專利名稱：改進的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有改進的免疫原性的疫苗組合物。更具體地說，本發(fā)明的組合物包括與一蛋白質(zhì)載體共價連接的細(xì)菌多糖和一長鏈烷基化合物相結(jié)合。該載體和烷基化合物的功能是佐劑。
皆知，疫苗在疾病的預(yù)防上是很重要的。疫苗的作用是使宿主動物暴露于為活化免疫系統(tǒng)所設(shè)計的外來物質(zhì)，以賦于宿主對該物質(zhì)的免疫力而不致使宿主有罹病的危險?，F(xiàn)今大約有20種疫苗已開發(fā)成商品。大多數(shù)這些疫苗是通過對引起機體或機體一部分致病的減毒作用，或通過對機體的特異性無毒部分的分離作用而制成的。后者的一個熟知實例是把腦膜炎和肺炎球菌的莢膜多糖分離出，作為細(xì)菌性腦膜炎和肺炎疫苗的基礎(chǔ)。然而多糖疫苗是較差的免疫原，它對發(fā)育不好或受損傷的免疫系統(tǒng)的個體產(chǎn)生不了適當(dāng)量的保護性抗體。免疫系統(tǒng)不完備的人群包括兒童，成人或有自體免疫疾病的人。而且，免疫應(yīng)答的出現(xiàn)是不依賴于T細(xì)胞或是非記憶性的，這意味著個體接受了增強劑量的注射后，隨著血清轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，不能呈現(xiàn)增強的免疫應(yīng)答。T細(xì)胞的依賴性對于免疫球蛋白抗體和記憶細(xì)胞的誘導(dǎo)是必要的。由于血清轉(zhuǎn)化，在反覆注射疫苗時，IgM和IgG抗體都會生成。而且當(dāng)應(yīng)答是T細(xì)胞依賴性時，抗體應(yīng)答的幅度隨著疫苗注射的次數(shù)而增加。多糖疫苗的免疫學(xué)由Jennings等在“多糖”(編者G.O.Aspinall)卷1，291-329(1982)作了綜述。
多糖結(jié)合于或共價鍵合于適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)載體上，會由于發(fā)生了依賴于T細(xì)胞或記憶應(yīng)答，而改善了免疫功能。在1987年12月美國批準(zhǔn)了第一個人用的結(jié)合疫苗。它是由流感嗜血菌b的莢膜多糖共價結(jié)合于白喉類毒素的載體蛋白所構(gòu)成。批準(zhǔn)用于18個月的兒童，因為發(fā)售的多糖疫苗對此年齡段效果差。最近美國又批準(zhǔn)另一個流感嗜血菌b的結(jié)合疫苗，是用不同的結(jié)合化學(xué)方法制成的。
多糖和多糖-蛋白結(jié)合物是比較純凈的疫苗，因而與經(jīng)典的全菌或病毒疫苗相比，比較安全。雖然整體細(xì)菌或病毒經(jīng)化學(xué)劑、加熱或遺傳減毒處理已被生化減毒，但常常仍混雜有毒的副產(chǎn)物。然而，由于多糖和多糖-蛋白結(jié)合物的純度增加，這常常意味著除去了天然的免疫刺激劑，因而這些新疫苗常常不是最理想的免疫原。天然的免疫刺激劑包括有細(xì)菌成分，例如脂質(zhì)多糖，脂蛋白和胞壁酰二肽;這些都有毒性。此外，蛋白載體也可有某種程度的毒性，因此盡可能使用最小的量。例如白喉類毒素及相關(guān)的分子CRM197，通常用作人用結(jié)合性疫苗的載體分子。然而成人對這些載體分子會出現(xiàn)局部或全身性過敏。為了抵銷這些作用，將佐劑與疫苗結(jié)合以增強抗體的形成，佐劑也可能對應(yīng)答疫苗所產(chǎn)生的抗體的類型發(fā)生影響。例如，在用多糖-蛋白結(jié)合性疫苗進行免疫時，雖然會發(fā)生血清轉(zhuǎn)化并隨后產(chǎn)生了IgG抗體，但在小鼠的初步免疫應(yīng)答是IgG1。增加IgG2a抗體的產(chǎn)生會是有益的，因為后者對于補體的活化作用而言，是最有效的小鼠抗體。補體路徑對許多細(xì)菌感染提供了一個重要的防御機制。
至于商用的佐劑，現(xiàn)今只用鋁鹽和鈣鹽。但鋁和鈣鹽不是強力的佐劑。鈣鹽只有有限的應(yīng)用，而鋁鹽對于其它疫苗有較廣泛的應(yīng)用，但對于多糖-蛋白結(jié)合型疫苗則幾乎沒有成功的報導(dǎo)。事實上，已報導(dǎo)氫氧化鋁可抑制對流感嗜血菌b多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合型疫苗的抗體應(yīng)答;J.B.Robbins等，J.Pediatrics，112，695-702(1988)。J.B.Robbins等還觀察到氫氧化鋁對傷寒沙門氏菌多糖-霍亂毒素結(jié)合型疫苗的抗體應(yīng)答有同樣的抑制作用;J.Experimental Medicine，166，1510-1524(1987)。而且鋁鹽還會在注射部位引起暫時性的或慢性的局部肉芽腫;L.H.Collier在Lancet，1354-1367(1987)談到，對破傷風(fēng)類毒素疫苗反應(yīng)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度取決于鋁鹽佐劑的是否存在。鋁佐劑的制備并非總是可重復(fù)的。而且鋁可以單獨刺激IgE抗體的產(chǎn)生，后者與調(diào)控直接過敏反應(yīng)有關(guān)。這已被T.Matuhasi等在J.Infectious Disease，146，192(1982)中作了敘述。
近年來用有機化合物作為佐劑已為人們注意。只有為數(shù)不多的有機化合物其佐劑的功能與市售的鋁鹽的作用相似;即隨著緩慢釋放媒介物或抗原(疫苗)庫，從而抗原的釋放在注射部位有一個比較長的時間。
這類有機化合物的實例是有機表面活性劑和乳化劑，例如普盧蘭尼克和特窗尼克，它們是非離子型的聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，BASF公司出品。這樣一種輔佐劑的慢釋放機理早已作為人用，因為它會減低過度刺激免疫系統(tǒng)的可能性。對免疫系統(tǒng)的過度刺激會導(dǎo)致自體免疫反應(yīng)，如在用強力的免疫刺激劑例如弗洛因德佐劑時所發(fā)生的那樣。因而該慢釋放機理是優(yōu)選的機理。
由于大多數(shù)有機佐劑表明是強力的免疫刺激劑，這樣高活性的佐劑會引起毒性，因而不能人用。作為強力免疫刺激劑的已知的有機佐劑是弗洛因德完全佐劑和胞壁酰二肽。這兩個化合物都只限用于動物試驗，系因毒性的考慮。許多模擬鋁鹽的有機佐劑比鋁鹽的毒性更大。例如D.Gall在Lmmunology，11，369-386(1966)中敘述的長鏈烷基胺，報導(dǎo)是毒性化合物，一般對細(xì)胞模結(jié)構(gòu)有破壞作用。
酪氨酸的十八烷醇酯已知是個佐劑。它有最低限度的免疫刺激性，但其功能是相當(dāng)于鋁佐劑的有機佐劑-慢釋放的媒介物。即抗原會與酪氨酸十八烷醇酯發(fā)生復(fù)合，隨著時間會從不溶解的佐劑上緩慢地釋放或解吸附?？乖c佐劑之間的復(fù)合作用是通過各種弱的非共價鍵力發(fā)生的，例如疏水相互作用和氫鍵。
這個現(xiàn)象見于Ouerell的美國專利4428932和Moloney等的美國專利4258029。Overell揭示了酪氨酸十八烷醇酯與過敏原如大麥、草和花粉提取液復(fù)合后，它的功能是作為脫過敏治療的佐劑。Moloney等也指出，酪氨酸十八烷醇酯與破傷風(fēng)類毒素和用福爾馬林滅活的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰質(zhì)炎病毒形成復(fù)合后，其作用是疫苗的佐劑。這個現(xiàn)象又為A.Nixon-George等在J.Immunol-ogy，144，4798-4802(1990)中闡述，他們揭示酪氨酸十八烷醇酯和其它芳香族氨基酸的十八烷醇酯在與重組的肝炎B表面抗原復(fù)合后，它們的功能是肝炎B的候選疫苗的佐劑。
因此，需要發(fā)展無毒的細(xì)菌多糖蛋白結(jié)合型疫苗-佐劑組合物，這種組合物具有改良的免疫原性。
本發(fā)明重點是改良的疫苗組合物，其特征是，含無毒的細(xì)菌多糖-蛋白結(jié)合型疫苗和無毒的長鏈烷基佐劑。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，它提供了一種疫苗組合物，是由一個無毒的細(xì)菌多糖蛋白結(jié)合物和一個無毒的長鏈烷基化合物的佐劑所組成，該長鏈烷基化合物的有效含量可將多糖-蛋白結(jié)合物的免疫原性放大。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種能引起包括人在內(nèi)的溫血動物的免疫應(yīng)答的方法，其特征是給宿主動物以有效量的本發(fā)明的疫苗組合物。
本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，無毒的長鏈烷基化合物，特別是氨基酸或肽的酯類，可復(fù)合于多糖-蛋白結(jié)合型疫苗。由于這個復(fù)合作用，該長鏈烷基化合物的功能是緩慢釋放的載體。即該長鏈烷基化合物在一較長的時間內(nèi)將結(jié)合型疫苗釋放到宿主動物體中。這與單用結(jié)合型疫苗相比，產(chǎn)生了增強的抗體應(yīng)答。如前所述，輔佐性的這種機理與用鋁鹽和非結(jié)合型疫苗所觀察到的機理是一樣的。但也如前所述，鋁鹽對于細(xì)菌多糖-蛋白結(jié)合型疫苗而言，大部分都是無效的佐劑。因此不會預(yù)期本發(fā)明的長鏈烷基化合物借助同樣的輔佐性機理，其作用是結(jié)合型疫苗的佐劑。甚至更令人驚奇的是無毒的長鏈烷基化合物的作用是改善該結(jié)合型疫苗的免疫原性。
本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)作為佐劑的無毒性長鏈烷基化合物，特別是氨基酸或肽的長鏈烷基酯的存在，會影響對結(jié)合型疫苗應(yīng)答時產(chǎn)生的抗體的同型。特異的是IgG2a抗體對IgG1抗體的比例較高是在于這兩個抗體的同型水平會由于使用了本發(fā)明的長鏈烷基佐劑和結(jié)合型疫苗而增加，這與沒有佐劑存在時所觀察到的比值正相反。這種比值的增加是有益的作用，因為IgG2a抗體作為最有效的小鼠抗體是很重要的。該IgG2a對于補體和依賴于抗體的細(xì)胞毒機理的活化作用和保護機體免受腫瘤和病原體侵害都是重要的。
長鏈烷基化合物的佐劑效果，就增加和調(diào)節(jié)(即同型變化)抗體的應(yīng)答而言，也是令人驚奇的，這是從載體蛋白的作用意義上講的。即在結(jié)合型疫苗中的載體功能是增加和調(diào)節(jié)抗體的應(yīng)答。
因此，長鏈烷基化合物與鋁佐劑不同，它增強了載體的功能。
無毒的長鏈烷基化合物最好是有正電荷的氨基酸或肽的酯，尤其是氨基酸，二肽或三肽與含14～20碳原子的烷醇形成的酯。
用于本發(fā)明組合物中的細(xì)菌多糖蛋白結(jié)合物能夠誘發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。正如在這里所使用的那樣，“細(xì)菌”一詞包括莢膜多糖，脂質(zhì)多糖和其它莢膜下的(表面)多糖。特別是致病菌的莢膜多糖對制備有效的結(jié)合型疫苗，是現(xiàn)今最有用的。這類莢膜多糖的實例包括從流感嗜血菌，腦膜炎奈氏球菌，肺炎鏈球菌，無乳鏈球菌，傷寒沙門氏菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分離得到的脂質(zhì)多糖提取自腦膜炎奈氏球菌，大腸桿菌，傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌。其它莢膜下多糖是鏈球菌A、B和C族的普通多糖抗原(C-物質(zhì))和肺炎鏈球菌的普通多糖抗原(C-物質(zhì))。
后面的實例敘述了用結(jié)合物做的實驗，結(jié)合物包括有化學(xué)結(jié)構(gòu)顯著不同的多糖，即腦膜炎球菌A族多糖(N-乙酰甘露糖胺6-磷酸酯的均聚物)，腦膜炎球菌B族((2→8)聯(lián)結(jié)的N-丁酰神經(jīng)氨酸的均聚物)和腦膜炎球菌C族((2→9)聯(lián)結(jié)的N-乙酰神經(jīng)氨酸的均聚物)，應(yīng)理解到本發(fā)明并不止限于實施例中的腦膜炎球菌結(jié)合物，也適用于含有其它細(xì)菌多糖的結(jié)合物，如同上面限定和舉例說明的那樣。
本發(fā)明的結(jié)合物中所用的細(xì)菌多糖很容易用常規(guī)的分離技術(shù)制備。
與細(xì)菌多糖結(jié)合或共價聯(lián)結(jié)的載體分子是蛋白質(zhì)。動物用的優(yōu)選的載體是牛血清白蛋白和鑰孔
血藍(lán)素。適于人用的蛋白載體包括有破傷風(fēng)類毒素，白喉類毒素，無細(xì)胞百日咳疫苗(LPF類毒素)，交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRM′s)，它們的抗原性類似于細(xì)菌毒素，但借助突變作用變?yōu)闊o毒性，最好的是根據(jù)Pappenheimer等于Immunochemistry，9，891-906(1972)中所述制得的CRM197，人用蛋白載體還有其它細(xì)菌蛋白載體，例如腦膜炎球菌外膜蛋白。載體蛋白最好本身就是免疫原。
多糖可借助已知的方便方法與載體共價偶聯(lián)。雖然使用對稱的聯(lián)結(jié)劑例如己二酸二酰肼，如J.B.Robbins等在J.Experimental Medicine，152，361-376，(1980)中所述，或用異二功能的聯(lián)結(jié)劑，如N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫丙酸酯，如J.B.Robbins等在Infection and Immunity，56，2292-2298(1988)中所述，都是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，但最好是避免使用任何種聯(lián)結(jié)劑，而代之以還原胺化作用直接把多糖偶聯(lián)在蛋白載體上，如同H.J.Jennings等在J.Immunology，127，1011-1019(1981)中所述。
細(xì)菌多糖的大小用平均分子量表示，其大小是可以變動的，并取決于獲取的細(xì)菌和多糖與載體的偶聯(lián)方法。因而它可以小到1000道爾頓(103)或高于106。用還原胺化的偶聯(lián)方法得到的多糖分子量通常在5000-500000的范圍內(nèi)，例如300000到500000或例如5000-50000道爾頓。
長鏈烷基佐劑及其在宿主的代謝作用中產(chǎn)生的所有化合物應(yīng)當(dāng)是無毒的。皆知，長鏈脂肪醇是天然存在的無毒物質(zhì)。作為一個實例，十八烷醇對人是完全無毒的，如同口服LD50所提示的，LD50大于15g/Kg，見Gosselin的“商用產(chǎn)品的臨床毒理學(xué)”，第4版，1976。酪氨酸十八烷醇酯對動物是無毒的，并且大多數(shù)天然存在的氨基酸是無毒的;C.L.Penney等，Vaccine，4，99-104(1986)，因而可以預(yù)料酪氨酸十八烷醇酯和其它氨基酸和其它醇的酯對人都無毒性。
佐劑在水性介質(zhì)中應(yīng)能形成大小為大約150μm-1mm(18目-100目，最好是大約250μm，或60目)的微粒，因而生成均勻稠度的懸浮液。而且，佐劑微粒應(yīng)可以吸附結(jié)合型疫苗，從而得以緩慢地向宿主中釋放結(jié)合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選的具體實例中，佐劑是下式的化合物
式中C是氫原子，氨基酸殘基或氨基酸數(shù)目多達(dá)10個的多肽殘基(即十肽);D是氫原子或藥用酸，例如鹽酸，溴氫酸，磷酸，硫酸，酒石酸，乳酸或乙酸。E是4-羥芐基，芐基，4-羥苯基，苯基，4-氨基丁基，異丙基，甲基，氫或天然存在的其它氨基酸殘基;A是(CH2)n，氧或CH2O，B是(CH2)n或氧，其中n為0～4，但若是(CH2)n或氧時A≠B;R是一個含12～20個碳原子的烷基。
較好的佐劑是C或者可為氫、氨基酸、二肽或三肽。若C是一氨基酸，則該佐劑的氨基酸次序可從下述中選擇，例如酪氨酰甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，甘氨酰酪氨酸和苯丙氨酰甘氨酸。
若C為一個二肽，則該佐劑的氨基酸次序可從下述中選擇，例如酪氨酰甘氨酰甘氨酸或酪氨酰丙氨酰甘氨酸。若氨基酸殘基是手性的，可用D-光學(xué)異構(gòu)體，或L-光學(xué)異構(gòu)體，或其混合物。特別優(yōu)選的是佐劑含有α-氨基酸。
E特別優(yōu)選自4-羥基芐基，芐基，4-羥基苯基，苯基和氫。E最好的是4-羥基芐基。
當(dāng)A是CH2O，B是(CH2)n時，化合物為N-氨基?；掖及?O-硬脂酸酯。當(dāng)A是CH2O，B是氧時，化合物為碳酸酯。
更為優(yōu)選的是，該佐劑是氨基酸酯的鹽酸鹽，其中C是氫，D是鹽酸，A是(CH2)n(n為0～4)，B是氧。
最優(yōu)選的是，該佐劑為酪氨酰十八碳醇酯鹽酸鹽，其中C是氫，D是鹽酸，E是4-羥基芐基，R是十八碳烷基，A是(CH2)n，n為零，B是氧。
當(dāng)C不是氫時，佐劑的骨架通常主要是肽鍵構(gòu)成，即一個氨基酸殘基的羧基直接聯(lián)結(jié)于相鄰殘基的氨基上，頭-尾相聯(lián)。肽鏈還可以是硫代酰胺。
佐劑可用任何方便的方法制取。例如佐劑的氨基酯部分可用許多種已確定的方法之一合成，如同M.Bodansky等在“肽合成”第二版，Wiley，紐約，1976和R.W.Roeske，Peptides(N.Y.)3，102(1981)中所述。特別優(yōu)選的方法是用甲烷磺酸催化的酯化法，C.Penney等敘述于J.Organic Chemistry，50，1457-1459(1985)。
當(dāng)佐劑是二肽或三肽時，肽鍵的生成可用上述的“肽合成”一書中所述的任何種方法實現(xiàn)。此外，肽鍵的生成可按固相或液相法實行。有許多種方案和試劑可用來生成酰胺、硫代酰胺或硫酯鍵。
在制備佐劑時，希望要暫時保護有反應(yīng)活性的功能基。例如，胺類可用氨基甲酸酯型基團保護，醇類用叔丁基或芐基保護，酸用酯基保護。在上述的“肽合成”一書中敘述了適宜的保護-去保護條件和方案。
佐劑可用前述的任何種技術(shù)進行精制。優(yōu)選的方法是硅膠層析，特別是快速層析方法，如W.Clark Still等在J.Organic Chemistry，43，2923-2925(1978)中所述。然而，其它包括有HPLC的層析方法也可用于純化佐劑。結(jié)晶法也可用于純化佐劑。在某些情況下，由于合成中直接得到了分析純的產(chǎn)物而無需精制。
本發(fā)明的疫苗組合物可按已知的方法，在適宜的滅菌條件下將佐劑與多糖-載體蛋白結(jié)合物經(jīng)物理混合來制備，生成輔佐化的組合物，多糖-載體蛋白結(jié)合物與佐劑的復(fù)合化是由于在結(jié)合物中存在凈負(fù)電荷而加速，該負(fù)電荷與佐劑的長鏈烷基化合物上的正電荷發(fā)生靜電吸引作用。
為誘發(fā)人的免疫應(yīng)答所需的佐劑量和多糖-載體蛋白結(jié)合物的量是相互關(guān)聯(lián)的，但常規(guī)疫苗通常所用的量有一定范圍。例如，增加了佐劑的用量可建議減少結(jié)合物的用量，反之亦然。佐劑在組合物中的優(yōu)選量為0.01～5mg/ml，例如為0.05mg/ml～3mg/ml，最好是0.5～1.0mg/ml。結(jié)合物的優(yōu)選量大約在1～100微克/ml之間，最好是大約5～40微克/ml。劑量取決于接受疫苗的宿主的狀況，諸如個體大小，重量和年齡等因素。
本發(fā)明的疫苗組合物可用類似于其它藥用多肽組合物的方法制成制劑。因而，佐劑和結(jié)合物可以冷凍干燥的形式貯存，在使用前加入生理可接受的輔料生成懸浮液。佐劑和結(jié)合物也可存貯于輔劑之中。優(yōu)選的輔劑為滅菌溶液，特別是滅菌緩沖溶液，例如磷酸緩沖生理鹽水。與單個組分相比，只要組合物的免疫效果得到改善，任何種合并佐劑和結(jié)合物于輔劑中的方法都是適宜的。
輔劑中可含有防腐劑或其它已知的添加劑，以用于改善貯存的穩(wěn)定性或混合物的效力。適宜的防腐劑包括例如乙基汞硫代水楊酸鈉。
本發(fā)明疫苗的單個劑型的體積可以有所變化，但一般是在常規(guī)疫苗所用體積的范圍內(nèi)。單個劑型的體積優(yōu)選為大約0.1ml到1.5ml之間，較好的是大約0.2ml到0.5ml之間，結(jié)合物和佐劑的濃度如前所述。
本發(fā)明疫苗組合物可用任何種方便的方式用藥，優(yōu)選的用藥方法包括有皮下、肌肉、皮內(nèi)注射或鼻腔給藥，還可以用生物可擴散的植入劑釋放該混合物，可以一次用藥，也可以在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)多次用藥。
以下實例說明本發(fā)明內(nèi)容，但并不只限于此。
實施例1下面敘述腦膜炎球菌A族和C族多糖的分離，制備和結(jié)合。
多糖獲自于腦膜炎奈氏球菌A族604A株和C族2241C株的培養(yǎng)提取液。這些菌株獲自安大略，渥太華疾病控制實驗室中心的培養(yǎng)菌庫，用Kenny等在Bull.W.H.O.37，569(1937)中所述的化學(xué)培養(yǎng)基中生長。發(fā)酵桶中生長15小時后，加入福爾馬林使終濃度為0.75%以殺死細(xì)菌。連續(xù)離心法除去細(xì)菌，上清液分離多糖，基本按Bundle等在J.Biol.Chem.249，4797-4801(1974)中所述方法精制，只是將粗多糖溶液與熱的(50°～60℃)90%酚攪拌來提取蛋白質(zhì)，而不是用冷的(4℃)酚，這種改進保證了生產(chǎn)和分離高分子量的多糖。
A族多糖的解聚天然的腦膜炎球菌A族多糖(平均分子量30000;150mg)溶于20ml乙酸鈉緩沖液(100mM;pH5.0)于70℃加熱。解聚作用用FPLC(Pharmacia)控制于Superose12凝膠壓擠柱，直到獲得所需的分子量(M.W.12000)。該物質(zhì)于4℃用蒸溜水透析，凍干，得到13.5mg無定形固體。
解聚的A族多糖的還原解聚的A族多糖100mg溶解于3ml tris(HCI)緩沖液(200mM;pH7.2)冷卻到0℃。在3小時內(nèi)將5×2.5mg等分的硼氫化鈉加到攪拌的溶液中。加入100mM乙酸使溶液的pH保持在7.5～7.8，再加入1M乙酸使溶液的pH降至5.5以將所有殘存的硼氫化物破壞掉，然后加入100mM氫氧化鈉使pH升至7.5。該溶液于Bio-Gel P6DG(Bio-Rad)柱(1.6×100Cm)上脫鹽，水洗脫、收集空隙容積峰，凍干，得11.7mg還原產(chǎn)物。
GAMP的活化和分級解聚并還原后的A族多糖110mg溶解于50mM，2ml高碘酸鈉溶液中，室溫下于暗處保持1小時。然后加入50μl乙二醇，溶液室溫放置1小時，用Bio-Gel P6DG(1.6×100Cm)(Bio-Rad)柱將溶液脫鹽，用水洗脫，收集空隙容積峰，凍干，得108mg氧化產(chǎn)物。產(chǎn)物在Bio-Gel A0.5柱上分級(1.6×100Cm，200-400目，于PBS Bio-Rad上)。收集柱上洗脫的KD0.5～KD0.6(平均分子量10000-15000)組分，該組分是用FPLC(Pharmacia)在Superose 12(HR 10/30;Pharmacia)柱上測定的，收集的組分透析后凍干。
C族多糖的氧化和解聚天然的腦膜炎球菌C族多糖200mg溶于20ml水，再加入2ml 100mM高碘酸鈉溶液(200μM)。如A族多糖中所述的用FPLC分析法監(jiān)測解聚反應(yīng)，當(dāng)?shù)玫剿Ｍ钠骄肿恿糠秶鷷r，加入100ml乙二醇以終止反應(yīng)，溶液室溫放置1小時，透析后凍干。
GCMP氧化組分的分級氧化GCMP用凝膠過濾法Bio-Gel A0.5柱于PBS(1.6×100Cm;200～400目)(Bio-Rad)中分級。柱上洗脫的KD0.5～KD0.6(平均分子量10000～15000)組分經(jīng)FPLC測定(如上述)加以收集，透析后凍干，這樣收集的GCMP組分的兩個端基都是醛基。
多糖結(jié)合物
A族或C族多糖的氧化組分90mg溶解于100mMNaHCO3(pH8.1)緩沖液2ml中，將破傷風(fēng)類毒素單體30mg加到此溶液中。加入60mg氰代硼氫化鈉(Aldrich，Milwaukee，WI)后，溶液于37℃保溫4天，然后將該反應(yīng)混合物直接用于Bio-Gel A(0.5)(200～400目;1.6×100Cm)(Bio-Rad)柱于PBS中洗脫，含有該組合物的組分對蒸餾水透析，凍干。該結(jié)合物含多糖和破傷風(fēng)類毒素的摩爾比分別為2-3∶1。
實施例2下面敘述N-丙?；蚇-丁?；鵅族腦膜炎球菌多糖的制備和結(jié)合。
丙酸酐、丁酸酐和多聚乙酰神經(jīng)氨酸獲自Sigma化學(xué)公司，圣路易城，MO.因為多聚乙酰神經(jīng)氨酸在結(jié)構(gòu)上與B族腦膜炎球菌多糖(GBMP)相同，以下也稱它為GBMP。破傷風(fēng)類毒素獲自Armand-Frappier研究所，Laval，魁北克，所有用于結(jié)合作用的破傷風(fēng)類毒素單體，是將上述制劑流經(jīng)Bio-Gel(商標(biāo)名)A0.5(200-400目)柱(1.6×90Cm)(Bio-Rad，Richmond，CA)，用0.01M磷酸緩沖的生理鹽水(PBS)(pH7.4)平衡和洗脫。
GBMP的N-脫乙?；?.0g GBMP鈉鹽溶于5ml 2M NaOH中，加入150mgNaBH4后，溶液于110℃加熱6小時(于60ml容積的有聚四氟乙烯螺蓋的容器中)。該法基本是按J.Immunol，134，2651(1985)和US專利4727136中所述進行，兩文的作者都是Harold J.Jennings等。冷卻后的稀釋溶液于4℃下對蒸餾水作徹底的透析，凍干。得到了N-脫乙?；疓BMP這一事實是由其1H-NMR譜中無甲基乙酰胺基信號(單峰，δ2.07)而確定的。
GBMP的N-酰化N-脫乙?；腉BMP1.0g溶于50ml5%NaHCO3水溶液中。等分成兩份，每份(10ml)，各加入丙酸酐或丁酸酐。這些試劑是在室溫下于3小時內(nèi)分3×0.5ml等分加入，并加0.5N NaOH使溶液一直維持在pH8.0。每加入一份酸酐，同時加入0.5ml甲醇以增加它們的溶解度。溶液最后于4℃攪拌16小時，在40℃下對蒸餾水作徹底透析，凍干。各N-丙?；?和N-丁?；腉BMP的收率超過90%，兩種情況下基本上完全N-酰化了，其證明是N-脫乙?；鵊BMP的1H-NMR譜的消失。
N-?；腉AMP的活化用高碘酸氧化法將末端醛基引入到N-?；腉BMP中，上述得到的N-酰化GBMP于室溫暗處用10ml0.1M偏高碘酸鈉水溶液氧化2小時，加入1ml乙二醇以破壞過量的高碘酸鹽，然后于4℃將溶液作徹底透析，凍干。N-脫乙?；姆椒?除不用GBMP外)用硼氫化鈉還原，將各N-酰化的GBMP的末端還原的唾液酸殘基轉(zhuǎn)變成開鏈的多元醇，這類的殘基對高磺酸鹽是敏感的(見J.Immunol，127，1011(1981)和US專利4356170，作者Harold J.Jennings等)，因而將醛基引入到N-?；腉BMP的兩個末端上。
各種N-酰化的GBMP的分級用凝膠過濾法，Ultrogel(商名)AcA 44(圓柱直徑60-140μm)柱(IBF生物技術(shù)公司，Savage，MD)，PBS為洗脫劑，得所希望的平均分子量的氧化的N-酰化的GBMP物質(zhì)。于KD0.5～KD0.7(經(jīng)FLPC測定，見下)由柱中洗脫的組分收集后透析并凍干。KD0.2～KD0.4范圍的組分相當(dāng)于平均分子量為30000～40000道爾頓，也加以收集和結(jié)合，因此，在KD范圍為0.2～0.7的洗脫的N-?；镔|(zhì)是特別重要的。
多糖結(jié)合物被氧化的組份100mg溶解于2ml0.1M碳酸氫鈉緩沖溶液(pH8.1)中，向其中加入20mg破傷風(fēng)類毒素。最后，在加入氰代硼氫化鈉40mg后，于室溫下緩緩攪拌溶液，該結(jié)合過程用FPLC跟蹤，用含有Superose(商名)12 HR10/30(Pharmacia)的凝膠柱以1ml/分鐘的速度，pH7.2的PBS緩沖液洗脫，蛋白質(zhì)和N-酰化的GAMP都在214nm處監(jiān)測。該組分的KD值為0.6，破傷風(fēng)類毒素KD為0.39，在多數(shù)情況下，結(jié)合作用在2天內(nèi)完成，但再放置使總反應(yīng)時間為4天。潛存的未被反應(yīng)的醛基最后用20mg硼氫化鈉還原后，再進行凝膠過濾。
多糖破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物與多糖組分分開是用凝膠過濾法Bio-Gel A柱，PBS洗脫。將含有結(jié)合物的洗脫液對蒸餾水透析，凍干。N-?；腉BMP破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物含有唾液酸12～30%，特別是12～20%，測定法用間苯二酚法，Svennerholm，L.，敘述于Biochem.Biophys.Acta24，604(1957)，題目是唾液酸的定量測定，Ⅱ間苯二酚-鹽酸比色測定法。結(jié)果提示，結(jié)合物中多糖與破傷風(fēng)類毒素的摩爾比為2-3∶1。
實施例3下面敘述多糖-蛋白載體結(jié)合物與長鏈烷基氨基酸或肽酯佐劑復(fù)合的一般方法。
長鏈烷基酯佐劑粉碎后過篩，稱取適宜量放入瓶內(nèi)，加入磷酸緩沖食鹽液后使懸浮液(10mM磷酸鹽，pH7.4)，濃度為1～2mg/ml。充分混合該懸浮液，加入等體積和有同樣緩沖液的結(jié)合物，于4℃緩緩振搖總混合液16小時，復(fù)合作用結(jié)束時，若希望測定與佐劑復(fù)合的結(jié)合物的量時，可將懸浮液離心，上清液中的結(jié)合物濃度(蛋白載體濃度)用Lowry等在J.Biological Chemistry，193，265～275(1951)所述的方法測定，得出未結(jié)合的結(jié)合物量。一般地講，結(jié)合型的結(jié)合物達(dá)到30～90%表示有較好的佐劑-多糖結(jié)合物的復(fù)合，結(jié)合型的和未結(jié)合的結(jié)合物都用來進行免疫實驗。
實施例4本實施例說明了一些長鏈(18個碳原子)酯對腦膜炎球菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合型疫苗的輔佐作用。
雌性CF1小白鼠，8-10周齡，每只小鼠在0日，14日，28日腹腔注射大約15μg結(jié)合物(多糖近3μg)。在第39天用心臟穿刺法使小鼠放血，在有佐劑存在下或作為對照的無佐劑存在下，每次注射的總體積都是0.2ml。
用如上所述的還原氨化偶聯(lián)法使腦膜炎球菌多糖和類毒素載體結(jié)合，化學(xué)改良的腦膜炎球菌B多糖的制備如上所述。
在血清中抗體的濃度用酶免疫測定法測定，方法如下96池的聚苯乙烯板(Corning)用適宜的莢膜多糖-牛血清白蛋白結(jié)合物的磷酸緩沖生理食鹽水溶液(10mM磷酸鹽，pH7.4)敷于小池中，每個池中的濃度為1μg，37℃下保持1小時。然后用0.1%牛血清白蛋白在磷酸緩沖生理鹽水的溶液于37℃封閉該板一小時，封閉后空板用含有0.05%的吐溫20洗滌劑(PBST)的磷酸緩沖生理鹽水洗滌四次?？粘刂屑尤胗糜诜治龅臉悠罚覝叵卤?小時。用PBST洗5次后，每個小池中加入標(biāo)記有過氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(H+L)結(jié)合物，在PBST中為1/200，測定板在室溫下保溫半小時。再用PBST洗5次后，每個池內(nèi)加入四甲基聯(lián)苯胺，室溫下保溫10分鐘，用1M磷酸使酶催化的反應(yīng)停止，之后在450nm下用板計數(shù)器(Biotek)讀出每個池的吸光度，抗體的滴度是樣品的吸光度為1.0時稀釋度的倒數(shù)，滴度用相對于沒有佐劑的對照的比值來表示，結(jié)果列于表1。
表1在長鏈(C18)酯存在下對腦膜炎球菌結(jié)合型疫苗的抗體應(yīng)答，滴度是用在沒有佐劑(對照;結(jié)合型疫苗于緩沖的生理食鹽水液中)時抗體應(yīng)答的比例來表示。
佐劑 腦膜炎球菌結(jié)合物A.B.(丁酰)C.
對照(PBS) 1.0 1.0 1.0酪氨酸十八烷醇酯0.5mg/ml 3.5 1.3 1.91.0mg/ml 3.7 1.9 3.2酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯0.5mg/ml 3.0 1.8 1.9N-甘氨酰乙醇胺O-硬脂酸酯0.5mg/ml 1.0 1.5 1.0賴氨酸十八烷醇酯1.0mg/ml N.D. 1.3 1.8Forphenicine十八烷醇酯1.0mg/ml N.D. 1.9 1.8N.D.＝未測定表1的結(jié)果表明，長鏈酯確實對細(xì)菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合物表面有輔佐作用，該輔佐作用取決于酯的類型和存在的細(xì)菌多糖的類型。這是個特異現(xiàn)象，通過比較酪氨酸十八烷醇酯和N-甘氨酰乙醇胺O-硬酯酸酯腦膜炎球菌A和C結(jié)合物的不同可以看出。
實施例5本實施例說明由無佐劑到有佐劑作用時，腦膜炎球菌多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合型疫苗所引起的同型的變化。
白色CF1小鼠免疫后，按實施例4所述得到的血清，適宜的腦膜炎球菌多糖-牛血清白蛋白結(jié)合物的磷酸緩沖生理食鹽水溶液(10mM磷酸鹽，pH7.4)敷于有96小池的聚乙烯苯板(Corning)上，方法如實施例4所述。于37℃下封閉該板1小時，然后用2.5%脫脂牛奶的磷酸緩沖生理鹽水溶液于室溫下封閉半小時。
用PBST洗滌四次后，加入用于分析同型的樣品，于室溫下保溫1小時，用PBST洗五次后，每個小池內(nèi)加入家兔抗小鼠亞類特異探針(Bio-Rad Laboratories)，Mouse Typer亞同型板條，并于室溫下將試驗板保溫1小時。再用PBST洗滌五次后，加入標(biāo)記有過氧化酶的山羊抗家兔(IgG(H+L))結(jié)合物的PBST1/3000液，室溫下保溫此板半小時。再用PBST洗滌五次后，小池中加入四甲基聯(lián)苯胺室溫下保溫6分鐘，加入1M磷酸使反應(yīng)停止。在450nm下用板計數(shù)器(Biotek)讀出每個池的吸光度。抗體的滴度是樣品的稀釋度乘以吸光度的倒數(shù)，滴度用相對于對照(無佐劑)的比值來表示，結(jié)果列于表2。
表2抗腦膜炎球菌A和C結(jié)合物應(yīng)答的同型變化。滴度是在沒有佐劑存在時(對照;結(jié)合型疫苗的緩沖生理食鹽水溶液)抗體應(yīng)答的比值，佐劑濃度為0.5mg/ml。
佐劑 免疫球蛋白(腦膜炎球菌A)IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM對照(PBS) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0酪氨酸十八烷醇酯 2.6 5.7 4.3 4.4 3.4酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯 1.6 3.9 3.6 2.6 1.6N-甘氨酰乙醇胺 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0O-硬脂酸酯佐劑 免疫球蛋白(腦膜炎球菌C)IgG1 IgG2a IgG2 IgG3 IgM對照(PBS) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0酪氨酸十八烷醇酯 2.1 5.2 2.3 4.3 1.7酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯 2.1 2.9 1.9 2.9 1.7N-甘氨酰乙醇胺 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0O-硬脂酸酯表2結(jié)果表明，長鏈酯確實以有利的方式影響同型的分布。這可由在酪氨酸十八烷醇酯存在下檢驗IgG2a/IgG1的比值看出(對于抗腦膜炎球菌A的比值為2.2;抗腦膜炎球菌C的比值為2.5)。
實施例6本實施例說明，在長鏈酯佐劑的存在下，增加的抗體應(yīng)答轉(zhuǎn)變成積極的生物效應(yīng);保護機體免受活的致病細(xì)菌的侵襲。
按實施例4所述免疫白色CF1小鼠。40日齡小鼠腹腔注入大約2000個腦膜炎奈氏球菌B，血清型2b，80165株。5小時后，小鼠放血，測定剩存的活菌數(shù)作為“克隆形成單位”(CFU/ml)。N-丙?；蚇-丁酰基腦膜炎球菌B多糖的制備是按前述的方法將N-脫乙?；嗵桥c相應(yīng)的酸酐反應(yīng)而得，結(jié)果列于表3。
表3N-丙酰(NPr)和N-丁酰基(NBu)改良的腦膜炎球菌B多糖-破傷風(fēng)類毒素(TT)結(jié)合物與酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯佐劑對小鼠的有效保護作用。佐劑濃度為075mg/ml。
免疫原 CFU/ml 菌血小鼠數(shù)1)佐劑 3584 5/52)NPr多糖 2664 5/53)NPr多糖 640 4/5TT結(jié)合物4)NPr多糖 0 0/5TT結(jié)合物+佐劑5)NBu多糖 296 1/5TT結(jié)合物+佐劑表3結(jié)果表明，佐劑和多糖結(jié)合型疫苗有最好的保護作用，單獨用佐劑無效。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，其特征是含有一個細(xì)菌多糖蛋白結(jié)合物和有效量的下式的至少一個佐劑
式中C選自氫、氨基酸殘基和肽殘基組成的基團組；D選自氫和藥用酸組成的基團組；E選自4-羥基芐基，芐基、4-羥基苯基，苯基，4-氨基丁基，異丙基，甲基，氫和天然存在的氨基酸殘基所組成的基團組；A是(CH2)n，氧或CH2O，B是(CH2)n或氧，其中n是0～4，前提是A和B不能同時是(CH2)n和氧；R是12～20個碳原子的烷基。
2.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該佐劑為具有L-構(gòu)型的氨基酸。
3.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該佐劑為具有D-構(gòu)型的氨基酸。
4.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該佐劑為D-和L-構(gòu)型氨基酸混合物。
5.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，E是選自4-羥基芐基，芐基，4-羥基苯基，苯基和氫組成的基團組。
6.按照權(quán)利要求5的一種組合物，其特征是，E為4-羥基芐基。
7.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，C是選擇氫、氨基酸殘基和包括有多達(dá)10個氨基酸殘基的肽殘基所組成的基團組。
8.按照權(quán)利要求7的一種組合物，其特征是，該肽殘基選自二肽和三肽。
9.按照權(quán)利要求7的一種組合物，其特征是，C是一氨基酸，并且選自酪氨酰甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，甘氨酰酪氨酸和苯丙氨酰甘氨酸所組成的殘基組。
10.按照權(quán)利要求8的一種組合物，其特征是，C是個二肽，并且選自酪氨酰甘氨酰甘氨酸和酪氨酰丙氨酰甘氨酸所組成的殘基組。
11.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，藥用酸選自鹽酸，氫溴酸，磷酸，硫酸，酒石酸，乳酸和乙酸所組成的一組酸。
12.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該佐劑包括一種α-氨基酸。
13.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該細(xì)菌多糖多肽偶聯(lián)于生物載體上。
14.按照權(quán)利要求13的一種組合物，其特征是，該載體選自破傷風(fēng)類毒素，無細(xì)胞百日咳疫苗(LPF)，交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRM)和細(xì)菌蛋白載體所組成的一組。
15.按照權(quán)利要求14的一種組合物，其特征是，該CRM是CRM197。
16.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該細(xì)菌多糖選自莢膜多糖，脂質(zhì)多糖和莢膜下表面多糖所組成的一組。
17.按照權(quán)利要求16的一種組合物，其特征是，該莢膜多糖分離自流感嗜血菌，腦膜炎奈氏球菌，肺炎鏈球菌，無乳鏈球菌，傷寒沙門氏菌，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌所組成的菌組。
18.按照權(quán)利要求16的一種組合物，其特征是，該脂質(zhì)多糖分離自腦膜炎奈氏球菌，大腸桿菌，傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌組成的菌組。
19.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該莢膜下(表面)多糖選自A族、B族和C族鏈球菌的普通多糖抗原和肺炎鏈球菌的普通多糖抗原所組成的抗原組。
20.按照權(quán)利要求1的一種組合物，其特征是，該佐劑是一種含14～20個碳原子的烷基醇和一種氨基酸，二肽或三肽形成的酯。
21.按照權(quán)利要求20的一種組合物，其特征是，該佐劑是酪氨酸十八烷醇酯。
22.按照權(quán)利要求20的一種組合物，其特征是，該佐劑是酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯。
23.一種誘導(dǎo)病人免疫應(yīng)答的方法，其特征是，給該病人以有效治療量的權(quán)利要求1的疫苗組合物。
24.按照權(quán)利要求23的一種方法，其特征是，該組合物的給藥途徑是肌肉，皮內(nèi)和皮下注射，或經(jīng)鼻腔給入。
25.按照權(quán)利要求23的一種方法，其特征是，該疫苗組合物給藥后并不明顯地增高IgE水平但確實可增加IgG2a對IgG1抗體的比值。
26.一種生成疫苗組合物的方法，其特征是，把權(quán)利要求1定義的細(xì)菌多糖蛋白結(jié)合物和佐劑，以足以能產(chǎn)生免疫上有效的疫苗組合物的用量，制成劑型。
全文摘要
由長鏈烷基化合物作為免疫佐劑與細(xì)菌多糖蛋白結(jié)合物組合構(gòu)成的改進的疫苗組合物，本發(fā)明的組合物用于活化免疫系統(tǒng)以賦予宿主以免疫力，以預(yù)防的方式對抗免疫原。
文檔編號A61K39/095GK1060408SQ91108999
公開日1992年4月22日 申請日期1991年9月17日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月17日
發(fā)明者克里斯托弗·L·彭尼, 弗朗西斯·米瓊, 哈爾德·J·詹寧斯 申請人:北美疫苗公司