專利名稱：親脂寡糖抗生素組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的包括親脂寡糖抗生素的組合物，含該組合物材料的醫(yī)藥配制品，以及制造方法和使用這些藥物組合物治療和/或預(yù)防動(dòng)物特別是哺乳動(dòng)物如人之微生物感染的方法。
親脂寡糖抗生素包括例如晚霉素、居拉霉素、卑霉素及弗來巴霉素，這些抗生素均為orthosomycin家族的成員，它們含至少一個(gè)酸性酚氫，以及與羧酸酯殘基聯(lián)接的兩個(gè)原酸酯鍵(如參見A.K.Ganguly，“Kirk-Othmer，Encyclopedia of Chemical Technology”(1978)，Vol.2，pp.205-209，3th Edition，John Wiley and Sons and W.D.Ollis et al.，Tetrahedron(1979)，Vol.35，pp.105-127)。這些親脂寡糖抗生素在各種體外試驗(yàn)中表現(xiàn)有對抗革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性菌的廣譜生物學(xué)活性，并在動(dòng)物模型如小鼠身上表現(xiàn)有體內(nèi)活性，但迄今為止還沒有得到用于體內(nèi)給藥的這些抗生素的醫(yī)藥配制品。例如，我們已觀察到注射這些親脂寡糖抗生物可引起不良性反應(yīng)綜合癥。本文所說的“不良反應(yīng)綜合證”是指在經(jīng)胃腸道外途徑使用親脂寡糖抗生素后可在動(dòng)物身上觀察到的下列型式的綜合癥共濟(jì)失調(diào)、側(cè)臥、排尿、后腿強(qiáng)直、呼吸困難及受阻。因此，總地說來，目前還沒有能安全并有效地在包括人在內(nèi)之哺乳動(dòng)物體內(nèi)使用這些強(qiáng)有力抗生素的醫(yī)藥上可接受的組合物。
環(huán)糊精是由吡喃葡糖單位制得的經(jīng)修飾的淀粉，并包括由六個(gè)吡喃葡糖單位組成的α-環(huán)糊精，由七個(gè)吡喃葡糖單位組成的β-環(huán)糊精，以及由八個(gè)吡喃葡糖單位組成的γ-環(huán)糊精。α、β和γ-環(huán)糊精及其衍生物具有一個(gè)親脂的內(nèi)表面或空洞，以及一個(gè)親水的外表面。疏水空洞和親水外表面的這種結(jié)合，得以使用環(huán)糊精及其衍生物來對許多有適當(dāng)大小的疏水和/或不穩(wěn)定藥物進(jìn)行分子復(fù)合或膠囊化，從而改善這些藥物的溶解性，穩(wěn)定性和生物有效性。Jozsef Szejili(Pharmaceutical Technology，June 1991，36-40)公開了α、β和γ-環(huán)糊精的衍生物如羥丙基-β-環(huán)糊精。
N.Bodor在美國專利USP4，983，586中公開了α、β和γ-環(huán)糊精的復(fù)合物、混合物及其衍生物。Boder的USP4，983，586中公開了將親水或水不穩(wěn)定性藥物加在含有大量如20-50%(重量)羥丙基-β-環(huán)糊精的水溶液中經(jīng)胃腸道外給藥，以減少給藥后使所說的藥物在/或靠近注射部位或肺部發(fā)生沉淀的方法。
Josef Pitha在USP4，727，064和The International J.of Pharmaceutics(1986)29，73-82中公開了使用濃的(即占重量比40-60%)羥丙基-β-環(huán)糊精水溶液來穩(wěn)定各種藥物如撲熱息痛、類固醇類性激素、強(qiáng)心甙(如洋地黃)、以及視黃酸及其鹽的方法。另外，Pitha的USP4，596，795中還描述了作為與聚-β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精的復(fù)合物使用性激素如睪丸素、孕酮和雌二醇的方法。
Bodor和Pitha的文獻(xiàn)并沒有涉及苯酚類或親脂寡糖類抗生素。
Janssen Pharmaceutica N.V.的國際專利申請No.PCT/EP84/00417(公開號No.WO 85/02767，
公開日1985年7月4日)公開了含有不穩(wěn)定的或微溶于水中的藥物與部分醚化的β-環(huán)糊精(“β-CD)所形成之復(fù)合物的藥物組合物，所說的部分醚化的β-環(huán)糊精結(jié)構(gòu)式為(β-CD)-OR，其中基團(tuán)R是羥乙基、羥丙基、二羥丙基，且一部分基團(tuán)R可以是烷基基團(tuán)，特別是甲基或乙基。
按照J(rèn)anssen的WO 85/02767號專利申請的指導(dǎo)，如果藥物分子中含有可能借助鹽的形成來提高水溶性的堿性或酸性基團(tuán)，一般將導(dǎo)致藥物效力的降低或有損于其化學(xué)穩(wěn)定性，因而依靠生成鹽來增加水溶性差的酸性和堿性成分的溶解度受到障礙。該專利中沒有公開本發(fā)明的親脂寡糖抗生素或組合物。
有許多不同的菌株，如革蘭氏陽性菌(如鏈球菌和腸球菌)以及甲氧苯青霉素抗性和甲氧苯青霉素敏感性葡萄球菌已對市場上出售的抗生素如萬古霉素產(chǎn)生了抗性。
因此，需要能得到用于治療包括甲氧苯青霉素抗性和甲氧苯敏感性葡萄球菌以及萬古霉素抗性細(xì)菌引起之細(xì)菌性感染的藥物組合物。還需要得到含有對敏感性革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌感染有廣譜活性之親脂寡糖抗生素的藥物組合物，特別是適合于胃腸道外途徑應(yīng)用并避免發(fā)生不良反應(yīng)癥狀的藥物組合物。
我們已發(fā)現(xiàn)一種方法，可借以將對敏感性革蘭氏陽性和/或陰性細(xì)菌感染具有良好抗菌活性的親脂寡糖抗生素輸入動(dòng)物體內(nèi)，特別是被敏感性革蘭氏陽性或陰性細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物如人體內(nèi)，以有效地治療和/或預(yù)防所說的感染，同時(shí)避免發(fā)生有害的反應(yīng)癥狀。該方法包括使親脂寡糖抗生素與至少大約一份化學(xué)計(jì)算量的特定堿及一定量的制劑如每分子具有大約2-15個(gè)羥丙基基團(tuán)的羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精合并。使得親脂寡糖抗生素向動(dòng)物血清內(nèi)有效釋放，同時(shí)又可避免不良反應(yīng)癥狀。
本發(fā)明提供了包括下列組份的組合物(a)由式Ⅰ代表的親脂寡糖抗生素
其中
;
X＝NO2、NO、NH2、NHCOCH3、NHOH、NH(C2H5)、N(C2H5)2、OH或H;
R2＝CH3、COCH(CH3)2、COCH3、CO(CH2)3CH3、COCH2CH3或H;
R3＝CH3或H;
R4＝COCH3、CH(OCH3)(CH3)、CH(OH)CH3、CHO或H;
R5＝
或H;
R6＝CH3或H;
R7＝CH3或H;
R8＝CH3、CH2OH或HR9＝CH3或H;
Y＝OH、CH3或H;
W＝Cl或H;且Z＝Cl或H。
(b)至少一份化學(xué)計(jì)算量的可與式Ⅰ的親脂寡糖抗生素形成藥用鹽的堿;
(c)一定量的二甲基亞砜、甘油、一種去水山梨糖醇單-9-十八烯酸酯聚(氧-1，2-乙二基)衍生物、葡聚糖、一種羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精，其中所說的α-、β-和γ-環(huán)糊精上之羥丙基取代基的平均數(shù)為大約2至15，且所說的量足以使所說的親脂寡糖抗生素有效地輸送到動(dòng)物血清內(nèi)，同時(shí)避免了有害的反應(yīng)癥狀;以及(d)占式Ⅰ抗生素重量之0-6.0%的醫(yī)藥上可接受的非離子表面活性劑。
本發(fā)明優(yōu)選的是包括下列組份的組合物(a)由下列式Ⅱ代表的化合物
其中X＝NO2、NO、NHOH、NH2、NHCOCH3、NHC2H5、N(C2H5)2、OH或H;
Y＝OH、CH3或H;
R2＝H或CH3、
R3＝H;
R4＝H或CH(OCH3)(CH3);且R5＝H或
(b)至少一份化學(xué)計(jì)算量能夠與式Ⅱ的親脂寡糖抗生素形成藥用鹽的堿;
(c)一定量的羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精，其中所說的α-、β-和γ-環(huán)糊精上的羥丙基取代基的平均數(shù)目為大約2至15個(gè)，且所說的量是可將所說的親脂寡糖抗生素輸送到動(dòng)物的血清中，同時(shí)避免了有害反應(yīng)癥狀的出現(xiàn);以及(d)占所說式Ⅱ之抗生素重量0-6.0%的醫(yī)藥上可接受的非離子表面活性劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含下列組份的組合物(a)由式Ⅲ代表的抗生素化合物
(b)至少2當(dāng)量(每摩爾式Ⅲ化合物)能夠形成式Ⅲ化合物之藥用鹽的堿;
(c)一定量的羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精，其中每分子所說的-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精具有大約2-15個(gè)羥丙基基團(tuán)，且其中所說的環(huán)糊精的量足以使所說的親脂寡糖抗生素有效地釋放到動(dòng)物血清中，同時(shí)可避免有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生;以及(d)占式Ⅲ抗生素重量0-6.0%的醫(yī)藥上可接受的非離子表面活性劑。
本發(fā)明提供了將包括由式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ代表之化合物的化合物與至少一個(gè)化學(xué)計(jì)算量的能形成其藥用鹽的堿，以及一定量羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精及藥用載體相混合所形成的藥物組合物，以及使用這些藥物組合物治療或預(yù)防動(dòng)物，特別是需要進(jìn)行這種治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物的敏感性革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌感染的方法。
作為本發(fā)明的優(yōu)選形式，上述藥物組合物特別適用于胃腸道外給藥，特別是通過靜脈內(nèi)(Ⅳ)途徑對病人體內(nèi)給藥。
本發(fā)明還提供了在對動(dòng)物經(jīng)非胃腸道途徑注射式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ的親脂寡糖抗生素后防止有害反應(yīng)癥狀，同時(shí)將抗感染有效量的所說的抗生素輸送給動(dòng)物的方法，該方法包括經(jīng)胃腸道外途徑給所說的動(dòng)物使用足可達(dá)到治療或預(yù)防目的的加有藥用載體的本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用由式Ⅰ代表的親脂寡糖抗生素來制備藥物的方法，以用來治療或預(yù)防動(dòng)物，特別是需要這種治療或預(yù)防之哺乳動(dòng)物的敏感性革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌感染。


圖1中圖解顯示在不同時(shí)間里，碳酸小單孢子菌非洲變種(Micromonospora carbonacea Var.africana，NRRL 15099，ATCC39149)的發(fā)酵進(jìn)程。
親脂寡糖抗生素如晚霉素在體外表現(xiàn)出了有用的抗菌活性，但這類抗生素卻不容易形成適于安全并有效地進(jìn)行體內(nèi)給藥(如不會(huì)發(fā)生有害反應(yīng)癥狀)的完全水溶液。另外，這些抗生素與至少一個(gè)化學(xué)計(jì)算量的本發(fā)明中有用的堿如N-甲基葡糖胺(“NMG”)混和所形成的鹽，在適用pH值條件下并不能形成完全的水溶液。當(dāng)將所說的鹽以適用鹽濃度加到水中時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)只形成了膠體分散劑。這些膠體分散劑很可能凝集并最后形成凝膠，特別是當(dāng)存在已吸收的二氧化碳及這些膠體分散液的pH小于約9.3的情況下。我們觀察到，如將NMG對式Ⅲ化合物的摩爾比從2∶1或3∶1增加到12∶1可形成完成水溶液，但如此以12∶1摩爾比例形成溶液時(shí)具有不期望的高pH，須進(jìn)行高度緩沖并且有刺激性。因此，我們觀察到將每摩爾式Ⅲ化合物含有12摩爾NMG的水溶液經(jīng)胃腸道外途徑注入大鼠或高等靈長動(dòng)物如猴體內(nèi)，并不產(chǎn)生有害反應(yīng)癥狀(推測這是由于凝膠形成的和式Ⅲ化合物沉淀引起的)。該配制品在注射后產(chǎn)生的刺激作用可能是因大量NMG堿存在及在注射部位導(dǎo)致高pH引起的。然而，胃腸道外使用含有3-5摩爾NMG/1M式Ⅲ化合物的組合物有害的反應(yīng)癥狀增大。已知各種環(huán)糊精制劑可有助于制成特定藥物的溶液，如參見上面提到的Bodor和Pitha的文獻(xiàn)，但他們自己所使用的這類有代表性的制劑并沒有就親脂寡糖抗生素獲得預(yù)期的結(jié)果。因此，當(dāng)以每摩爾式Ⅲ的晚霉素型抗生素對6摩爾特定羥丙基-β-環(huán)糊精的比例使用特定的環(huán)糊精衍生物，如羥丙基-β-環(huán)糊精時(shí)，并不能產(chǎn)生真溶液。令人驚異的是，我們發(fā)現(xiàn)包含式Ⅲ的親脂寡糖抗生素、一定量的特定堿如NMG以及特定量的環(huán)糊精衍生物如羥丙基-β-環(huán)糊精的組合物，當(dāng)與醫(yī)藥上可接受的載體特別是水混合時(shí)，可以安全并有效地進(jìn)行體內(nèi)給藥。我們意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)1摩爾親脂寡糖抗生素如式Ⅲ化合物在水中與至少2到12摩爾的適當(dāng)堿如NMG和6摩爾如每分子有大約3至7.5個(gè)羥丙基基團(tuán)的羥丙基-β-環(huán)糊精混合時(shí)，可形成復(fù)合物的澄清水溶液(如使用光散射比濁法和質(zhì)子NMR線寬度測定法測定;參見實(shí)施例4)，并且即使以高劑量如每公斤體重800mg將這樣的復(fù)合物經(jīng)胃腸道外注入動(dòng)物體內(nèi)后，也不會(huì)引起不良性反應(yīng)癥狀(參見表4)。
如從表1中總結(jié)的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果所證明的，通過胃腸道外途徑給小鼠和猴注射鹽的水分散液，如式Ⅲ之晚霉素抗生素的NMG鹽，可產(chǎn)生不良反應(yīng)癥狀。而只有當(dāng)注射本發(fā)明組合物之一的水溶液如含有特定復(fù)合劑，例如每分子β-環(huán)糊精具有大約3-7.5個(gè)羥丙基基團(tuán)的羥丙基-β-環(huán)糊精及式Ⅲ的晚霉素型抗生素之NMG鹽的組合物時(shí)，則完全可以避免出現(xiàn)有害反應(yīng)癥狀。
表2顯示，通過腸胃道外給小鼠注射含式Ⅲ晚霉素型抗生素之NMG鹽和本發(fā)明指定的羥丙基-β-環(huán)糊精制劑的澄清水溶液，可減少或完全避免有害反應(yīng)癥狀。
表3顯示將堿對式Ⅲ之晚霉素型抗生素的摩爾比從2∶1增加到9∶1，通過腸胃道外給小鼠注射后在所有試驗(yàn)濃度下均可完全消除有害反應(yīng)癥狀。
比較實(shí)施例表1在給予含1摩爾式Ⅲ化合物和2摩爾加和不加HP-β-CD1之NMG的含水配制品后，出現(xiàn)不良反應(yīng)綜合癥的情況小鼠以下列劑量(MPK3)注射后出現(xiàn)(注射之Ⅲ的濃度:80mg/ml) 不良反應(yīng)綜合癥的百分率(%)21003200350038003Ⅲ4:2NMG 100 - - -Ⅲ:2NMG:6HPβCD50 0 0 0猴(注射之Ⅲ的濃度:50mg/ml)106406806Ⅲ:2NMG 50 - -Ⅲ:5NMG - 33 50Ⅲ:2NMG:6HPβCD5- 0 0
附注1.HP-β-CD是β-CD每分子含7.4個(gè)羥丙基基團(tuán)的羥丙基-β-環(huán)糊精。
2.在靜脈內(nèi)注射(單一劑量)后2分鐘內(nèi)觀察到的動(dòng)物的不良反應(yīng)綜合癥。
3.MPK是每公斤小鼠(每組5-10只，CF-1，平均體重20g，Harlan Sprague-Dawley，停食18小時(shí))體重所用藥物的毫克(mg)數(shù)。
4.Ⅲ是由式Ⅲ代表的晚霉素型抗生素化合物。
5.所形成的復(fù)合物。參見實(shí)施例3和4。
6.MPK是每公斤犬猴(體重2.9至9.6Kg，Schering Corporation Colony，停食18小時(shí))體重使用藥物的mg數(shù)。3只猴用于40MPK，5NMG實(shí)驗(yàn)中;2只猴用于其他兩組實(shí)驗(yàn)。
表2給予含1摩爾式Ⅲ化合物和2摩爾NMG及選擇之添加劑的制劑水溶液后的不良反應(yīng)綜合癥(ARS)′下列劑量(MPK2)的式Ⅲ藥物(20mg/ml)在小鼠體內(nèi)引起的ARS%"注射的式Ⅲ藥物" 100 200 250 300吐溫3(濃度)Ⅲ:2NMG 0 10 100 100Ⅲ:2NMG0.1% 10 100 100Ⅲ:2NMG0.25% 80 100 100Ⅲ:2NMG0.5% 100 100 100Ⅲ:2NMG1% 100 100 100Ⅲ:2NMG2% - 0 0 40Ⅲ:2NMG3% 0 0 0 0DMSO4(濃度)Ⅲ:2NMG0 0 90 100Ⅲ:2NMG1% 0 40 100 100Ⅲ:2NMG5% 0 10 20 50Ⅲ:2NMG10% 0 0 10 50
表2(續(xù))"注射的式Ⅲ藥物" 100 200 250 300甘油(濃度)Ⅲ:2NMG0 0 100 100Ⅲ:2NMG5% 0 90 90 100Ⅲ:2NMG10% 0 60 100 100葡聚糖405(濃度)Ⅲ:2NMG0 0 100 -Ⅲ:2NMG1% 20 100 -Ⅲ:2NMG10% 0 50 70 100葡聚糖706(濃度)Ⅲ:2NMG6% 0 90 100 -HPβCD7(摩爾比) 100 200 250 300Ⅲ:2NMG0 0 100 100Ⅲ:2NMG1:0.5 0 50Ⅲ:2NMG1:1.5 0 60Ⅲ:2NMG1:2.5 0 30Ⅲ:2NMG1:3 0 10Ⅲ:2NMG1:3 10Ⅲ:2NMG1:6 0
附注1.靜脈注射(單一劑量)后兩分鐘內(nèi)觀察到的小鼠(每組5至10只，CF-1，平均體重20g，Harlan Sprague Dawley，停食18小時(shí))的不良反應(yīng)綜合癥。
2.MPK是每Kg動(dòng)物體重所用藥物的mg數(shù)。
3.吐溫是聚(氧-1，2-乙二基)脫水山梨醇單-9-十八烯酸酯或作為得自ICI Americas Inc.，Wilimington Delaware，亦標(biāo)為吐溫80的聚山梨醇酯80。
4.DMSO是二甲基亞砜。
5.葡聚糖40是得自Sigma Chemical之葡萄糖的高分子量(40，000)聚合物。
6.葡聚糖70是得自Sigma Chemical之葡萄糖的高分子量(70，000)聚合物。
7.HPβCD是每分子CD有7.4個(gè)羥丙基基團(tuán)的羥丙基-β-環(huán)糊精。
表3親脂寡糖抗生素NMG鹽的濃度和NMG對抗生素的摩爾比例對小鼠之不良反應(yīng)綜合癥的影響式Ⅲ的藥物下列劑量(NMK2)下的%ARS1(藥物濃度) 50 100 200 300 400Ⅲ3:2NMG(10mg/ml) - - 50 - -Ⅲ:2NMG(20mg/ml) - 20 100 - -Ⅲ:2NMG(50mg/ml) 70 100 - - -Ⅲ:3NMG(20mg/ml) - - 0 0 20Ⅲ:3NMG(40mg/ml) - - 0 15 40Ⅲ:3NMG(80mg/ml) - - 100 - -Ⅲ:5NMG(20mg/ml) - - 0 0 -Ⅲ:5NMG(50mg/ml) - - 0 - 40Ⅲ:9NMG(20mg/ml) - - 0 0 0Ⅲ:9NMG(40mg/ml) - - 0 0 0Ⅲ:9NMG(80mg/ml) - - 0 - 0附注1.靜脈注射(單一劑量)后2分鐘內(nèi)所觀察到的小鼠(每組5-10只，CF-1，平均體重20g，Harlan Sprague Dawley，停食18小時(shí))的不良反應(yīng)綜合癥。
2.MPK是每Kg體重使用的式Ⅲ藥物的mg數(shù)。
3.Ⅲ是由式Ⅲ代表的晚霉素型抗生素化合物。
更加令人驚異的是，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用3-6摩爾羥丙基-β-環(huán)糊精(“HP-β-CD”)與1摩爾式Ⅲ化合物及2-3摩爾NMG結(jié)合生成的復(fù)合物時(shí)，我們在體外模型中觀察到的最小抑制濃度(MIC)和在小鼠體內(nèi)保護(hù)作用模型中觀察到的50%保護(hù)劑量(PD50)，與在同樣模型中使用式Ⅲ化合物和式Ⅲ化合物的NMG鹽與HPβCD所測得的上述MIC及PD50值基本相同。加入6摩爾HPβCD的每摩爾式Ⅲ化合物有2或3摩爾NMG之復(fù)合物的蛋白結(jié)合鹽，保留了用式Ⅲ化合物與2摩爾NMG所形成之鹽的蛋白結(jié)合值的96-98%。
因此，我們已驚奇發(fā)現(xiàn)，含有親脂寡糖抗生素的醫(yī)藥組合物，能夠?qū)⑺f的抗生素有效地輸送到動(dòng)物如哺乳動(dòng)物，特別是受到對用這些式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ之親脂寡糖抗生素治療敏感之細(xì)菌感染的人的血清中。
本發(fā)明中使用的α-、β-或γ-環(huán)糊精的2-羥丙基衍生物每分子環(huán)糊精具有2-11個(gè)羥丙基基團(tuán)，且很容易在堿的存在下，以J.Pitha(USP4，727，064;International Journal of Pharmaceutics(1986)，29，73-82)或Muller(USP4，870，060)所述的產(chǎn)生多組份、非晶形混合物的方式，使α-、β-或γ-環(huán)糊精之一與1，2-環(huán)氧丙烷反應(yīng)而制得。除去環(huán)氧丙烷的自身縮合產(chǎn)物，并按照Pitha(USP4，727，064和International J.of Pharmaceutics(1986)29，73-82)或C.T.Ras等人(Pharmaceutical Research(1990)7，(No.6)612-615)所述的方法，用質(zhì)子核磁共振和/或質(zhì)譜法方便地檢測其取代程度，即每分子環(huán)糊精上羥丙基基團(tuán)的數(shù)目?？捎贸Ｒ?guī)方法制備每分子α-、β-和γ-環(huán)糊精具有大約2-15個(gè)，更好大約3-9個(gè)，最好大約5-7.5個(gè)羥丙基基團(tuán)的2-羥丙基-α-、-β-和-γ-環(huán)糊精，但也可從Cyclolab(CHINOIN，Pharmaceutical and Chemical Works，Ltd.，1325Budapest，Hungary的子公司);Walker-Chemie Gmbh，Division L.Biotechnology Prinzregentenstraβe 22D-8000，Munchen 22 West Germany;American Maize，Hammond，Indiana;Pharmatec Inc.P.O.Box730，Alachua FL 32615和Janssen，Biotech N.V.Lammerdries 55，B-2430 Olen Belgium購得該產(chǎn)品。
足以將親脂寡糖抗生素有效地輸送到動(dòng)物特別是人的血清中，而不會(huì)在注射含有符合本發(fā)明的(如下段所述)式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ之親脂寡糖抗生素后引起不良反應(yīng)綜合癥、所用的羥丙基-α-、-β-和-γ-環(huán)糊精量選擇的堿分子至少一個(gè)化學(xué)計(jì)算量及羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精的醫(yī)藥組合物一定的量在下面的段落中給出。
羥丙基-α環(huán)糊精(HP-α-CD)的這一量為每摩爾式Ⅰ的親脂寡糖抗生素有大約5-15摩爾HP-α-CD;HP-β-CD的量是每摩爾式Ⅱ或Ⅲ的親脂寡糖抗生素有大約1-9，更好大約2-6摩爾;HP-γ-CD的量是每摩爾式Ⅰ的親脂寡糖抗生素有大約2-8、更好大約3-5摩爾。由式Ⅲ代表的親脂寡糖抗生素的鹽特別適于與廣泛范圍之羥丙基-α-、-β-和-γ-環(huán)糊精在水中形成完全溶液，其中每分子HP-α-CD或HP-β-CD或HP-γ-CD具有大約2-15個(gè)羥丙基基團(tuán)。如表4中所示，在經(jīng)胃腸道外途徑給小鼠模型注射由1摩爾式Ⅲ的化合物和2摩爾NMG及6摩爾HP-β-CD組成的復(fù)合物后，每分子HP-β-CD含3.9-7.5個(gè)羥丙基基團(tuán)的廣泛的HP-β-CD基本上可防止發(fā)生有害反應(yīng)綜合癥。
表4經(jīng)胃腸道外途徑給小鼠注射(800MPK，每毫升含80mg式Ⅲ化合物)由1摩爾式Ⅲ化合物和2摩爾NMG及6摩爾HP-β-CD組成的具有3.9至7.5個(gè)羥丙基基團(tuán)之復(fù)合物的水溶液后出現(xiàn)的不良反應(yīng)綜合癥1每分子HP-β-CD的羥丙基數(shù)目 %不良反應(yīng)綜合癥無HP-β-CD 907.4 07.5 07.4 07.4 07.2 06.9 06.7 106.3 06.2 05.2 04.5 04.4 04.1 103.9 0
1.在靜脈注射(單一劑量)后2分鐘內(nèi)在小鼠(每組10只，CF-1，平均體重20g，Harlan Sprague Dawley，停食18小時(shí))身上觀察到的不良反應(yīng)綜合癥。
在研制本發(fā)明的組合物的過程中，我們將親脂寡糖抗生素如由式Ⅲ代表的化合物加到至少一個(gè)化學(xué)計(jì)算量如大約2-3摩爾優(yōu)選堿如N-甲基葡糖胺，和足夠量的二甲基亞砜或甘油或脫水山梨醇單-9-十八烯酸酯聚(氧-1，2-乙二基)衍生物如多乙氧基醚或吐溫80，或葡聚糖如商標(biāo)為Dextrans40或70的多糖(在含有主要以α-D(1→6)鍵連接之D-葡萄糖單位骨架的蔗糖底物上培養(yǎng)細(xì)菌而產(chǎn)生的)中來制備這種組合物。Dextran40和70(平均分子量分別為40，000和70，000)是L.mesenteroxides作用于蔗蔗糖底物而產(chǎn)生的多糖;發(fā)現(xiàn)足夠量的二甲基亞砜、甘油、多乙氧基醚80或葡聚糖可將所說的親脂寡糖抗生素有效地轉(zhuǎn)輸?shù)絼?dòng)物血清內(nèi)，同時(shí)可減少或避免有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生(參見表2中所示的結(jié)果)。增加DMSO和甘油的量[達(dá)到10%(重量)]可減少有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生率;足夠量的DMSO和甘油分別為大約5-10%(重量)和大約10%(重量)。增加Dextrans40和70的量也可減少有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生率;Dextran40和Dextran70的足夠量分別為大約2-10%和至少約6%(重量)。吐溫80的量為大約0.1%至1%(重量)時(shí)將增加有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生率，但當(dāng)吐溫80的量大于1%(重量)時(shí)會(huì)減少有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生率，同時(shí)如果這一量大于約2-3%(重量)則幾乎可完全避免有害反應(yīng)癥狀的出現(xiàn)。吐溫80的量大于2-3%(重量)即被認(rèn)為是足夠量的(所有百分比均基于組合物的總重量)。但本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中最好選用羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精(參見上文表2)。
適用于本發(fā)明的堿是可與式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ的親脂寡糖抗生素形成醫(yī)藥上可接受之鹽的堿，且包括適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)和無機(jī)堿。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)堿包括伯、仲和叔烷基胺、鏈烷醇胺、芳香胺、烷基芳香胺及環(huán)胺。有機(jī)胺的例子包括選自氯代普魯卡因、普魯卡因、哌嗪、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、N，N′-二甲基葡糖胺、乙二胺、二乙醇胺、二異丙基胺、二乙胺、N-芐基-2-苯乙胺、N，N′-二芐基乙二胺、膽堿、氯咪唑、三(羥甲基)氨基甲烷或D-葡糖胺的醫(yī)藥上可接受的堿。優(yōu)選的有機(jī)堿包括N-甲基葡糖胺(NMG)、二乙醇胺和三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)。本發(fā)明中特別優(yōu)選的是使用NMG(參見表2和3)。適當(dāng)?shù)臒o機(jī)堿包括堿金屬氫氧化物如氫氧化鈉。發(fā)現(xiàn)用于制備本發(fā)明組合物的無機(jī)堿可產(chǎn)生pH至少為大約9.3的水溶液。賴氨酸形成的水溶液pH小于9.3，故賴氨酸不適于用作本發(fā)明的堿。在pH至少約為9.3的6摩爾HP-β-CD存在下，二價(jià)金屬氫氧化物如堿土金屬氫氧化物、氫氧化鈣和氫氧化鋇并不能形成式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ之親脂寡糖抗生素的水溶液，故不能作為本發(fā)明中使用的堿。
本文中提到用于本發(fā)明的堿時(shí)使用的術(shù)語“至少約一個(gè)化學(xué)計(jì)算量”是指與具有1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)酚羥氫的式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ之親脂寡糖抗生素的酸性酚羥氫(式Ⅲ化合物具有3個(gè)酚羥氫，其中只有兩個(gè)是酸性的)基本上完全反應(yīng)(即導(dǎo)致99%以上發(fā)生完全反應(yīng))所需要的堿量。其中R5＝H的式Ⅰ和Ⅱ化合物中，每分子只有1個(gè)酚的酸性氫，且本發(fā)明之醫(yī)藥上可接受的堿的化學(xué)計(jì)算量為至少大約1到12摩爾的堿。對于其中R5＝
的式Ⅰ和Ⅱ的化合物以及式Ⅲ的化合物(其中每摩爾化合物有2個(gè)酸性酚羥氫)，為與2個(gè)酸性酚氫完全反應(yīng)所需之堿的化學(xué)計(jì)算量至少為2至12摩爾用于本發(fā)明的醫(yī)藥上可接受的堿。對于其中R5＝
，的式Ⅰ和Ⅱ的優(yōu)選親脂寡糖抗生素及式Ⅲ的優(yōu)選親脂寡糖抗生素，可使用約2至6摩爾，較好約2.0至3.5摩爾，更好約2至3摩爾醫(yī)藥上可接受的堿如NMG，以使其水溶液的pH保持在大約9.3(與之相反是有更高pH的溶液，并當(dāng)使用6-12摩爾NMG時(shí)將要對溶液進(jìn)行高度緩沖)。
本文所用的術(shù)語“親脂寡糖抗生素”是指Orthosomycin抗生素家族的選擇的親脂成員，特別是弗來巴霉素、晚霉素、晚霉素型抗生素、居拉霉素及卑霉素A-N抗生素。
弗來巴霉素是由Streptomyces hygroscopicus DS23230產(chǎn)生的親脂寡糖抗生素，其結(jié)構(gòu)式是由W.D.Ollis在Tetrahedron(1979)，35，105-127中描述的結(jié)構(gòu)式Ⅰ，其中R1＝R5＝H，Y＝OH，R2＝COCH(CH3)2，R3＝R6＝R7＝R8＝R9＝CH3，R4＝COCH3，且W＝Z＝Cl。
居拉霉素A是具有式Ⅰ代表之結(jié)構(gòu)式的弗來巴霉素，其中的R1、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、W和Z與弗來巴霉素相同，但R2＝COCH3，Y＝H(參見O.L.Galamarine et al.，Tetrahedron(1961)15，76;V.Deulofer et al.，Anales de Quimica(1972)68，789)。
卑霉素A-N抗生素是由微生物Streptomyces Viridochromogenes NRRL2860之培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗生素復(fù)合物中分離的親脂寡糖抗生素(參見J.L.Mertz et ai.，The Journal of Antibiotics(July1986)Vol.39(No.7)877-887)。由式Ⅰ代表的卑霉素A-N抗生素之結(jié)構(gòu)式中，R1＝R5＝H，Y＝H，R2＝COCH(CH3)2、COCH3、CO(CH2)3CH3、COCH2CH3或H，R3＝CH3，R4＝COCH3、CH(OH)CH3或CHO，R6＝CH3或H，R7＝CH3或H，R8＝CH3、CH2OH或H，R9＝CH3或H，且W＝H或Cl，Z＝Cl。
用于本發(fā)明的晚霉素包括由微生物Micromonospora carbonacea Var.Carbonacea NRRL2972及其變種M.Carbonacea Var.aurantiaca NRRL2997(參見USP3，499，078)產(chǎn)生的抗生素復(fù)合物中分離的晚霉素B、C和D?？砂凑誙SP4，006，225中所述的方法還原晚霉素B、C和D中的硝基部分，得到在晚霉素B、C和D之硝基部分被亞硝基、羥氨基或氨基置換的晚霉素衍生物。優(yōu)選的晚霉素是由式Ⅱ代表的，其中X＝NHCOCH3，Y＝H，R4＝CH(OCH3)(CH3)，R3＝R5＝H且R2＝CH3的N-乙酰氨基晚霉素D。可按USP4，129，720中所述方法制備N-乙酰氨基晚霉素D及其二N-甲基葡糖胺鹽，它公開了還原晚霉素B、C和D的硝基部分以產(chǎn)生氨基衍生物，然后再將其轉(zhuǎn)化為N-酰基如N-乙?；?，N-烷基如NH(C2H5)或N，N-二烷基如NH(C2H5)之衍生物。其中還公開了N-?；?N-羥氨基晚霉素B、C和D衍生物及其醫(yī)藥上可接受之鹽的制備。A.K.Ganguly等人(J.Chem.Soc.，Chem.Comm.1980，56-58)介紹了制備由式Ⅱ代表的、其中X＝OH，Y＝H，R4＝CH(OCH3)(CH3)，R5＝H且R2＝CH3之晚霉素7的方法。
“晚霉素型”抗生素是那些由式Ⅱ代表的并且其中X＝NO2、NO、NH2、OH、NHCOCH3、NHC2H5、N(C2H5)2、NHOH或H，Y＝OH，R2＝CH3或H，R3＝H，R4＝CH(OCH3)(CH3)或H，且R5＝H或
的親脂寡糖抗生素。
其中X＝NO2或NH2，Y＝OH，R2＝R3＝R4＝H，R5＝
的式Ⅱ化合物是由發(fā)酵微生物Micromonospora carbonacea Var.africana NRRL15099ATCC39149所產(chǎn)生的抗生素13-384復(fù)合物中分離的。USP4，597，968和4，735，903中描述的抗生素成分1(式Ⅱ，X＝NO2，Y、R2、R3、R4和R5的定義同上述抗生素13-384)和5(式Ⅱ，X＝NH2，Y、R2、R3、R4和R5的定義同上述抗生素13-384)具有AK Ganguly等人(Heterocycles(1984)28(1)83-88)所述的結(jié)構(gòu)式。USP4，622，314和4，767，748中描述了其中X＝H、NHOH、NHCOCH3的式Ⅱ之晚霉素型抗生素及其?；屯榛苌?。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物包括其中R3＝H，且
的式Ⅱ化合物。
最優(yōu)選的晚霉素抗生素稱為56-脫乙酰基-57-脫甲基-45-O-脫(2-甲基-1-氧代丙基)-12-O-(2，3，6-三脫氧-3-C-甲基-4-O-甲基-3-硝基-α-L-阿拉伯-六碳吡喃糖基)-弗來巴霉素56-(2，4-二羥基-6-甲基苯甲酸酯)，其分子式是C70H97NO38Cl2，分子量為1629，并且是由式Ⅲ代表的。
可通過發(fā)酵Micromonospora Carbonacea Var.africana NRRL15099，ATCC39149或更好是按下述方法制得的其改良菌株得到式Ⅲ的優(yōu)選化合物。
可按照USP4，597，968之實(shí)施例1中所述的方法，利用培養(yǎng)物NRRL15099，ATCC39149的菌株SCC1413制得式Ⅲ的優(yōu)選化合物。在一具體實(shí)施例中，按照該方法首先將2.5ml冷凍的全培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到加在250ml培養(yǎng)瓶內(nèi)的50ml種子菌培養(yǎng)基中。以制備用來發(fā)酵菌株SCC1413的接種物。種子菌培養(yǎng)基由0.3%牛肉膏、0.5%胰酶解胨、0.1%右旋糖、2.4%馬鈴薯淀粉、0.5%酵母浸膏和0.2%碳酸鈣組成。滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)到7.5。30℃下將培養(yǎng)瓶在轉(zhuǎn)動(dòng)搖床上(250r.p.m)保溫48小時(shí)。為了進(jìn)行第二階段發(fā)芽，用5%體積的第一階段發(fā)芽種子接種含500ml同一培養(yǎng)基的2升培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)條件同上所述。在進(jìn)行第二階段發(fā)芽培養(yǎng)的條件下將培養(yǎng)物保溫24小時(shí)，以進(jìn)行第三階段接種物制備，并將其用于所有的攪拌罐發(fā)酵。
在14升NBS實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中進(jìn)行10升最初發(fā)酵，所用發(fā)酵培養(yǎng)基含有0.5%酵母浸膏、0.5%酪蛋白水解物、1% Cerelose、2.0%水溶性淀粉、0.4%碳酸鈣及0.24mg%氯化鈷。滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)到6.7，接種前調(diào)到7.0。然后開始在30℃下，以0.35vvm通氣量和350rpm攪拌速度用第三階段接種物(2.5%)進(jìn)行發(fā)酵。
發(fā)酵過程中，每隔24小時(shí)根據(jù)全培養(yǎng)液抗金黃色葡萄球菌209P(瓊脂的pH為7.0)和大腸桿菌ATCC10536(瓊脂的pH為8.0)的生物檢測結(jié)果監(jiān)測抗生素產(chǎn)生量。同時(shí)間斷或連續(xù)地檢測生產(chǎn)菌的生長(壓積細(xì)胞體積)、pH及溶解氧水平。圖1中舉例說明了典型10升罐發(fā)酵的過程。
我們已使用標(biāo)準(zhǔn)誘變劑從SCC1413，NRRL15099，ATCC39149制得了一種改良菌株，并用以產(chǎn)生了有效高產(chǎn)率的式Ⅲ之優(yōu)選晚霉素型抗生素化合物。在一具體實(shí)施例中，使親代菌株SCC1413，NRRL15099，ATCC39149與足以殺死90%SCC1413，ATCC39149，NRRL15099培養(yǎng)物的誘變劑N-亞硝基胍(NTG)接觸。檢查1500份存活分離物抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的增高的生物學(xué)活性，該分離物表現(xiàn)出高的式Ⅲ抗生素生產(chǎn)能力。用于確定提高之活性的試驗(yàn)方法如下在含有10mlUPS4，597，968實(shí)施例1所述之發(fā)芽培養(yǎng)基的試管內(nèi)，在轉(zhuǎn)動(dòng)搖床上將單個(gè)菌落分離物30℃培養(yǎng)48小時(shí)。將2.5ml種子菌轉(zhuǎn)移到含50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml培養(yǎng)瓶中并在轉(zhuǎn)動(dòng)搖床上以250rpm，30℃保溫96小時(shí)，以進(jìn)行發(fā)酵研究。然后估測其抗金黃色葡萄球菌及大腸桿菌活性，以檢測發(fā)酵后所得抗生素的生產(chǎn)能力，并鑒定改善了所需抗生素之產(chǎn)率的分離菌。表5中給出了本文稱為菌株SCC1631的有代表性的改良菌株。
對該有代表性的改良菌株SCC1631重復(fù)進(jìn)行前述菌株改良處理，使之再次與足以殺死90%培養(yǎng)物量的NTG接觸，然后在含有150μg/ml晚霉素D的瓊脂平皿上選擇分離株。再次估測其抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生物學(xué)活性，以選擇提高了所需抗生素之生產(chǎn)能力的分離株。然后利用一個(gè)這樣的稱為菌株SCC1756的分離株產(chǎn)生式Ⅲ的優(yōu)選抗生素。
另外，對SCC1756進(jìn)行NTG誘變以產(chǎn)生出目前使用的生產(chǎn)菌株SCC2146。
在前述突變處理中，進(jìn)行兩項(xiàng)研究的程序如前所述。為了進(jìn)行后兩項(xiàng)突變研究，用乙酸乙酯提取發(fā)酵液并在使用氯仿∶甲醇(9∶1V/V)溶劑系統(tǒng)的Whatman LKGDF薄層平板上層析分離濃縮物，然后對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行生物自顯影以進(jìn)一步證實(shí)抗生素復(fù)合物中所有組分的產(chǎn)生情況。為了監(jiān)測式Ⅲ化合物的濃度增加，使用Shimadzu CS-930平板掃描儀檢查薄層層析板，并使用HPLC定量分析較高生產(chǎn)能力的提取物。結(jié)合的滴度定義為式Ⅲ化合物(抗生素13-384，USP4，597，968的組份1)與所說組份1之亞硝酸類似物(即抗生素13-384，組份1a)的總和。
早期研究表明，雖然親代菌株SCC1413可在34℃下迅速生長，但如果溫度較低時(shí)可達(dá)到最佳抗生素產(chǎn)生能力。已作為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵最佳化的手段研究了這一現(xiàn)象。溫度研究的結(jié)果表明，當(dāng)在培育24小時(shí)后將溫度從34℃降到30℃時(shí)，可得到最佳生產(chǎn)能力。所有此后在攪拌罐中的工作都是在34℃下將發(fā)酵物保溫24小時(shí)，然后降低溫度到30℃，直到整個(gè)發(fā)酵過程完成。
培養(yǎng)基研究與分離改良的生產(chǎn)菌株結(jié)合進(jìn)行。同時(shí)研究碳和氮源取代以及礦物質(zhì)及其他復(fù)合營養(yǎng)素的加入。在使用菌株SCC1413和SCC1631時(shí)，用肉和魚蛋白胨取代酪蛋白水解物，以及用馬鈴薯糊精(PDP650)取代水溶性淀粉可提高抗生素產(chǎn)生率。在使用菌株SCC1756時(shí)，可在加入玉米浸出漿和氯化鎳(Ⅱ)后觀察到式Ⅲ化合物產(chǎn)率提高。目前最適于發(fā)酵生產(chǎn)式Ⅲ化合物的培養(yǎng)基(4I+1/2Ni)包括2.2%(重量)葡萄糖、4.0%(重量)PDP650糊精、0.5%(重量)酵母浸膏、0.6%(重量)肉蛋白胨、0.5%(體積)玉米浸出漿、2.5×10-6M氯化鎳及0.4%(重量)碳酸鈣。在加碳酸鈣以前將培養(yǎng)基的pH調(diào)到6.7。表6顯示在搖瓶研究(在加有50ml目前生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml培養(yǎng)瓶中，30℃，300rpm培養(yǎng)96小時(shí))中得到的菌株SCC1413、SCC1631、SCC1756和SCC2146之滴度的比較結(jié)果。其中清楚地證明了顯著的濃度改善(為原親本株SCC1413的15倍)。用目前生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)我們的最好生產(chǎn)菌株SCC2146，在100升發(fā)酵中濃度已達(dá)到555-750μg/ml(式Ⅲ化合物與其亞硝基衍生物的總和)(表7)。
表5發(fā)酵中菌株SCC1413和SCC1631在瓊脂板1上顯示抑制帶(mm)的比較試驗(yàn)1菌株 金黃色葡萄球菌,pH7 大腸桿菌pH8SCC 未稀釋 1:20 未稀釋1631 28.7,28.7 22.0 20, 17.51413 28.7,28.7 19.0 12H3, 12H3試驗(yàn)2菌株 金黃色葡萄球菌,pH7 大腸桿菌pH8SCC 未稀釋 1:20 未稀釋1631 28.1,28.8 23.3,23.1 14.8C2,15.0C21413 23.8,23.1 20.5,19.8 12H3,12H31.必要時(shí)用兩塊平板重復(fù)檢測2.澄清帶3.混濁帶表6Micromonospora Carbonacea Var Africana NRRL15099、ATCC39149之SCC1413、1631、1756和2146菌株的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)結(jié)果的比較式Ⅲ化合物及其亞硝基類似物(1A)的滴度(μg/ml)培養(yǎng)物 1(NO2) 1a(NO) 合并的(1+1a)SCC1413 5 3 8SCC1631 14 4 18SCC1756 17 16 33SCC2146 39 85 124表7.SCC2146的100升發(fā)酵式Ⅲ化合物及其NO類似物(1A)的濃度(μg/ml)培養(yǎng)基 1(NO2)11a(NO)2合并的(1+1a)4I 105 315 4204I 135 170 3054I+1/2Ni355 500 5554I+Ni4150 575 7254I+1/2Ni3100 650 7504I+1/2Ni3130 470 600
附注1.式Ⅲ的晚霉素型抗生素2.式Ⅲ抗生素的亞硝基類似物3.鎳濃度(1/2Ni)＝2.5×10-6M4.鎳濃度Ni＝5×10-6M按照USP4，597，968之實(shí)施例1C的方法分離含有式Ⅲ化合物及其亞硝基類似物的親脂寡糖抗生素復(fù)合物。將發(fā)酵液的PH調(diào)到7并用相當(dāng)于發(fā)酵液兩倍體積的乙酸乙酯提取二次。濃縮合并的乙酸乙酯提取物并用HPLC法測定式Ⅲ化合物及其亞硝基類似物的量。使用氧化劑如叔丁基過氧化氫(t-BuO2H)連同溶解于非質(zhì)子傳遞有機(jī)溶劑中的乙酰丙酮氧釩在室溫下將亞硝基類似物轉(zhuǎn)化成式Ⅲ的硝基化合物?？捎肏PLC法監(jiān)測反應(yīng)過程。用三烷基亞磷酸鹽驟冷反應(yīng)混合物，并用標(biāo)準(zhǔn)層析技術(shù)如硅膠柱層析(丙酮/CH2Cl2)和含聚羥基乙烯基聚合物(如得自Toyo Haas，Philadelphia，Pennsylvania的Fractogel(Toyo Pearl))的柱純化粗產(chǎn)物。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物除含有(a)式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的抗生素，(b)能夠使這類抗生素形成醫(yī)藥可接受的鹽的堿，和(c)特定量的例如每分子環(huán)糊精有2-15個(gè)羥丙基基團(tuán)的羥丙基-α-、-β-、或-γ-環(huán)糊精外，還可含有約占重量0-6.0%(基于式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抗生素)的藥用之非離子表面活性劑。優(yōu)選的藥學(xué)上可接受的非離子表面活性劑是脫水山梨醇單-9-十八烯酸酯聚(氧-1，2-乙二基)衍生物，如吐溫80，但其他用于產(chǎn)生醫(yī)藥組合物的非離子表面活性劑在組合物溶于藥用載體內(nèi)后用標(biāo)準(zhǔn)分析技術(shù)如比濁法檢測時(shí)基本上沒有混濁、絮狀物及顆粒物質(zhì)，則也是適用的。本發(fā)明之特別優(yōu)選組合物含有2.85-5.70%(重量)的吐溫80和式Ⅲ的抗生素化合物。
生物學(xué)活性我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明優(yōu)選的含有1摩爾式Ⅲ化合物、2摩爾NMG和6摩爾每分子β-環(huán)糊精有7.4個(gè)羥丙基基團(tuán)的2-羥丙基-β-環(huán)糊精，具有基本上與式Ⅲ化合物本身相同的抗各種細(xì)菌的幾何平均MIC(GMM)，以及基本上同樣的血清蛋白質(zhì)結(jié)合值。預(yù)期本發(fā)明的所有組合物均有相似行為。
在Mueller-Hinton瓊脂中通過常規(guī)瓊脂稀釋方法進(jìn)行體外抗菌活性試驗(yàn)。檢測本發(fā)明的上列優(yōu)選組合物的式Ⅲ化合物對抗各種細(xì)菌如革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的GMM。術(shù)語“敏感性革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌感染”是指廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌感染，如甲氧芐青霉素抗性和甲氧芐青霉素敏感性葡萄球菌，鏈球菌和腸球菌的各種菌株以及某些革蘭氏陰性菌感染，如大腸桿菌、克氏桿菌、沙門氏菌及假單孢菌。式Ⅲ的化合物具有對抗甲氧芐青霉素抗性葡萄球菌(GMM，0.1μg/ml)和甲氧芐青霉素敏感性葡萄球菌(GMM，0.5μg/ml)具有極好的活性(比萬古霉素強(qiáng)10倍)。式Ⅲ的化合物也具有很好的(比萬古霉素強(qiáng)2倍)抗糞腸球菌(GMM，0.49μg/ml)活性，和抗那些對萬古霉素(MIC，≥128μg/ml)的抗性之葡萄球菌和腸球菌各菌株的良好活性(MIC，≤0.5μg/ml)。式Ⅲ的化合物對Borrelia burgdorferi(MIC，≤0.49μg/ml)和Legionella Pneumophila及L.Longbeacheae(MIC，2.5μg/ml)也有好抗菌活性，但對革蘭氏陰性菌(GMM，≥760μg/ml)，Trichomonas Vaginalis(MIC，≥192μg/ml)和Mycoplasma sp，(MIC，200μg/ml)則只有輕度抗菌活性。沒有觀察到與其他抗生素的交叉抗性。
式Ⅲ化合物對各種葡萄球菌的臨床和實(shí)驗(yàn)室菌株具有中度抗菌活性。式Ⅲ化合物對葡萄球菌和腸球菌的殺菌活性與萬古霉素相似。式Ⅲ的化合物在小鼠體內(nèi)(PD50為0.5-25.0mg/ml)對葡萄球菌有良好殺菌活性，與萬古霉素相似(0.7-28.5mg/Kg)。
在靜脈注射給予(30mg/Kg)式Ⅲ化合物和2分子NMG后，可見在大鼠體內(nèi)達(dá)到高血清水平(峰值約90μg/ml)，同時(shí)有長的血清β半壽期。
可望本發(fā)明的醫(yī)藥組合物能對抗上述敏感性細(xì)胞和包括Treponema Pallidum在內(nèi)的螺旋體，包括Clostridium difficile在內(nèi)的厭氧菌，以及Pneumocystis、Toxoplasma、原生動(dòng)物和蠕蟲。
基于式Ⅲ的化合物對抗Borrelia burgdorferi和Legionella pneumophila及L.longbeacheae的活性，我們期望含有式Ⅲ化合物的組合物將在人體模型中表現(xiàn)出抗Lyme病和legionaire氏病的活性。
本發(fā)明提供了治療或預(yù)防動(dòng)物易受革蘭系陽性菌和革蘭氏陰性菌感染的方法，該方法通過給受到這種當(dāng)感染的這些動(dòng)物特別是人服用一定量的本發(fā)明的組分的藥物組合物和其醫(yī)藥可接受的載體。
本發(fā)明的組合物可與任何醫(yī)藥上可接受的載體如無菌水、含水乙醇、植物油、多元醇如聚乙二醇和丙二醇結(jié)合使用，并以各種不同的劑型進(jìn)行口服、胃腸道外或局部給藥。最好使用無菌水作載體。無菌水中可適當(dāng)含有氯化鈉、硝酸鉀、葡萄糖、甘露醇、右旋糖、山梨醇、木糖醇等可藥用物質(zhì)，以及磷酸鹽、乙酸鹽或檸檬酸鹽等緩沖劑和防腐劑。
可將式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ的親脂寡糖抗生素與至少約一個(gè)化學(xué)計(jì)算量的能夠在適當(dāng)溶劑如水中生成其可藥用鹽的堿，以及特定量的每分子環(huán)糊精具有2至15個(gè)羥丙基基團(tuán)的羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精相混合，以制備本發(fā)明的組合物?；旌洗涡虿皇顷P(guān)鍵的，但較好是將特定環(huán)糊精的水溶液與堿混合，或者也可在將堿與親脂寡糖抗生素混合后再加入之。可在15-35℃的溫度下形成水溶液。過濾如此形成的水溶液以得到復(fù)合物的澄清水溶液，可將其蒸發(fā)至干或最好冷凍干燥以形成凍干粉末形式的本發(fā)明組合物，使用時(shí)可加入一定量的醫(yī)藥用載體如水以重新制成水溶液。使用醫(yī)藥上可接受的非離子表面活性劑如吐溫80時(shí)，應(yīng)在過濾并凍干前將其加入水溶液中。另外，也可將水溶液冷凍、融化，然后過濾備用，如用于靜脈注射。作為本發(fā)明的一個(gè)特征，本發(fā)明醫(yī)藥組合物可形成水溶液，并含有少于大約20%(重量)，較好少于10%，更好少于約1.0-5.0%(重量)的羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精。發(fā)現(xiàn)可以使用少于20%(重量)的例如羥丙基-β-環(huán)糊精來制備用于向受到敏感性細(xì)菌，特別是敏感性革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌感染的動(dòng)物血清內(nèi)安全而有效地輸送親脂寡糖抗生素的醫(yī)藥組合物，這一點(diǎn)相對于Bodor的USP4，983，586的指導(dǎo)-其中使用高達(dá)20-50%(重量)的羥丙基-β-環(huán)糊精，來避免凝膠形成或藥物沉淀和Pitha的USP4，727，064的指導(dǎo)-其中使用高達(dá)40-60%(重量)的羥丙基-β-環(huán)糊精用于增溶包括視網(wǎng)膜酸鹽在內(nèi)的各種藥物來說是特別令人驚奇的。
為了口服給藥，可將本發(fā)明的組合物制成片劑、膠囊劑、酏劑等。片劑和膠囊劑可含有淀粉或乳糖等賦形劑;液體制劑可含有著色劑或香味劑。局部用藥的制劑可以是乳油、疏水和親水軟膏，或含水、不含水或乳劑型洗劑及陰道栓劑或粉劑。配制品中使用的典型載體可以是水、油、脂、聚酯及多元醇。經(jīng)胃腸道外給藥的制劑如可注射的藥劑，通常為液體的如溶液劑或懸浮劑，所用的典型載體為蒸餾水及鹽水。最好選用胃腸道外給藥特別是靜脈注射的制劑。
可依據(jù)被治療的動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物如人的體重、年齡及性別，以及感染之病原體對親脂寡糖抗生素的敏感性、感染的階段及嚴(yán)重程度等因素確定特定劑型藥物的給藥劑量。一般說來，式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ之親脂寡糖抗生素的給藥劑量為大約每天每公斤體重1.0-15mg，更好是5mg并分幾次用藥;對于特定劑量則由醫(yī)生確定;最好采用靜脈注射途徑給藥。
在用本發(fā)明的組合物治療某些病人時(shí)，組合物內(nèi)可包括其他活性醫(yī)藥成分。
實(shí)施例1A.基本上按照USP4，597，968之實(shí)施例1B中所述的方法，以上述改良方法進(jìn)行Micromonospora carbonacea var.africana NRRL15099，ATCC39149之菌株SCC2146的100升發(fā)酵，不同的是使用下列生產(chǎn)培養(yǎng)基(4I+1/2Ni)，并且發(fā)酵是在34℃進(jìn)行24小時(shí)，然后在整個(gè)發(fā)酵期間即另外的72小時(shí)將溫度降至30℃(總發(fā)酵時(shí)間96小時(shí))。通氣和攪拌速率分別是0.35vvm和350rpm葡萄糖 2.2%(重量)PDP650糊精 4.0%(重量)酵母浸膏 0.5%(重量)肉蛋白胨 0.6%(重量)
玉米浸漬漿 0.5%(重量)氯化鎳 2.5×10-6M碳酸鈣 0.4%(重量)自來水加至 100mlB.用200L乙酸乙酯將實(shí)施例1A的發(fā)酵液提取兩次。合并乙酸乙酯提取物并濃縮，得到含式Ⅲ化合物和其亞硝基類似物(如用HPLC法測知的)之混合物的濃縮抗生素復(fù)合物。
實(shí)施例2A)向919g按實(shí)施例1所述產(chǎn)生的并含有294g(32%)溶解4.6L乙酸乙酯之3.4摩爾亞硝基類似物對1摩爾式Ⅲ化合物之混合物的抗生素復(fù)合物中加入68.8g NaHCO3和2.98g溶于2，2，4-三甲基戊烷(得自Aldrich(0.06eq))中的乙酰丙酮氧釩(3M);1/2小時(shí)后向如此形成的混合物中加入394ml 3M叔丁基過氧化氫。在0和1、1 1/2 、2 1/2 、3 1/2 及4小時(shí)后向其中各加入1.45g(0.03eq)等份的乙酰丙酮氧釩，以便在4小時(shí)內(nèi)加足0.15eq乙酰丙酮氧釩。將反應(yīng)混合物浸入冰溶中，并向其中加入203ml(0.5eq)三乙基亞磷酸酯[(C2H5O)3P]。用等量的乙酸乙酯稀釋如此形成的反應(yīng)混合物，同時(shí)使反應(yīng)混合物的溫度保持30℃或以下。用水將稀釋的乙酸乙酯反應(yīng)混合物洗兩次。鹽析水層并用乙酸乙酯提取之。通過MgSO4干燥合并的有機(jī)提取物，過濾并濃縮之。將如此得到的殘留物溶解于最小量丙酮中并在7升1∶9(V/V)乙酸乙酯/己烷中沉淀。過濾并用己烷洗殘留物，在真空下干燥并加熱，得到928g含30%(278g)式Ⅲ之硝基化合物的產(chǎn)物。
B)在5Kg硅膠柱上純化實(shí)施例2A的殘留物。依次用含10%、20%、25%、30%、35%(V/V)丙酮的12升CH2Cl2洗脫柱。合并適當(dāng)部分并在≤35℃下濃縮之。將如此生成的殘留物溶解于丙酮中并沉淀到10份10%乙醚/己烷中。過濾并在真空下干燥所得產(chǎn)物(不加熱)。主產(chǎn)物部分含有147.5g式Ⅲ化合物(98.7%純度)。對含有粗產(chǎn)物的其他部分重復(fù)進(jìn)行硅膠層析，直到至得到至少96-98%的純產(chǎn)物。用NMR和MR法檢測其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與式Ⅲ的化合物相符。
實(shí)施例3A在5ml水中制備含有23.97mgN-甲基葡糖胺(NMG)和570.90mg2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HPβCD)(每分子HPβCD有7.4個(gè)羥丙基基團(tuán))的水溶液。
向該溶液內(nèi)加入100mg式Ⅲ的化合物。溫和攪拌后，生成每毫升含20mg式Ⅲ化合物的均質(zhì)復(fù)合物。三種成分的摩爾比例為1摩爾式Ⅲ化合物∶2摩爾NMG∶6摩爾HPβCD。通過0.45μm濾膜過濾如此得到的溶液冷凍干燥后在無水份環(huán)境下儲(chǔ)存。為制備醫(yī)藥組合物，向其加入醫(yī)藥上可接受的載體如水。使用每分子β-環(huán)糊精有3.9至7.5個(gè)羥丙基基團(tuán)的HPβCD可獲得相似的結(jié)果。
可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，即光散射比濁法和質(zhì)子NMR中的線寬度檢測法進(jìn)一步證實(shí)按本實(shí)施例方法制備的均質(zhì)復(fù)合物之澄清水溶液的形成。利用如表1-4中報(bào)導(dǎo)的各種體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮囼?yàn)按本發(fā)明方法制備的均質(zhì)復(fù)合物澄清水溶液之醫(yī)藥組合物的用藥安全性和有效性。
實(shí)施例3B方法基本上與實(shí)施例3A相同，但將1750mg每分子含7.4個(gè)羥丙基基團(tuán)的HPβCD加到含126mg NMG和350mg式Ⅲ化合物的水溶液中。如此形成之均質(zhì)溶液中三種成分的摩爾比例為1摩爾式Ⅲ化合物∶3摩爾NMG∶5摩爾HPβCD。向該溶液中加入500mg顆粒甘露醇(USP級)和10mg Polysorbate-80(吐溫80)NF。吐溫80的重量百分比為式Ⅲ化合物的2.85%。按實(shí)施例3A所述方法過濾如此得到的溶液并凍干。
于無濕環(huán)境下在瓶中保存上述凍干的組合物。為制備靜脈注射給藥的醫(yī)藥組合物，加入20ml無菌水。
實(shí)施例4下列實(shí)施例是使用NMR化學(xué)微滴定技術(shù)檢測式Ⅲ化合物之NMG鹽的2，4-二氫-6-甲基苯環(huán)(非氯代芳環(huán))和3，5-二氯-2-甲氧基-4-羥基-6-甲基苯環(huán)(二氯代芳環(huán))與具每摩爾HPβCD有7.4和3.4個(gè)羥丙基基團(tuán)之2-羥丙基-β-環(huán)糊精及每摩爾HPγCD有4.4個(gè)羥丙基基團(tuán)之2-羥丙基-γ-環(huán)糊精相復(fù)合的平衡常數(shù)。于20℃，使用Varian XL400在400mHz進(jìn)行檢測。
A.制備每毫升D2O含10mg式Ⅲ化合物和3當(dāng)量N-甲基葡糖胺(NMG)的溶液。向該溶液中加入mg等份每分子有7.4個(gè)羥丙基基團(tuán)的HPβCD。檢測隨著所加入之HPβCD的增加式Ⅲ化合物68個(gè)甲基的和式Ⅲ化合物中的54個(gè)亞甲基的質(zhì)子的化學(xué)位移的變化。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)計(jì)算50%復(fù)合時(shí)的平衡常數(shù)。還檢測了兩芳環(huán)上達(dá)到90%復(fù)合或結(jié)合所需的HPβCD的摩爾數(shù)。在兩芳環(huán)部位達(dá)到90%復(fù)合所需之HPβCD的摩爾數(shù)為6.6;達(dá)到50%復(fù)合需2摩爾HPβCD。下列表8中給出了測得的平衡常數(shù)。
B.方法基本與實(shí)施例4A相同，不同的是使用每摩爾HPβCD有3.4個(gè)羥丙基基團(tuán)的HPβCD。結(jié)果如下列表8所示。在兩芳環(huán)部位達(dá)到90%復(fù)合所需之HPβCD的摩爾數(shù)為6.6。
C.方法基本與實(shí)施例4A相同，但不同的是使用每摩爾HPγCD4.4個(gè)羥丙基基團(tuán)的HPγCD。在兩芳環(huán)部位達(dá)到90%復(fù)合所需的HPγCD的摩爾數(shù)為4.0;達(dá)到50%復(fù)合需要1.4摩爾。結(jié)果如下列表8所示。
表81摩爾化合物Ⅲ3摩爾NMG與HPβCD和HPγCD相復(fù)合的平衡常數(shù)(升/摩爾)化合物Ⅲ中 HPβCD HPβCD HPγCD的復(fù)合部位 n1=7.4 n1=3.4 n2=4.4非氯化芳環(huán)3183±5 188±5 355±93二氯代芳環(huán)4953±18 983±34 315±281.n＝每分子HPβCD上的平均羥丙基基團(tuán)數(shù)2.n＝每分子HPγCD上的平均羥丙基基團(tuán)數(shù)3.Ⅲ中的非氯代芳環(huán)＝
4.Ⅲ中的二氯代芳環(huán)＝
使用NMR化學(xué)微滴定技術(shù)，檢測為達(dá)到90%復(fù)合時(shí)復(fù)合1摩爾式Ⅲ抗生素之3∶1NMG鹽所需要的每分子有7.4個(gè)羥丙基基團(tuán)之HPβCD的量為6.6摩爾(復(fù)合發(fā)生在式Ⅲ中的兩個(gè)芳環(huán)基團(tuán)上)，而在式Ⅲ的兩芳環(huán)上達(dá)到50%復(fù)合則需要2摩爾。
權(quán)利要求
1.包括下列組份的組合物(a)由式Ⅰ代表的親脂寡糖抗生素
其中
X=NO2、NO、NH2、NHCOCH3、NHOH、NH(C2H5)、N(C2H5)2OH或H；R2=CH3、COCH(CH3)2、COCH3、CO(CH2)3CH3、COCH2CH3或H；R3=CH3或H；R4=COCH3、CH(OCH3)(CH3)、CH(OH)CH3、CHO或H；
R6=CH3或H；R7=CH3或H；R8=CH3、CH2OH或HR9=CH3或H；Y=OH、H或CH3；W=Cl或H；且Z=Cl或H；(b)至少一個(gè)化學(xué)計(jì)算量的能夠與式Ⅰ的親脂寡糖抗生素形成醫(yī)藥上可接受之鹽的堿；(c)一定量的二甲基亞砜、甘油、脫水山梨糖醇單-9-十八烯酸酯聚(氧-1，2-乙二基)衍生物、葡聚糖、羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精，其中所說的α-、β-和γ-環(huán)糊精上羥丙基取代基的平均數(shù)為大約2至15個(gè)，且所說的量足以將所說的親脂寡糖抗生素有效地輸送到動(dòng)物的血清內(nèi)，同時(shí)避免有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生；以及(d)0-6%(基于式Ⅰ抗生素的重量)的醫(yī)藥上可接受的非離子表面活性劑。
2.包括下列組分的組合物(a)由式Ⅱ代表的化合物
其中X＝NO2、NO、NHOH、NH2、NHCOCH3、NH(C2H5)、N(C2H5)2、OH或H;Y＝OH、H或CH3;R2＝H或CH3、R3＝H;R4＝H或CH(OCH3)(CH3)，且R5＝H或
;(b)至少一個(gè)化學(xué)計(jì)算量的能與式Ⅱ化合物形成醫(yī)藥上可接受之鹽的堿;(c)一定量的羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精，其中所說的α-、β-和γ-環(huán)糊精上的羥丙基取代基的平均數(shù)目為大約2至大約15個(gè)，且所說的量足以將所說的親脂寡糖抗生素有效地輸送到動(dòng)物的血清中，同時(shí)避免有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生;以及(d)0至6%(基于式Ⅱ化合物的重量)的醫(yī)藥上可接受的非離子表面活性劑。
3.包括下列組份的組合物(a)由式Ⅲ代表的化合物
(b)至少2當(dāng)量(每摩爾式Ⅲ化合物)能夠與式Ⅲ化合物生成醫(yī)藥上可接受之鹽的堿;(c)一定量的羥丙基-α-、-β-或-γ-環(huán)糊精，每摩爾所說的α-、β-和γ-環(huán)糊精有大約2至大約15個(gè)羥丙基基團(tuán)，且所說的量足以將所說的親脂寡糖抗生素有效地輸送到動(dòng)物血清內(nèi)，同時(shí)可避免有害反應(yīng)癥狀的發(fā)生;以及(d)占式Ⅲ化合物重量0-6%的醫(yī)藥上可接受的非離子型表面活性劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中由式Ⅰ代表的親脂寡糖抗生素選自弗來巴霉素、晚霉素、晚霉素型抗生素，居拉霉素以及卑霉素A-N抗生素。
5.治療敏感性革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌感染的醫(yī)藥組合物，其包括抗感染有效量的權(quán)利要求1、2或3的組合物以及其醫(yī)藥上可接受的載體。
6.治療動(dòng)物的敏感性革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌感染的方法，其包括給所說的動(dòng)物使用治療有效量的權(quán)利要求5的醫(yī)藥組合物。
7.防止在經(jīng)胃腸道外途徑給動(dòng)物使用權(quán)利要求Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ的親脂寡糖抗生素后發(fā)生有害反應(yīng)癥狀，同時(shí)能將抗感染有效量的所說的抗生素輸送給所說動(dòng)物的方法，該方法包括經(jīng)胃腸道外途徑給所說的動(dòng)物使用抗感染有效量的權(quán)利要求1、2或3的組合物連同其醫(yī)藥上可接受的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的組合物，其中堿選自氯代普魯卡因、普魯卡因、哌嗪、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、N，N-二甲基葡糖胺、乙二胺、二乙醇胺、二異丙胺、二乙胺、N-芐基-2-苯基乙胺、N，N-二芐基乙二胺、膽堿、氯咪唑、三(羥甲基)氨基甲烷、D-葡糖胺或氫氧化鈉。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的組合物，其中堿是N-甲基葡糖胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的組合物，其中使用羥丙基-β-環(huán)糊精。
11.根據(jù)權(quán)利要求5的醫(yī)藥組合物，其(a)∶(b)∶(c)的摩爾比是1∶2-3∶1-6。
12.權(quán)利要求1、2或3的組合物在制造用于治療或預(yù)防動(dòng)物的革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌感染之藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本文公開了包括親脂寡糖抗生素如式III的晚霉素型抗生素、至少一個(gè)化學(xué)計(jì)算量的堿如NMG、一定量的例如羥丙基-β-環(huán)糊精，還可包括醫(yī)藥用非離子型表面活性劑如吐溫80的醫(yī)藥上可接受的組合物，含有這種組合物的醫(yī)藥組合物，治療或預(yù)防動(dòng)物特別是人之敏感性細(xì)菌感染的方法，防止發(fā)生有害反應(yīng)癥狀，同時(shí)能給所說的動(dòng)物有效地輸送抗感染量的親脂寡糖抗生素如式III抗生素的方法，以及這些組合物在制備用于上述治療或預(yù)防目的之藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/00GK1073359SQ92112388
公開日1993年6月23日 申請日期1992年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1991年10月16日
發(fā)明者M·帕特爾, V·P·古洛, R·赫爾, D·洛本堡, J·B·摩頓, G·H·米勒, H·Y·鄺 申請人:先靈公司