2)按步驟(1)構建的重組載體轉化大腸桿菌分泌型突變株，(3)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化后的細菌，并，(4)從培養(yǎng)基中獲得水蛭素衍生物。
根據(jù)本發(fā)明，水蛭素衍生物就是源于水蛭素的一組蛋白，水蛭素衍生物功能是起凝血酶抑制劑的作用，其特異的活性至少是10，000AT-U/mg(抗凝血酶單位)(Dodt et al.，Biol.chem.Hoppe Seyler 366(1985)，379-385)。水蛭素衍生物還包括具有N-末端融合部分的融合蛋白，該融合部分大約達50個氨基酸長，并可利用蛋白溶解或化學剪切方法部分或全部切開該融合部分，這種剪切產(chǎn)物即為水蛭素衍生物，其特異的活性單位至少為10，000AT-U/mg。
根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的水蛭素衍生物具有下列N-末端氨基酸序列(X)m-Z-Thr-Tyr-Thr-Asp其中m＝0到50，X代表相同或不同的遺傳上可編碼的氨基酸，Z代表可基因編碼的如下選出的一種氨基酸，它包括，Leu，Ile，Aal，Val，Gly，Ser，Asp，Glu，Asn，Gln，His，Met，Phe和Tyr。
在該序列中m大于零時，則序列X優(yōu)選含有蛋白溶解或化學切割位置，特別是在其末端。例如，如果序列X中最后氨基酸是Arg殘基，則融合序列X可被胰酶消化剪切(在Arg后面剪切)，活性水蛭素衍生物才能被純化。然而用其它已知的水解酶和化學剪切劑也同樣可能切掉融合蛋白部分。例如X序列末端帶有Met殘基，則可被鹵化氰所剪切(E.Gross and B.Wittkop，J.Am.Chem.Soc.82(1961)1510-1517)。如果X序列C-末端含有氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg，則用Xa因子也可將其剪切(EP-A 0 025 190和EP-A 0 161 973)。
根據(jù)發(fā)明的方法，當m＝0時，Z優(yōu)選代表Gln，His，Phe，Tyr，Gly，Ser，Asp或Asn，特別優(yōu)選的是Ala，Gly，Ser，Asp或Asn。最優(yōu)選的是，水蛭素衍生物的m為0，其Z代表Ala。
因此，本發(fā)明涉及具有N-末端序列為A-Thr-Tyr-Thr-Asp的水蛭素衍生物，其中，A代表Gln，His，Phe，Tyr，Gly，Ser，Asp或Asn，優(yōu)選為Ala，Gly，Ser，Asp或Asn，最優(yōu)選的是該衍生物N-末端序列為Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp，更令人驚奇的是已有可能由大腸桿菌分泌型突變株的上清培養(yǎng)液中得到每升培養(yǎng)基中含超過2克的活性水蛭素。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其另一優(yōu)點是由于水蛭素衍生物分泌到細菌培養(yǎng)基中，從而使水蛭素在培養(yǎng)基中氧化條件下形成二硫鍵。
根據(jù)本發(fā)明，大腸桿菌分泌型突變株是指在培養(yǎng)基中可分泌大量蛋白質的大腸桿菌株。這些分泌株的制備方法在EP-A-0 338 410中注明。特別是，該大腸桿菌突變株來源于DS410大腸桿菌(DSM 4513)或BW7261大腸桿菌(DSM 5231)。首先這種獨特的大腸桿菌株由含有編碼可分泌蛋白DNA序列的質粒所轉化，轉化的大腸桿菌株再經(jīng)過致突變，例如用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理，然后選擇合適的分泌型突變株。例如，如果所應用的分泌蛋白是α-環(huán)糊精糖基轉移酶(α-Cyclodextrin glycosyltransferase CGTase)則可借助于對D-環(huán)絲氨酸底物的抵抗來識別分泌突變株，D-環(huán)絲氨酸對于細胞壁是具有活性。此外，CGTase的分泌能使周圍培養(yǎng)基中淀粉水解，當使用支鏈淀粉天青色培養(yǎng)基時，這種水解提供了選擇分泌型突變株的補充選擇余地。
適合于本發(fā)明的重組載體為能夠整合到大腸桿菌的基因組中(例如λ-噬菌體)，或在轉化的大腸桿菌的染色體外存在(例如質粒)的載體。質粒是優(yōu)先選用的。
在重組載體上的基因構建以及編碼由信號肽組成的蛋白和水蛭素衍生物組成的蛋白的基因構建，最好是在一種可誘導的啟動子的控制下進行，特別是在trp-lac融合啟動子控制之下，可添加乳糖或IPTG(異丙基β-D-半乳糖硫苷)誘導該啟動子。此外，在載體適當?shù)奈恢蒙蠎羞x擇記號基因和乳糖抑制基因。
原則上可允許大腸桿菌膜滲透的多種已知信號肽均作為適宜的細菌信號序列，該信號序列使水蛭素衍生物分泌成為可能，因此，優(yōu)先選用的是革蘭氏陰性菌的信號肽。(例如，下列大腸桿菌的蛋白質可作為信號肽蛋白質外膜蛋白OmpA(DiRienzo et al.，1978 Ann.Rev.Biochem.47481-532)堿性磷酸酶PhoA(Inouye et al.，1982 J.Bacterlol.149434-439)LamB蛋白(Hedgpeth et al.，1980 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 772621-2625)麥芽糖結合蛋白MalE(Bedouelle H.et al.，1980 Nature 28578-81)。特別優(yōu)選使用的是CGTase信號肽。
根據(jù)本發(fā)明的方法，適合本發(fā)明的載體是pCM705質粒(

圖1)，該質粒從pCM703質粒中獲得，將一個約1kb長的Nru I片段從質粒pCM703中刪除即可得到pCM705，EP-A-0 383 410中公開pCM703質粒。該載體含有一個抗青霉素基因，乳糖抑制基因和一個在5'末端編碼信號肽的CGT酶基因。編碼水蛭素衍生物的基因以下述方法整合到pCM705載體中即在細胞內產(chǎn)生一個N-末端含有α-CGT酶信號肽的前體分子，基因構建受tac啟動子控制，大腸桿菌分泌型突變株由上述質粒轉化。
陽性轉化的克隆在搖瓶中培養(yǎng)或在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，當光密度(OD600)達到約為1時，用異丙基β-D-半乳糖硫苷(isopropyl β-D-thiogalactoside IPTG)或半乳糖進行誘導。
水蛭素衍生物產(chǎn)生過程由凝血酶滅活試驗所檢測(Griesbach et al.，Thrombosis Research 37，(1985)，347-350)。用HPLC柱層析分析(反相)融合蛋白的積聚。剪切融合蛋白的前部分，可純化得到活性水蛭素衍生物。
下面將結合附圖1-5解釋本發(fā)明的細節(jié)。
圖1表示pCM705質粒，(核對1至9000個核苷酸的該質粒圖)
圖2表示采自pK152含有合成水蛭素基因的DNA序列。
圖3表示HIR1，HIR2和HIR3寡聚核苷酸的序列。
圖4表示pCM7051質粒。(核對1至6500的6500個核苷酸的該質粒圖)以及，圖5表示pCM7053質粒(核對1至5180的5180個核苷酸的該質粒圖)。
實施例1分泌載體的構建。
pK152質粒含有合成水蛭素基因，其序列在EP-A-0171 024中列出。從該質粒起始端開始，Hinf I-HindⅢDNA片段大小約為200bp，它包含編碼水蛭素絕大部分的DNA序列，并被瓊脂糖凝膠電泳分離(圖2)，缺失的5'-末端序列由新合成的寡聚核苷酸再生，寡聚核苷酸的編碼序列如圖3所示。Hinf I末端融合產(chǎn)生了帶有N-末端序列Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp水蛭素衍生物。
pCM705質粒(圖1)由Pst I和Hind Ⅲ剪切，2個剪切點位于編碼CGT酶基因區(qū)內，結果約1kb大小的DNA片段被切掉，Pst I正好在編碼信號肽酶剪切部位的區(qū)域內剪切。
pCM705 Pst I-Hind Ⅲ 6.3 kb片段，pK152 Hinf I-Hind Ⅲ 0.2 kb和寡聚核苷酸HIR1被連在一起，形成pCM7051質粒(圖4)，用該聯(lián)結物轉化HB101大腸桿菌(DSM 1607)，分離純化在含天青支鏈淀粉的選擇培養(yǎng)基中沒有分解淀物帶的同源克隆，該克隆不能表達α-CGT酶。從幾個純化克隆中分離質粒DNA，由限制性分析而定性，經(jīng)融合區(qū)序列分析具有水蛭素插入的2個質粒。
用Nru I和Nde I剪切含有正確的水蛭素基因構建的質粒DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到大小為5.18 kb的片段。
由于Nde I剪切，序列突出由klenow酶再作用之后，片段經(jīng)連接而環(huán)化，該質粒稱為pCM7053(圖5)。
pCM7053質粒用于轉化分泌型突變的大腸桿菌株WCM100，該株由EP-A-0 338 410描述的方法而獲得。
實施例2在搖動瓶試驗中檢測水蛭素分泌。
10ml含有100μg/ml氨芐青霉素的被接種上WCM100 pCM7053新鮮過夜培養(yǎng)物，使光密度達OD420＝0.1，30℃振動培養(yǎng)，當光密度OD420＝1.0時，加入誘導劑乳糖，最終濃度為1%，48小時后，取出培養(yǎng)物，離心去掉細菌，測定上清液中水蛭素的濃度，測定方法是凝血酶滅活試驗，產(chǎn)量達到4000AT-U/ml(抗凝血酶單位)(≈250mg/l)。
實施例3在10升發(fā)酵罐中生產(chǎn)水蛭素7升含有100μg/ml氨芐青霉素基礎培養(yǎng)基，被接種上新鮮過夜WCM100 pCM7053培養(yǎng)物，使其光密度達OD600＝0.1，發(fā)酵條件為溫度30℃振蕩頻率450-950rpm通氣0.5-1.5VvmpH7.0±0.1當光密度OD600達到1.0時，加入0.5mM IPTG.(isopropyl β-D-thiogalactoside)。
加入IPTG40小時后，上清液中水蛭素為36，000AT-U/ml(≈2.25g/l)。
實施例4具有N-末端序列Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp水蛭素的分泌。
程序同例1，但用寡聚核苷酸HIR2(圖3)代替寡聚核苷酸HIR1，結果切除帶有N-末端序列Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp的信號肽后獲得水蛭素融合蛋白，上清液中這種融合蛋白的積聚用反相HPIC測定分析(C18層析柱)。攜帶有構建基因的WCM 100株的發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)率為25mg/l融合蛋白。
用由胰酶剪切獲得N-末端攜帶有Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp序列的活性水蛭素。
實施例5WCM88分泌型突變株水蛭素的分泌。
WCM88分泌型突變株獲得方式同EP-A-0 338 410敘述的方法相同，是由pCM7053質粒轉化而來(見例1)。生產(chǎn)的水蛭素分泌到培養(yǎng)基中可在搖動瓶或發(fā)酵罐中檢測。
a)搖瓶實驗同例2一樣培養(yǎng)WCM 88 pCM7053株在48小時后測定培養(yǎng)基上清液中水蛭素的濃度，其產(chǎn)率達1800AT-U/ml(≈110mg/l)b)10升發(fā)酵罐中生產(chǎn)如例3培養(yǎng)菌株。加入IPTG45小時后，上清液中可能達到21，000AT-U/ml(≈1.3g/l)。
實施例6
帶抗四環(huán)素基因分泌載體的構建。
分離的1.1kb的質粒pBR322的Nru I-片段與Nru-I剪切下來的pCM7051的線狀片段連接，連接物用于轉化HP101大腸桿菌。篩選具有抗四環(huán)素作用的轉化物。從選擇后的克隆中重新分離質粒-DNA并用Nde I和Ava I剪切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離較大片段后，由klenew酶補齊粘性末端，然后連接。
上述產(chǎn)生的質粒稱為pCMT203。
實施例7應用pCMT203分泌載體分泌水蛭素。
用pCMT203質粒轉化WCM 100分泌型突變株轉化后按例3描述的方法在10升發(fā)酵罐中培養(yǎng)加入IPTG45小時后產(chǎn)生42，000AT-U/ml的水蛭素。
權利要求
1.由大腸桿菌分泌型突變株獲得水蛭素衍生物的方法，其特征是(1)以編碼水蛭素衍生物的基因直接定位于編碼細菌信號肽的DNA片段下游的方式構建重組載體，(2)按步驟(1)構建的重組載體轉化大腸桿菌分泌型突變株，(3)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化后的細菌，并(4)從培養(yǎng)基中獲得水蛭素衍生物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征質粒用作重組載體。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征是構建一種編碼水蛭素和編碼信號肽的DNA序列在可誘導的啟動子控制之下被定位的重組載體。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是可誘導的啟動子是trp-lac融合啟動子。
5.根據(jù)上述權利要求之一所述的方法，其特征是應用革蘭氏陰性細菌的信號肽。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征是所使用的信號肽是α-環(huán)糊精糖基轉移酶信號肽。
7.根據(jù)上述權利要求之一所述的方法，其特征是一種從大腸桿菌株DS410(DSM 4513)或BW 7261(DSM 5231)中經(jīng)過致突變篩選其分泌特性而獲得的細菌株，被用作大腸桿菌分泌型突變株。
8.根據(jù)上述權利要求之一所述的方法，其特征是所述的水蛭素衍生物具有下列N-末端氨基酸序列(X)m-Z-Thr-Tyr-Thr-Asp其中，m＝0到50，X代表相同或不同基因編碼的氨基酸，Z代表由下述的氨基酸中選出的可基因編碼氨基酸，包括His，Leu，Ile，Ala，Val，Gly，Ser，Asp，Glu，Asn，Gln，Met，Phe和Tyr。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征是序列X含有蛋白水解或化學剪切部位。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征是所述的m＝0，Z代表Ala，Gln，His，Phe，Tyr，Gly，Ser，Asp或Asn。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其特征是Z代表Ala，Gly，Ser，Asp或Asn。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其特征是Z代表Ala。
13.一種水蛭素衍生物，其特征是其N-末端氨基酸序列為A-Thr-Tyr-Thr-Asp，其中A代表Ala，Gln，His，Phe，Tyr，Gly，Ser，Asp或Asn。
14.根據(jù)權利要求13所述的水蛭素衍生物，其特征是A代表Ala，Gly，Ser，Asp或Asn。
15.根據(jù)權利要求14所述的水蛭素衍生物，其特征是A代表Ala。
16.重組DNA，其特征是它編碼按照權利要求13至15之一所述的水蛭素衍生物。
17.重組載體，其特征是含有1個或多個基因構建的拷貝，該構建的基因編碼由細菌信號肽組成的蛋白和水蛭素衍生物組成的蛋白。
18.根據(jù)權利要求17所述重組載體，其特征是信號肽來源于革蘭氏陰性菌。
19.根據(jù)權利要求16到18之一所述的重組載體，其特征是所述的信號肽來源于α-環(huán)糊精糖基轉移酶基因(α-cyclodextrin glycosyltransferase gene)。
20.根據(jù)權利要求17至19之一所述的重組載體，其特征是水蛭素衍生物具有如下N-末端氨基酸序列(X)m-Z-Thr-Tyr-Thr-Asp其中，m＝0到50，X代表相同或不同的可基因編碼的氨基酸，Z代表由下述氨基酸中選出的可基因編碼的氨基酸包括His，Leu，Ile，Ala，Val，Gly，Ser，Asp，Glu，Asn，Gln，Met，Phe和Tyr。
21.根據(jù)權利要求20所述的重組載體，其特征在于水蛭素衍生物的N-末端序列為Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp。
全文摘要
由大腸桿菌分泌型突變株獲得水蛭素衍生物的方法包括(1)以編碼水蛭素衍生物的基因直接定位于編碼細菌信號肽的DNA片段下游的方式構建重組載體，(2)用構建的重組載體轉化大腸桿菌分泌型突變株，(3)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化后的細菌，(4)由培養(yǎng)基中獲得水蛭素衍生物，并獲得含有一個或更多個基因構建的拷貝的重組載體，該構建基因編碼由細菌信號肽組成的蛋白和水蛭素衍生物組成的蛋白，水蛭素衍生物N-末端氨基酸序列是A-Thr-Tyr-Thr-Asp.其中A為Ala，Gln，His，Phe，Tyr，Glu，Ser，Asp或Asn。
文檔編號A61P7/02GK1055010SQ9110168
公開日1991年10月2日 申請日期1991年3月21日 優(yōu)先權日1990年3月22日
發(fā)明者格哈德·施密德, 保羅·哈貝爾曼 申請人:聯(lián)合電化學工業(yè)股份有限公司