專利名稱:牛生長(zhǎng)激素釋放因子的前體形式及有關(guān)的dna化合物的制作方法
生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)可用來(lái)刺激人和動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生。牛GRF(bGRF)的獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用特別重要。現(xiàn)已闡明了成熟bGRF的氨基酸順序(Esch等,BBRC 117772-779,1983)。然而,在本發(fā)明之前,一直沒(méi)有搞清編碼bGRF的天然DNA順序。本發(fā)明提供了前所未知的多肽化合物,包括兩種形式的bGRF前體和bGRF肽。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明多肽化合物和成熟bGRF的DNA化合物。
本發(fā)明提供的DNA化合物包括編碼牛生長(zhǎng)激素釋放因子、bGRF前體及bGRF先導(dǎo)肽的DNA順序。本發(fā)明提供的多肽化合物中除了與bGRF前體相連的bGRF先導(dǎo)肽之外,還包括bGRF前體。
本發(fā)明的多肽化合物為SEQ ID No.4或6及其可藥用酸加成鹽或羧酸加成鹽。
本發(fā)明的DNA化合物包括編碼成熟bGRF、bGRF前體和bGRF先導(dǎo)肽的DNA順序。編碼成熟bGRF的優(yōu)選DNA順序?yàn)镾EQ ID No.1。
編碼bGRF前體的優(yōu)選DNA順序?yàn)镾EQ ID No.3。
編碼前面接有先導(dǎo)肽順序的bGRF前體的優(yōu)選DNA順序?yàn)镾EQ ID No.5。
本發(fā)明還提供了一些藥物組合物,其中的活性成分為包含bGRF前體的多肽化合物。最后,本發(fā)明提供誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素釋放的方法,該方法包括給予包含bGRF前體的多肽化合物。這些組合物和方法可用于在包括人、豬、牛、羊、禽類和魚(yú)在內(nèi)的各種動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素的釋放。這些組合物和方法優(yōu)選用于牛。
下列章節(jié)對(duì)本發(fā)明作了更詳細(xì)的敘述。為清楚和便于理解本發(fā)明起見(jiàn),下列術(shù)語(yǔ)和縮寫定義如下。
GRF具有生長(zhǎng)激素釋放因子活性的多肽。
GRF(1-29)NH2GRF中達(dá)到全部效力所需的最少部分。
大腸桿菌中的高水平表達(dá)以能用考馬斯藍(lán)染色法檢測(cè)出基因產(chǎn)物的水平生產(chǎn)由克隆基因編碼的GRF類似物。
孤立DNA順序其位置與其在基因組DNA中的天然位置不同的任何DNA順序,無(wú)論是怎樣構(gòu)建或合成的。此定義包括除天然態(tài)以外所有形式的孤立DNA順序。例如,該DNA順序可以插入到質(zhì)?;蚴删w載體中,或者插入到它原來(lái)所在的有機(jī)體或任何其他有機(jī)體的基因組中,以增加基因劑量。
成熟bGRFbGRF(1-44);SEQ ID No.2bGRF前體bGRF(1-76);SEQ ID No.4這里提供的附圖未按確切比例畫出。
圖1質(zhì)粒pHS 507的限制位點(diǎn)和功能圖譜。
本發(fā)明提供一些孤立DNA化合物,這些化合物包含編碼成熟生長(zhǎng)激素釋放因子、bGRF前體和與bGRF前體相連的bGRF先導(dǎo)肽的DNA順序。本發(fā)明還提供一些多肽化合物。
雖然以前已闡明了一種形式的成熟bGRF的氨基酸結(jié)構(gòu)(Esch等,Biochem.Biophys.Res.Commun.117772,1983),但本發(fā)明提供的是迄今為止尚屬未知的bGRF前體。該前體化合物可由SEQ ID No.4及其可藥用酸加成鹽或羧酸加成鹽表示。這種bGRF前體特別有用,因?yàn)樗鼭M足了本領(lǐng)域?qū)哂衎GRF活性且能在大腸桿菌中高水平產(chǎn)生的化合物的需求。這些化合物的大小足以避免在大腸桿菌中成熟GRF表達(dá)過(guò)程中所遇到的嚴(yán)重降解問(wèn)題(參見(jiàn)例如Kirschner等,J.Biotech.12247-248,1989)。
本發(fā)明的另一種多肽化合物是在氨基末端連有bGRF先導(dǎo)肽的bGRF前體。該化合物可由SEQ ID.No.6及其可藥用酸加成鹽或羧酸加成鹽表示。
SEQ ID No.6化合物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)特別有用。先導(dǎo)肽引起多肽產(chǎn)物的分泌,隨著產(chǎn)物的分泌而切除先導(dǎo)肽。
本發(fā)明的所有肽化合物都可由本領(lǐng)域公知的化學(xué)方法來(lái)制備,包括固相肽合成法或重組法。這兩種方法都描述于美國(guó)專利4,617,149,該專利在此列為參考。如果希望達(dá)到高產(chǎn)率,則優(yōu)選重組法。構(gòu)建任何所需DNA順序的一般方法見(jiàn)Brown等人的報(bào)導(dǎo)(Methods in Enzymology,68109,1979),該文獻(xiàn)在此列為參考。
這些DNA順序可以用DNA自動(dòng)合成儀來(lái)合成,例如用ABS(Applied Biosystems,850 Lincoln Center Drive,F(xiàn)oster City,CA 94404)380B型DNA合成儀。這些DNA順序也可通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生。參見(jiàn)例如1987年3月2日公開(kāi)的美國(guó)專利公告0258017。
本發(fā)明多肽化合物的氨基酸順序可由多個(gè)不同的DNA順序來(lái)編碼,因?yàn)榇蟛糠职被岫加刹恢挂粋€(gè)DNA三聯(lián)體編碼。由于這些可替換DNA順序編碼相同的氨基酸順序,所以本發(fā)明還包括這些可替換順序。
專業(yè)人員公認(rèn),多肽在大腸桿菌中的翻譯是通過(guò)甲硫氨酸殘基起始的。本發(fā)明的多肽并不以甲硫氨酸起始。所以上述化合物可以以多種方式產(chǎn)生。該多肽化合物表達(dá)后,通過(guò)多種公知途徑中的任一途徑切除由甲硫氨酸或甲硫氨酸與另一些氨基酸組成的先導(dǎo)順序。參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,745,069和4,782,139;Villa等,Eur.J.Biochem.171137,1988;Geli等,Gene 80129,1989;歐洲專利公開(kāi)0199018。
其他生產(chǎn)途徑是專業(yè)人員所公知的。例如,用SV40衍生載體在真核細(xì)胞中產(chǎn)生這些化合物。通過(guò)bGRF前體cDNA順序?qū)崿F(xiàn)在真核細(xì)胞中的表達(dá)。美國(guó)專利4,775,624描述了這樣一種方法。一些可替代的表達(dá)方法描述于J.Sambrook,E.F.Fritsch & T.Maniatis,Molecular CloningA Laboratory Manual 16.3-17.44,1989。在啤酒酵母中進(jìn)行基因表達(dá)的方法詳述于《Current Protocols in Molecular Biology》一書(shū)(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith & K.Struhl,1989)。
本發(fā)明的DNA順序編碼本發(fā)明的多肽化合物和成熟bGRF。成熟bGRF的氨基酸順序是已知的,但編碼它的DNA順序在本發(fā)明之前一直是未知的。
本發(fā)明的多肽化合物包括它們的可藥用無(wú)毒酸加成鹽,以及它們的可藥用無(wú)毒羧酸鹽。
術(shù)語(yǔ)“可藥用無(wú)毒酸加成鹽”既包括有機(jī)酸加成鹽也包括無(wú)機(jī)酸加成鹽,包括例如由下列酸制得的鹽鹽酸、氫氟酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富馬酸、氫溴酸、羥基乙酸、檸檬酸、馬來(lái)酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗壞血酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸等。酸加成鹽最好是由鹽酸、乙酸或琥珀酸制得的鹽。所有上述鹽都可由常規(guī)方法制備。
術(shù)語(yǔ)“羧酸鹽”包括,例如胺鹽、銨鹽、季銨鹽、堿金屬和堿土金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽、鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽)等。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物,該組合物包含作為活性成分的多肽化合物或其可藥用的酸加成鹽或羧酸加成鹽,以及可藥用的固體或液體載體,其中所述多肽化合物為SEQ ID No.4。
本發(fā)明還提供一種誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素釋放的方法,該方法包括給予有效量的由SEQ ID No.4表示的多肽化合物或其可藥用的酸加成鹽或羧酸加成鹽。
在需要刺激生長(zhǎng)激素釋放的時(shí)間內(nèi),給予受藥者若干劑量的本發(fā)明前體化合物。受藥者的體重和給藥方式將影響誘導(dǎo)特定反應(yīng)所需劑量的大小。對(duì)牛來(lái)說(shuō),優(yōu)選劑量估計(jì)為約3毫克/天。
腸胃外給予本發(fā)明的多肽化合物時(shí),適于注射用的藥物劑型包括無(wú)菌水溶液或分散液,以及可供復(fù)原為無(wú)菌注射液或分散液的無(wú)菌粉末。載體可以是含有以下物質(zhì)的溶劑或分散介質(zhì)例如,水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、上述物質(zhì)的合適混合物、或植物油。可以用以下手段保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性例如,使用包衣如卵磷脂、在分散液的情況下保持所要求的粒度、以及使用表面活性劑。用各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑,如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等,可以確保防止微生物的作用。在許多情況下都希望加入等滲劑,如糖類、氯化鈉等。使用延遲吸收劑,例如單硬脂酸鋁和明膠,可以使注射用藥物劑型達(dá)到長(zhǎng)期吸收。
將本發(fā)明化合物與所需要的各種其它試劑一起加到所需量的適當(dāng)溶劑中,即可制得無(wú)菌注射液。如果需要,或者為了使化合物分布更為有效,可以把化合物摻入緩釋體系或定靶釋放體系,如聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球體??梢酝ㄟ^(guò)機(jī)械釋放裝置、滲透壓泵、或能連續(xù)或脈動(dòng)釋放的任何其他釋放裝置或體系來(lái)釋放。由于肽類化合物的給藥技術(shù)剛剛起步,預(yù)計(jì)這一技術(shù)將會(huì)出現(xiàn)重大進(jìn)展。本發(fā)明化合物可用這些新方法給藥。
特別有利的是把本發(fā)明化合物配制成單位劑型,這樣既便于給藥也能使劑量均一。這里所用的單位劑型是指對(duì)治療對(duì)象來(lái)說(shuō)適于作為單位劑量的物理上獨(dú)立的單元。每個(gè)單元含有經(jīng)計(jì)算能達(dá)到預(yù)期療效的預(yù)定量的化合物,以及可藥用的載體。具體的單位劑型受制于或直接取決于以下兩個(gè)因素(a)特定組合物的獨(dú)特特征;(b)所要達(dá)到的特定療效。
下列實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明,但并不打算限制其范圍。
實(shí)施例1bGRF前體在大腸桿菌中的表達(dá)質(zhì)粒pHS 507可從NRRL以大腸桿菌DH5 a/pHS 507株得到,其登記號(hào)為B-18766(保藏日1991年2月9日)。用美國(guó)專利4,828,988的方法表達(dá)bGRF前體,上述專利在此列為參考。
實(shí)施例2bGRF前體的純化用S Sepharose(Pharmacia,800 Centennial Ave.,Piscataway,NJ 08854)樹(shù)脂制備陽(yáng)離子交換柱。該柱中每50克材料含有1升樹(shù)脂。將含有bGRF前體的物料以0.1升/厘米2/小時(shí)的流速加到柱中,用2個(gè)柱體積的含0.05N乙酸-7M脲的0.1M氯化鈉洗滌。用各為3個(gè)柱體積的0.25M和1.6M氯化鈉在乙酸-脲中的溶液形成0.25M-1.6M線性梯度,對(duì)多肽進(jìn)行洗脫,以0.1個(gè)柱體積為一個(gè)級(jí)分進(jìn)行收集。利用導(dǎo)電性、O.D.276、HPLC和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定出含多肽的級(jí)分,然后合并這些級(jí)分。
各級(jí)分合并后向其中加入等體積的乙酸-脲溶液。將該物料加到裝有S Sepharose樹(shù)脂并以乙酸-脲為介質(zhì)的柱上,樹(shù)脂的粒度為每升樹(shù)脂能容納50克蛋白質(zhì)。流速為0.02升/厘米2/小時(shí)。用0.25M氯化鈉在乙酸-脲中的線性梯度洗脫bGRF前體級(jí)分。以0.1個(gè)柱體積為一個(gè)級(jí)分進(jìn)行收集。如上所述分析各級(jí)分,合并含bGRF前體的級(jí)分。
以0.02M甘氨酸(pH 2.5)為介質(zhì)制備一個(gè)Sephadex G-15(Pharmacia)柱,其柱體積相當(dāng)于前面所合并各級(jí)分總體積的5倍。分離出含O.D.276峰的級(jí)分。
然后制備一個(gè)裝有SP20SS樹(shù)脂(Sephabeads,Mitsubishi Chemical,Tokyo)并以10%乙腈-0.02M甘氨酸(pH 2.5)為介質(zhì)的柱。將含bGRF前體的合并液調(diào)至乙腈濃度為10%,然后加到柱中,流速為每小時(shí)1.5-2個(gè)柱體積。用2個(gè)柱體積的乙腈-甘氨酸緩沖液洗柱。由三個(gè)柱體積的10%乙腈-0.02M甘氨酸與三個(gè)柱體積的50%乙腈-0.02M甘氨酸混合形成梯度,用該梯度來(lái)洗脫bGRF前體。以0.1個(gè)柱體積為一個(gè)級(jí)分進(jìn)行收集,并分析各級(jí)分中是否含有bGRF前體。
然后,將含bGRF前體的物料在用0.25M乙酸平衡過(guò)的Sephadex G 15柱上進(jìn)行層析。然后分離出O.D.276峰,冷凍干燥后備用。
順序表(1)概況(ⅰ)申請(qǐng)人Bierman,Kristin L.
Chan,GingHeiman,Mark L.
Hsiung,Hansen M.
(ⅱ)發(fā)明名稱牛生長(zhǎng)激素釋放因子的前體形式及有關(guān)的DNA化合物(ⅲ)順序數(shù)目6(ⅳ)通訊地址美國(guó)印第安納州印第安納波利斯利利總部中心專利部/AEH。郵區(qū)46285。
(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)存儲(chǔ)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)Macintosh(C)操作系統(tǒng)Macintosh(D)軟件Microsoft Word(ⅵ)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?br>
(B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅷ)代理機(jī)構(gòu)情況(A)名稱中國(guó)專利代理(香港)有限公司(B)代理機(jī)構(gòu)代碼72001(C)代理案號(hào)CPCH 926116W(B032)(ⅸ)電信通訊(A)電話8284688(B)傳真8271018、8271172、8271638(2)SEQ ID No.1情況(ⅰ)順序特性(A)長(zhǎng)度132堿基對(duì)(B)類型核酸(C)成鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵字CDS(B)存儲(chǔ)位置1..132(ⅹⅰ)順序說(shuō)明SEQ ID No.1
(2)SEQ ID No.2情況(ⅰ)順序特性(A)長(zhǎng)度44個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序說(shuō)明SEQ ID No.2
(2)SEQ ID No.3情況(ⅰ)順序特性(A)長(zhǎng)度228堿基對(duì)(B)類型核酸(C)成鏈性雙鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵字CDS(B)存儲(chǔ)位置1..228(ⅹⅰ)順序說(shuō)明SEQ ID No.3
(2)SEQ ID No.4情況(ⅰ)順序特性(A)長(zhǎng)度76個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序說(shuō)明SEQ ID No.4
(2)SEQ ID No.5情況(ⅰ)順序特性(A)長(zhǎng)度318堿基對(duì)(B)類型核酸(C)成鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵字CDS(B)存儲(chǔ)位置1..318(ⅹⅰ)順序說(shuō)明SEQ ID No.5
(2)SEQ ID No.6情況(ⅰ)順序特性(A)長(zhǎng)度106個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序說(shuō)明SEQ ID No.權(quán)利要求
1.一種在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素釋放的方法,該方法包括給予有效量的SEQ LD No.4多肽化合物及其可藥用的酸加成鹽或羧酸加成鹽。
2.一種在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生式SEQ ID No.4多肽化合物的方法,該方法包括(1)用一種重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,該重組載體包括(a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯活化順序;(b)SEQ ID No.3的DNA化合物,其定位使它能夠由活化順序得到表達(dá);(2)在允許基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟(1)中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
3.一種在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生式SEQ ID No.6多肽化合物的方法,該方法包括(1)用一種重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞,該重組載體包括(a)一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯活化順序;(b)SEQ ID No.5的DNA化合物,其定位使它能夠由活化順序得到表達(dá);(2)在允許基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟(1)中轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一些多肽化合物,這些化合物為兩種形式的牛生長(zhǎng)激素釋放因子(bGRF)前體和bGRF先導(dǎo)肽,以及一種新形式的成熟bGRF。本發(fā)明還提供編碼這些多肽化合物和成熟bGRF的DNA化合物、誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素釋放的藥物組合物及方法。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1066193SQ9210268
公開(kāi)日1992年11月18日 申請(qǐng)日期1992年4月16日 優(yōu)先權(quán)日1991年4月19日
發(fā)明者K·L·比爾曼, G·陳, M·L·海曼, H·M·熊 申請(qǐng)人:伊萊利利公司