專利名稱：植物毒素白樹因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及純化的白樹因及由此產(chǎn)生的毒性片段，以及編碼白樹因的DNA順序和通過DNA重組技術(shù)利用DNA生產(chǎn)白樹因及其毒性片段和融合蛋白質(zhì)。更確切地說，本發(fā)明講的是白樹因的初級氨基酸順序及編碼白樹因的DNA順序，以及合成白樹因及其毒性片段的生產(chǎn)。
用于任何疾病治療的藥物的設(shè)計所面臨的主要問題是其特異性和功效。用于癌癥治療的各種藥物也同樣面臨這類問題。使毒性藥物選擇性地作用于某些腫瘤已成為過去幾年中熱衷研究的主題(Thorpe，1985，Biol Clin Applications，84475-512;Moller ed.，1982，Immun.Rev.621-215)。近些年來，單克隆抗體和多克隆抗體，植物血凝素，淋巴激活素以及激素，這些能識別腫瘤細胞表面特異決定簇(determinants)的物質(zhì)都已被用作載體將毒性藥劑輸送進細胞，使后者能夠發(fā)揮它們的細胞毒性潛力(Blattler，et al.，1985，Biochemistry，241517-1524;Frankel，et al.，1985J.Biol.Res.Modif.，4437-446;Reimann，et al.，1988，J.Clin.Invest.82129-138;Schwartz and Vale，1988，Endocrinology，1221695-1700;Scott，et al.，1987，J.Natl.Cancer Inst.791163-1172;Singh，et al.，1989，Biol.Chem.2643089-3095;Srinivasan，et al.，1985，F(xiàn)EBS Letters，192113;Schwartz，et al.，1987，Endocrinology，1211454-1460)。在這些傳遞性藥劑中，迄今已研究過的毒性部分包括放射性核素(Ghose，et al.，1967，Br.Med.J.190-96)，通常用于癌癥化療的細胞毒性藥物(Thorp and Ross，1982，Immun.Rev.62119-157;Deweger，et al.，Immun.Rev.6229-45;Arnon and Sela，1982，Immun.Rev.625-27;Pimm，et al.，1982，Cancer Immun.Immunotherap.12125-134;Rowl and and Axton，1985，Cancer Immun.Immunotherap.191-7)以及來自細菌和植物如白喉或蓖麻毒的蛋白質(zhì)(Jansen，et al.，1982 Immun.Rev.62185-216;Raso，1982，Immun.Rev.6293-117;Vitetta，et al.，1982，Immun.Rev.62159-183，Nelville and Youle，1982，Immun.Rev.6247-73;Thorpe，et al.，1981，Eur.J.Biochem.116447-454)。通過以某種抗體或激素取代其非特異性的B鏈而設(shè)計出一種特異性的分子。
細菌和植物毒素，如白喉毒素(DT)，綠膿桿菌毒素A(Pseudomo-nas aeruginosa toxinA)，紅豆因，蓖麻毒，槲寄生，modeccin以及志賀氏菌毒素，都是有效的殺細胞藥劑，這是由于它們具有破壞關(guān)鍵性細胞功能的能力。例如，白喉毒素和蓖麻毒分別通過使伸長因子-2失活和使核糖體60s亞基失活而抑制細胞的蛋白質(zhì)合(Bacterial Toxins and Cell Membranes，Eds.Jelajaszewicz and Wadstrom，1978，Academic Press，P.291)。因為這些毒素是酶，通過催化作用而不是通過化學(xué)數(shù)量增加而起作用，因此它們極其有效。這此毒素的分子通常由具酶促活性多肽鏈或片段(通常稱為“A”鏈或片段)，與一個或多個多肽鏈或片段(通常稱為“B”鏈或片段)連接組成，后者粘附到細胞的表面并使A鏈到達它的活性位點(如細胞溶質(zhì)中)以行使其破壞功能。這種使A鏈進入細胞溶質(zhì)中的作用在不同地方分別被稱為“內(nèi)在化in-ternalization”，“中毒intoxication”，或“易位translocation”。這些蛋白質(zhì)毒素屬于一類帶有兩條鏈(分別稱為A鏈和B鏈)的物質(zhì)。B鏈具備粘附于幾乎所有細胞的能力，而行使細胞毒性活性的卻是A鏈。一般認為A鏈必須及時地從B鏈中解離出來-通常通過二硫鍵的還原-以使A鏈具有功能。因為這些天然毒素的B鏈可識別并粘附于不同類型細胞的受體，因此它們通常不能選擇性地作用于給定的細胞或組織類型。
某種當(dāng)單獨使用時對各種細胞不具備細胞毒性的毒素分子的實用性是有限的。某些天然存在的單鏈毒素分子因為它們本身并不能附著于細胞表面的受體，因此通常不能被細胞攝入。它們的利用提供了一些當(dāng)單獨使用時對大多數(shù)細胞(如果不是所有細胞的話)相對來說是沒有毒性的毒素分子。到目前為止，這樣的已知天然存在的單鏈毒素包括(當(dāng)然并不局限于)美國商陸抗病毒蛋白(Ramakrishnan and Houston，1984，Cancer Res.44201-208)，皂角苷(Thorpe，et al.，1985，J.Natl.Cancer Inst.75151-159)，以及白樹因(Stirpe，et al.，1980，J.Biol.Chem.2556947-6953)。這些蛋白質(zhì)在游離形式時對細胞是沒有毒性的，但是一旦它們進入細胞即可抑制細胞的蛋白質(zhì)合成。然而，這些單鏈毒素在純的形式下的利用是很有限的，因為事實上，它們必須從植物資源中精煉出來，而它們在這些植物中的含量本來就比較低，并且在這些植物中這類濃縮的毒素的再生性依賴于該植物的生長條件以及植物的收成。
白樹因(Gelonin)是一種從多花白樹(Gelonium multiforum的種子中分離得到的單鏈多肽，分子量大約為28，000-30，000kd(千道爾頓)。白樹因是一種堿性糖蛋白，等電點大約為8.15，含有甘露糖和氨基葡糖殘基(Falasca，et al.，1982，Biochem J.207505-509)。對比其他植物和細菌毒素，這種蛋白質(zhì)本身對細胞沒有毒性，但當(dāng)它通過載體或媒介物而被運送到細胞時，它所以破壞核糖體60s亞基。體內(nèi)和體外的生物學(xué)數(shù)據(jù)都表明白樹因等價于其他植物毒素甚至超過它們。事實上，若將白樹因在體外和體內(nèi)的軛合物與其他的A鏈軛合物作一比較，就會發(fā)現(xiàn)它具有相似的功效，選擇性更好，腫瘤定位作用更強，并且具有更顯著的治療效果(Sivan，et al.，1987，Cancer Res.473169-3173)。然而，從自然資源中獲取可再生的，很容易拿到的白樹因仍是有限的。此外，從植物資源中精煉純化白樹因也十分困難，產(chǎn)量很低。
實驗表明，白樹因單獨使用時能引起小鼠流產(chǎn)，并且增加依賴細胞的細胞毒性的抗體(Yeung，et al.，1988，Internatl.J.Peptide Pro-tein Res.31265-268)。
一些研究人員已將白樹因用作通過化學(xué)法粘附于單克隆抗體或肽類激素的細胞定向配位體的細胞毒性劑。然而，白樹因和細胞定向部分的化學(xué)修飾會降低定向效果和白樹因本身的細胞毒性效力。而且，白樹因的天然資源很易受植物的收成的變化和生長影響，植物生長會影響白樹因的胞毒活性。而利用化學(xué)法或DNA重組技術(shù)生產(chǎn)合成白樹因的技術(shù)提供了這種毒素豐富的可再生資源。
本發(fā)明提供了被純化的白樹因，它具有

圖1所示的氨基酸順序。該項發(fā)明也提供了圖2所示的編碼白樹因的DNA順序。利用發(fā)明中的氨基酸和DNA順序，通過重組技術(shù)大量生產(chǎn)基本純化的白樹因?qū)⑻峁┐罅康亩舅?，而在此之前，它是從自然資源的提煉中不可能做到的。
圖1所示為白樹因的氨基酸順序。
圖2表明了編碼白樹因的cDNA結(jié)構(gòu)。
圖3表明了白樹因的氨基酸順序與栝樓因(trichosanthin)，蓖麻毒A鏈，從蓖麻中分離得到的凝集素前體和紅豆因A鏈的氨基酸順序之間的同源性。
圖4表明了溴化氰片段的高壓液相色譜(HPLC)圖形。
圖5表明了白樹因經(jīng)(A)賴氨酸氨肽酶Lys-c(B)葡萄球菌蛋白酶，以及(C)羥胺消化后的HPLC圖譜。
圖6表明了白樹因(A)，栝樓因(B)，紅豆因(C)，蓖麻毒(D)，以及凝集素前體(E)的疏水性。
本發(fā)明中所用到的術(shù)語“substantially pure”是指這種多肽制劑基本上已不含自然狀態(tài)下通常伴隨著白樹素的其他植物蛋白質(zhì)，并能表現(xiàn)可重復(fù)的電泳或色譜反應(yīng)，洗脫圖形以及毒理活性測定的結(jié)果。術(shù)語“基本純”并不排除白樹因蛋白質(zhì)與其他化合物的人造或合成的混合物。
白樹因是利用資料中已提到的那些技術(shù)從多花白樹(Gelonium multiforum)的種子中精煉而來的。氨基酸順序是利用徑改進的愛德曼降解法確定的。
將白樹因樣品加到反向相反應(yīng)室中進行愛德曼降解。發(fā)現(xiàn)白樹因的N-末端是不均一的(該蛋白質(zhì)分子中50%明顯比其他的蛋白質(zhì)分子短一個氨基酸)。這種不均一性使得測序要大大超過40個循環(huán)，變得十分困難。因此，為了進一步確定該序列中的氨基酸，只得用酶促裂解法。
蛋白質(zhì)的內(nèi)部順序通常是通過酶裂解和化學(xué)法裂解的結(jié)合使用，將大的蛋白質(zhì)分子消化或者切割成較小的片段然后進行測試分析得到。當(dāng)將天然白樹因置于不同的質(zhì)溶性酶液中消化時，發(fā)現(xiàn)它不能被完全裂解。這部分是由于這種分子的N-末端存在一個二硫鍵。通過還原作用以及用碘乙酸進行烷基取代而使該鍵裂開將產(chǎn)生一個在酶促消化所需pH下比天然物質(zhì)更難溶解的片段。將天然白樹因用胰蛋白酶，賴氨酸氨肽酶(Lysc)，葡萄球菌蛋白酶(V8)以及胰凝乳蛋白酶共同消化，產(chǎn)生一些多數(shù)情況下來自該分子C-末端部分的肽鏈。這表明該分子的N-末端部分(從N-末端分析到殘基70的天冬氨酸-丙氨酸-脯氨酸位點)不能迅速地為酶所消化。
當(dāng)用溴化氰裂介時，白樹因變?yōu)?個大的肽段。將蛋白質(zhì)試樣(0.2mg/ml)溶于70%甲酸。在溶液中加入溴化氰結(jié)晶，反應(yīng)至少持續(xù)18小時。然后將該溶液用于稀釋并加到小型測序柱中。在加入樣品后，用1-10%的正丙醇與0.1%三氟乙酸(TFA)形成的梯度洗脫蛋白質(zhì)片段。洗脫圖見圖4。
總蛋白或溴化氰片段的酶促消化產(chǎn)生許多重疊肽段。用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(溶于0.1%SDS，100mM Tris，pH8.0)，金黃色葡萄球菌蛋白酶(溶于0.1%SDS)或者胰旦白酶(溶于0.1%吐溫20)進行酶促消化。白樹因在49位點含有一個半胱氨酸殘基，通過還原作用和羧甲基化作用產(chǎn)生一個在反向相HPLC上回收較好并且對酶催消化更敏感的蛋白質(zhì)。因此，大多數(shù)酶促消化都是在0.1%SDS或0.1%吐溫中進行。
在C-末端的160個殘基通過溴化氰消化和酶促裂介排定順序后，其余在40到70殘基之間的未知順序由利用磺乙酸進行半胱氨酸的化學(xué)修飾以及利用SDS對烷化蛋白的增溶作用來確定。然后將RCM烷化白樹因用過量賴氨酸氨肽酶在37℃下進行短時間裂解(1-5小時)。HPLC洗脫圖譜見圖5A。
利用這種方法產(chǎn)生了一個以前未見到的新的順序，其中有天冬酰胺-甘氨酸結(jié)合在一起。這種氨基酸結(jié)合可利用羥胺裂解的化學(xué)法使其分開。
羥胺裂解法的進行是先將100mg白樹因加入2M新鮮配制的羥胺中(含0.2M Tris，pH9.0，2MNacl，1mM EDTA，10%乙醇)，室溫下溫育7小時，再將整個反應(yīng)混合物加到一個測序柱中。然后用溶于水中的1%TFA(三氟乙酸)洗柱，并用乙腈梯度洗脫或直接進行混合物的測序。經(jīng)化學(xué)裂解后，產(chǎn)生一個含有200個氨基酸順序的大的疏水肽，這些氨基酸順序原來在殘基70與天冬氨酰-丙氨酰-脯氨酸相連。洗脫圖譜見圖5C。
剩下來自殘基40到50之間重疊順序的短肽部分的氨基酸順序通過在沒有烷化作用的情況下用賴氨酸氨肽酸Lysc(溶于SDS)消化白樹因來確定。這樣就消除了該物質(zhì)的大部分C-末端順序。然后再將這種混合物利用胰凝乳蛋白酶消化，并將消化產(chǎn)物用HPLC分離。大肽段的序列分析表明存在一個從該分子N-末端的5個氨基酸開始的Ser-Thr-Lys順序。這點可用于移去該分子的非均一部分和進行較長順序的測定。
白樹因蛋白包含258個氨基酸，其順序已經(jīng)在圖1上顯示。將白樹因的氨基酸順序與其它在順序資料庫中可查到的已知順序作了比較(Genbank PIR，EMVL)，希望了解白樹因是否與其他蛋白質(zhì)有任何方面的同源性。將白樹因的氨基酸順序與其他已知氨基酸順序的蛋白質(zhì)作的比較表明白樹因的氨基酸順序是獨特的。白樹因某些部分的順序與其他蛋白質(zhì)的相應(yīng)部分的同源性已被查明。例如，白樹因與來自栝樓的α-栝樓素有36.0%的同源性，與來自印度甘草(Indian Licquorice)的紅豆因A鏈有33.8%的同源性，與來自蓖麻的凝集素前體有35.2%的同源性，與來自蓖麻的蓖麻毒蛋白D的A鏈有33.7%的同源性，與來自紫茉莉的抗病毒蛋白(MAP)有27.3%的同源性。白樹因與這些蛋白質(zhì)以及其他蛋白質(zhì)的同源程度概括見圖3和4。
圖6A-6E所顯示的疏水性圖形表明了白樹因的疏水區(qū)與栝樓因，蓖麻毒蛋白以及其他抑制核糖體功能的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)的相似性。
白樹因結(jié)構(gòu)的疏水圖表明其疏水區(qū)位于殘基35-80和150-180。這些區(qū)域是該分子可能發(fā)生真正折疊的部位。類似的疏水圖形也可在其他毒素中觀察到(見圖6A-6E)，這可能意味著它們的酶促活性中心就包含在這些折疊區(qū)域里。因此，活性酶促位點可能不會在該分子的線性區(qū)域找到，它們的結(jié)構(gòu)可能需被充分折疊以得到合適的酶活中心。
重組體白樹因可利用白樹因的cDNA產(chǎn)生?？稍谠摲肿觾?nèi)部引進特異性的突變，以產(chǎn)生缺乏糖類基團的重組白樹因，因為糖類基團會將白樹因錯誤地引到抗體軛合物。重組白樹因分子可通過定位突變發(fā)生使其具備①比天然分子更大的毒性活性，②一旦通過某種載體如單克隆抗體或某種靶性配位體如IL-2，EGF，IFN等等而被結(jié)合到細胞表面即能更有效地進入胞液，③阻礙溶酶體降解因此使其更穩(wěn)定，能更長時間作為毒性部分起作用。
重組白樹因分子也可被設(shè)計成融合產(chǎn)物，具有殺死細胞的其他功能特征，例如酶促活性，TNF，IFN活性，次級毒理活性，如白喉毒素(這里所謂的次級活性是指通過白樹因以外的其他不同的生物學(xué)途徑)，由此產(chǎn)生一種“超級毒素Supertoxin”或一種具備多功能活性的毒素。
融合蛋白質(zhì)也可設(shè)計來與白樹因攜帶化學(xué)治療藥劑或用于放射療法的同位素。白樹因肽鏈可能用作墮胎劑，免疫抑制劑，抗癌藥以及抗病毒藥劑(如抗艾滋病毒藥劑)。
下面將舉例詳細說明白樹因的制備，特征以及氨基酸順序。所用到的實驗方法在下面的例子中將詳細敘述。當(dāng)然舉這些例子并不是想對該項發(fā)明給予任何方式的限制。
例1白樹因的純化和特性白樹因是基本上按照Stirpe等人描述的步驟從多花白樹(Gelo-niummultiforum)的種子中分離得到的(Stirpe，et al.，1980，J.Biol.Chem.2556947-6953)簡單地說，白樹因先在鹽緩沖溶液(pH7.4)中勻漿從種子中提取出來。將上清液在5mM磷酸鈉(pH6.5)中透析后濃縮，然后利用下面所說的離子交換色譜法將白樹因進一步純化。白樹因的純度用高壓液相色譜法(HPLC)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Page)鑒定。白樹因毒素遷移時為一條帶(分子量大約為29，000到30，000道爾頓)。
白樹因毒素的活性利用無細胞系統(tǒng)中的蛋白合成抑制實驗來測定(見例2)。
將多花白樹(Gelonium multiforum)的種子剝下，堅果在含8倍體積的0.14MNacl溶液(含5mM磷酸鈉，pH7.4)的均化器(勻漿器)中研磨。將勻漿在4℃下放置過夜，不停地攪拌，冰中冷卻。在0℃，35，000×g下離心20分鐘。移取上清液，將其在5mM磷酸鈉溶液(pH6.5)中透析，并用pm10濾器濃縮。將樣品放置在已用5mM磷酸鈉(pH6.5)溶液平衡的CM-52離子交換柱(20×1.5cm)上。將束縛在離子交換樹脂上的物質(zhì)用400ml 0-0.3M的線性NaCl梯度洗脫(4℃)，洗脫速度為每小時40毫升。收集5毫升洗脫成分。洗脫成分的收集是由分光光度計在280nm波長下監(jiān)視進行。白樹因在大約55-70洗脫部分中洗脫出來，是最后的主要洗脫峰。將這些洗脫部分集中起來，用0.1M NaCl的0.1M Na2HPO4緩沖液(pH7.4)進行透析。然后將樣品加到Cibacron藍色瓊脂糖凝膠柱(24×2cm，事先已用0.1M Na2HPO4/0.1MNaCl緩沖液平衡)，用3倍柱體積的緩沖液洗滌凝膠柱，并用400ml線性鹽梯度(0.1M-2MNaCl)洗脫。吸附物質(zhì)的洗脫用柱洗脫部分的Lowry測定監(jiān)測。將含有單一蛋白峰的洗脫部分集中起來，4℃下對PBS溶液透析過夜。從聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的銀染分析結(jié)果估計，經(jīng)純化的白樹因毒素的純度大于97%。其純度以及每份制備物的分子量可利用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中TSK3000凝膠滲透柱的高壓液相色譜分析和15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-page)檢測。白樹因以一條單一帶遷移(分子量大約為29，000-30，000道爾頓)。
例2白樹因活性的測定白樹因的活性是利用胞外蛋白質(zhì)合成抑制測定來檢測的。胞外蛋白質(zhì)合成抑制測定過程如下依次加入50μl家兔網(wǎng)織紅細胞溶胞液(融解后立即使用)，每次加液后與下列成分混合起來0.5ml 0.2M的Tris-HCl(pH7.8)，8.9ml 1，2-亞甲基二醇，0.25ml 1MHCl。
20微升的鹽-氨基酸-能量分子混合物(SAEM)由下列成分組成0.375MKCl，10mMMg(CH3CO2)2，15mM葡萄糖，0.25-10mM氨基酸(亮氨酸除外)，5mM ATP，1mM GTP，50mM Tris-HCl(pH7.6)，10μl肌酸酐磷酸酯-肌酸酐磷酸激酶，8μl〔14C〕亮氨酸(Amersham，348mCi mmol)，并加入1.5μl含有不同濃度白樹因混合物的溶液。將它們混勻后在30℃保溫60分鐘。在該混合反應(yīng)液的某一等分中14C-亮氨酸的摻入通過下列過程檢測將合成的蛋白質(zhì)沉淀在玻璃纖維濾器上，用10%的三氯乙酸(TCA)和丙酮洗滌，然后利用Aquasol閃爍液體在β-計數(shù)器中測定放射性。利用這種測定方法測得經(jīng)純化的白樹因的比活性為4×109v/mg蛋白(即每毫克蛋白的活性為4×109個單位)。一單位白樹因活性定義為在胞外反應(yīng)液中引起〔14C〕亮氨酸摻入到蛋白質(zhì)中的抑制50%所用的白樹因蛋白量。
例3白樹因氨基酸順序的測定白樹因的氨基酸順序是利用自動氨基酸測序儀(歐洲專利申請No.EP-257735)通過愛德曼降解法測定的。將大的肽段和完整蛋白加到測序反應(yīng)室的逆相部分。用過量水洗去不需要的緩沖成分，然后用愛德曼化學(xué)降解法測定蛋白質(zhì)或肽樣品的氨基酸順序，在65℃下，利用25%TFA的水溶液可將提取的ATZ氨基酸衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)镻TH形式。PTH型樣品可在Np1090柱上通過反相分析分離鑒定。
為了得到進一步的氨基酸順序，將該蛋白用不同的解蛋白劑和化學(xué)試劑消化后，用高性能液體色譜純化。發(fā)現(xiàn)白樹因?qū)σ鹊鞍酌负鸵阴Ｒ鹊鞍酌傅南挚沽軓?前者裂解精氨酸和賴氨酸殘基以后的順序，而后者僅裂解賴氨酸殘基后的順序)。還發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)對濃度高達5%(w/w)的這類酶液也有抵抗力。白樹因這種對解蛋白酶-胰蛋白酶的抗性作用并不是由于它的分子結(jié)構(gòu)中缺乏胰蛋白酶裂解位點，因為白樹因分子中有21個賴氨酸和12個精氨酸殘基。這些結(jié)果表明白樹因可能是一個包裝很嚴(yán)實的分子，使得它不易受解蛋白酶類的作用。
既然發(fā)現(xiàn)白樹因?qū)獾鞍酌割惖牧呀庥锌剐宰饔?，于是試驗了該種蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解。
例4白樹因的溴化氰(CNBr)裂解將例1中制備的白樹因溶于70%甲酸，在其中加入溴化氰晶體。在反應(yīng)至少18小時以后，將該溶液或加到一個小柱(.15cm×5cm)的反相中(J.T.1Baker;15cmC-B吸附相Cat Ⅱ 7191-02)，或加到分析用逆相柱(4.6×100mm)中。用1%三氟乙酸(TFA)水溶液的1-70%正丙醇梯度洗脫可產(chǎn)生圖6所示的5個峰。將每個峰進行測序并用于進一步酶消化以拼接在一起形成完整順序。將峰1直接測序得到一個從苯丙氨酸(Phe，用F表示)，延續(xù)38個氨基酸殘基后以谷氨酸(Glu或用E表示)為結(jié)尾的序列。這種順序已由大規(guī)模分光鏡和用賴氨酰氨肽酶(Lysc)消化該分離到的肽測得的結(jié)果證實。峰2直接測序的結(jié)果表明它是一個起始氨基酸為纈氨酸(Val，V)，延續(xù)47cy并在cy47的丙氨酸(Ala)之后仍不間斷的順序。峰3測序的結(jié)果與峰2順序相同。峰2和3的SDS凝膠電泳結(jié)果以及Lysc消化結(jié)果均表明峰3也含有C-末端的CNBr肽段。隨后白樹因的胰蛋白酶消化產(chǎn)生一個將這兩個CNBr肽段序列連接起來的肽段。這種胰蛋白酶肽段在測序時給出TSGANGMFSEAVELER順序。峰4和峰5均給出N-末端為GLDT…的順序，這被用來進行Lysc，V8的部分酶解以得到的它的C-末端肽段。
例5經(jīng)CNBr裂解的白樹因的酶促消化將完整白樹因蛋白質(zhì)或徑CNBr裂解的片段用下列酶消化賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(Wako Chemical Dallas，TX)溶于0.1%SDS，100mM Tris(pH8.0);或金黃葡萄球菌蛋白酶(Pierce)(溶于0.1%SDS);或者胰蛋白酶(Sigma)，溶于0.1%吐溫20。消化混合物用HPLC分離，并將收集的肽段在原型順序上利用氣相愛德曼測序法進行測序。
例6白樹因的氨基酸順序在對例3中得到的CNBr片段進行分析后，得到一個含258個氨基酸殘基的完整順序。圖1表明了白樹因的氨基酸順序。白樹因總共含有大約258個氨基酸殘基。它的DNA順序可從該氨基酸順序中推導(dǎo)出來。圖2顯示簡并的DNA順序。
現(xiàn)在本發(fā)明已全部敘述完畢，對掌握現(xiàn)有技術(shù)中的普通技術(shù)的人員來說，顯然可對此作很多變化或改進而不背離下面陳述的本發(fā)明的精神或范圍。
權(quán)利要求
1.純的白樹因毒素，所述毒素和片段及其衍生物，其特征在于，具有如下氨基酸順序。Gly Leu Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr Ile Thr1 5 10 15Tyr Val Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly20 25 30Asn Ser His Gly Ile Pro Leu Leu Ser Lys Gly Asp Asp Pro Gly Lys35 40 45Cys Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gln Leu Ala Glu50 55 60Ile Ala Ile Asp Val Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Val Arg65 70 75 80Asn Arg Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Tyr Glu Gly85 90 95Leu Phe Lys Asn Thr Ile Lys Asn Pro Leu Leu Phe Gly Gly Lys Thr100 105 110Arg Leu His Phe Gly Gly Ser Tyr Pro Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala115 120 125Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu Gly Ile Glu Pro Leu Arg Ile Gly Ile130 135 140Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala Ile Asp Asn Tyr Lys Pro Thr Glu Ile145 150 155 160Ala Ser Ser Leu Leu Val Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg165 170 175Phe Thr Phe Ile Glu Asn Gln Ile Arg Asn Asn Phe Gln Gln Arg Ile180 185 190Arg Pro Ala Asn Asn Thr Ile Ser Leu Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu195 200 205Ser Phe Gln Ile Arg Thr Ser Gly Ala Asn Gly Met Phe Ser Glu Ala210 215 220Val Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Val Thr Ala Val225 230 235 240Asp Gln Val Lys Pro Lys Ile Ala Leu Leu Lys Phe Val Asp Lys Asp245 250 255Pro Glu所述片段及衍生物編碼白樹因或編碼某種具有抑制細胞蛋白質(zhì)合成但不粘附到細胞表面受體上的活性的多肽。
2.DNA順序和片段及其衍生物，其特征在于，具有如下分子式
所述片段和衍生物編碼白樹因或編碼具有抑制細胞蛋白質(zhì)合成但不粘附到細胞表面受體上的活性的多肽。
全文摘要
編碼白樹因或編碼某種具有抑制細胞蛋白質(zhì)合成但不粘附在細胞表面受體上的活性的多肽的cDNA結(jié)構(gòu)，以及白樹因的氨基酸順序。
文檔編號A61K38/00GK1058990SQ9110580
公開日1992年2月26日 申請日期1991年8月14日 優(yōu)先權(quán)日1990年8月14日
發(fā)明者邁克爾·羅森布拉姆, 巴拉特·阿加華, 威廉·J·科爾 申請人:研究發(fā)展基金會