專(zhuān)利名稱(chēng)：地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造含有抗原或抗體的醫(yī)藥制品的方法，特別是涉及制造含地衣芽孢桿菌抗原的醫(yī)藥制品的方法。
本發(fā)明的方法中涉及的桿菌為地衣芽孢桿菌(BacillusLicheniformis)。
有關(guān)活菌制劑以及生態(tài)防治的應(yīng)用已有近百年的歷史，并在本世紀(jì)50年代后有了較快的發(fā)展，各種生菌制劑不斷問(wèn)世，如單價(jià)或多價(jià)的口服與注射的制劑，皆收到較好的防治效果。但在國(guó)外這類(lèi)制劑多為雙岐桿菌和乳酸菌類(lèi)，制成單價(jià)的或多聯(lián)的;1981年國(guó)內(nèi)康白教授以臘樣芽孢桿菌制成了活菌制劑“促菌生”。但在國(guó)內(nèi)仍無(wú)地衣芽孢桿菌的生態(tài)制劑。在國(guó)外，對(duì)地衣芽孢桿菌的研究、文獻(xiàn)也很少，并且只限于生物酶類(lèi)(如淀粉酶)、抗生素以及畜牧方面(如家畜育肥、乳牛產(chǎn)奶等)。根據(jù)已知現(xiàn)有技術(shù)中，地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)先例。
本發(fā)明的目的在于提供一種制造含地衣芽孢桿菌63516株的生態(tài)制劑的方法。為完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明涉及用于臨床治療急慢性腹瀉和腸道菌群失調(diào)癥的地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于使用分離正常待產(chǎn)婦女陰道拭子的地衣芽孢桿菌63516株(保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)No.0183)，作為菌種，經(jīng)在肉湯培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)制成種子液;對(duì)種子液在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌苔液;并在菌苔液中加入無(wú)水碳酸鈣脫水干燥制成原菌粉;然后再在原菌粉中加入藥用乳糖和藥用淀粉稀釋?zhuān)心ズ笾瞥擅靠撕?0億±1億活菌的成品粉。
用本發(fā)明的方法制造的生態(tài)制劑是用地衣芽孢桿菌63516株培育后的菌苔加無(wú)水碳酸鈣脫水干燥、并用乳糖和淀粉稀釋成的每克含10億±1億活菌的制劑。
所述的地衣芽孢桿菌菌種已于1992年11月19日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為0183。
地衣芽孢桿菌63516株是用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂分離于正常待產(chǎn)婦女的陰道拭子的。七年來(lái)經(jīng)過(guò)大量的基礎(chǔ)與臨床研究證明，該菌株是一種安全、無(wú)毒、有效的新菌種。該菌株(及其生態(tài)制劑)對(duì)大腸內(nèi)的大腸桿菌和嗜酸乳桿菌相互呈共生作用，對(duì)葡萄球菌和白色含珠菌有明顯拮抗作用，對(duì)腸道內(nèi)生理性厭氧菌通過(guò)生物耗氧作用有明顯的促生長(zhǎng)效應(yīng)。因此該菌株調(diào)整腸道菌群或生態(tài)防治的作用機(jī)制是雙重雙向效應(yīng)，可用于急慢性腸炎和腸道菌群失調(diào)癥的治療。并且該菌株基本無(wú)毒性，故在臨床應(yīng)用時(shí)可酌情增減該制劑的用量，以得到較好的防治效果。
地衣芽孢桿菌63516株在培養(yǎng)基(pH值為6.0-7.8的普通營(yíng)養(yǎng)肉湯以及pH值為6.0-7.8的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂)培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)具有典型的形態(tài)、染色特征、菌落特征、以及生化反應(yīng)譜;在血清定量凝集試驗(yàn)中，該菌株的凝集價(jià)不應(yīng)低于原血清的原效價(jià)的1/2-1/4。在進(jìn)行這種血清定量凝集試驗(yàn)時(shí)，以磷酸沖鹽水洗脫經(jīng)16-24小時(shí)在37℃溫度下培養(yǎng)的固定培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物每毫升含菌4-8億，將其與地衣芽孢桿菌特異診斷血清混合，混合后在溫度為37℃的情況下過(guò)夜，以肉眼觀察到凝集(+)的血清的最高稀釋度即為凝集反應(yīng)的凝集效價(jià)。該菌株是在2-8℃下凍干保存的。
下面詳細(xì)描述利用地衣芽孢桿菌63516株制造本發(fā)明的地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑的方法。按照本發(fā)明的制造方法，依次包括如下步驟(a)制種子液首先，對(duì)菌種進(jìn)行檢查。凍干菌種啟開(kāi)后，應(yīng)檢查菌體染色形態(tài)、純度，并進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，合格方可使用。凍干菌種啟開(kāi)后，傳代不得超過(guò)5代。
然后，將pH值為6.0-7.8，優(yōu)選為7.2-7.4的營(yíng)養(yǎng)肉湯作為培養(yǎng)基，分裝試管，每支20毫升。
接著，用白金耳從瓊脂平板取該菌株的典型菌落，接種于種子液肉湯管，并在34-37.5℃，優(yōu)選為37℃溫度下培育15-24小時(shí)，優(yōu)選為18-24小時(shí)。
為了進(jìn)行純菌試驗(yàn)，可以用白金耳從培育的種子液中取樣并接種于二枚瓊脂平板上，分別在34-37.5℃和25℃溫度下培育24-48小時(shí)，應(yīng)無(wú)雜菌生長(zhǎng)。如有，則廢棄。
(b)擴(kuò)大培養(yǎng)首先，將pH值為6.0-7.8，優(yōu)選為7.2-7.4的營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，分裝在克氏瓶?jī)?nèi)，每支裝250毫升培養(yǎng)基;
然后，將一管種子液傾注到克氏瓶?jī)?nèi)進(jìn)行接種，使種子液布滿瓊脂表面，并在35-38℃，優(yōu)選為37℃溫度下培育48小時(shí);
接著著手收集菌苔液。為此，在每只克氏瓶?jī)?nèi)加入50毫升生理鹽水以便洗脫瓶中的菌苔。將每10瓶的洗脫液收集在一個(gè)稱(chēng)重的500毫升離心瓶?jī)?nèi)。以3000-5000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選為4500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速使離心瓶離心40分鐘。而后除棄上清液，并稱(chēng)量所剩菌泥的重量。
在將克氏瓶?jī)?nèi)的菌苔液合并前，也須再進(jìn)行一次純菌試驗(yàn)。即取一白金耳洗脫的菌液，將其接種于二枚瓊脂平板，并在37℃和25℃下培育24-48小時(shí)。如生長(zhǎng)雜菌，則應(yīng)廢棄。
(c)制原菌粉在按步驟(b)得到的菌泥中加入50毫升生理鹽水，使菌泥溶解。將溶解的菌泥倒入無(wú)菌的研缽內(nèi)。按菌泥與無(wú)水碳酸鈣的重量比為1∶8，優(yōu)選為1∶5，在研缽內(nèi)加入無(wú)水碳酸鈣，使菌泥和碳酸鈣充分研混，并放入65-75℃，優(yōu)選為65℃的烤箱內(nèi)烘烤30分鐘，間歇30分鐘，重復(fù)三次使之干燥成菌泥塊。
然后，將烘干的菌泥塊放入球磨機(jī)內(nèi)研磨1小時(shí)使之成粉，并可以將磨過(guò)的菌粉過(guò)篩，例如用80目篩。
最后，要對(duì)制成的原菌粉進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)量。為此，從篩過(guò)后的原菌粉上隨意選取5個(gè)點(diǎn)位，并在每一個(gè)點(diǎn)位上取原菌粉樣0.5克，并對(duì)它們用肉湯進(jìn)行10-10-10-10的稀釋。充分混合后，從每個(gè)稀釋管取0.1毫升稀釋后的原菌粉，并將它們接種于瓊脂平板，再用L棒涂勻，然后再在34-37.5℃，優(yōu)選為37℃下培育18-24小時(shí)。從生長(zhǎng)的菌落數(shù)在30-200個(gè)之間的瓊脂平板的實(shí)際菌落數(shù)，算出每克原菌粉的實(shí)際活菌數(shù)。即每克活菌數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×20。
(d)制成品菌粉首先將藥用淀粉在12.5磅壓力下高壓滅菌15分鐘，用作稀釋劑;
然后，將藥用乳糖在150℃溫度下干熱滅菌50分鐘，用作保護(hù)劑;
按原菌粉活菌數(shù)和每克需含的活菌數(shù)(10億/克)加入乳糖和淀粉，其中乳糖10%，淀粉90%，并將它們放入球磨機(jī)研混1小時(shí)。
按步驟(c)中相同的方法測(cè)活菌數(shù)，每克活菌數(shù)應(yīng)為(10±1)億。
最后，將成品菌粉制成可服用的形式，例如裝入每粒0.25克±0.025克成品菌粉的膠囊內(nèi)。
對(duì)于按上述步驟制成的本發(fā)明的地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑應(yīng)進(jìn)行如下的檢驗(yàn)1.理化檢查成品菌粉應(yīng)為白色、無(wú)異味、無(wú)粗大顆粒;
2.菌形及純度檢查取成品菌粉1克，溶于5毫升肉湯內(nèi)，充分混勻，并靜置5分鐘。用白金耳取其上清液涂片，進(jìn)行G染色鏡檢，應(yīng)為G+大捍菌。至少應(yīng)觀察10個(gè)視野，不應(yīng)有雜菌，芽孢形成率應(yīng)為50%-80%。
3.活菌數(shù)測(cè)定按前述的步驟(c)中測(cè)活菌數(shù)的方法測(cè)量活菌數(shù)。對(duì)于每粒0.25克±0.025克的膠囊，其活菌數(shù)應(yīng)為(2.5±0.25)億。
4.雜菌總數(shù)檢查例如取成品膠囊4粒(1.0克)，溶于含5毫升肉湯的管內(nèi)，充分混勻后靜置5分鐘。用無(wú)菌吸管取出1毫升上清液，再加入2毫升的抗血清(凝集效價(jià)為1∶(3000-8000)搖勻。經(jīng)37℃水浴15分鐘后再以500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。然后，取出0.3毫升上清液，并將其分別滴在營(yíng)養(yǎng)瓊脂板，每枚0.1毫升，并用L棒涂勻，再置入37℃溫箱中開(kāi)蓋烤30分鐘、合蓋培育24小時(shí)。對(duì)雜菌菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(不含真菌)，算出雜菌總數(shù)。每克含雜菌總數(shù)應(yīng)少于1000個(gè)。
5.大腸桿菌檢查取成品菌粉1克，溶于1毫升肉湯內(nèi)，并將肉湯管搖混勻，然后取出0.5毫升。用5枚EMB瓊脂平板，每枚平板種0.1毫升，再用L棒涂勻，置于37℃溫箱中開(kāi)蓋烘15分鐘，合蓋培育24小時(shí)，不應(yīng)生長(zhǎng)大腸桿菌。
6.真菌檢查和大腸桿菌檢查進(jìn)行同樣的稀釋后，取菌液0.5毫升，接種5枚含青鏈霉素沙保弱氏培養(yǎng)基(斜面)平板上，每枚平板0.1毫升，在25℃溫度下培育7天，不應(yīng)生長(zhǎng)真菌。
7.小鼠安全試驗(yàn)用含40%成品菌粉的生理鹽水，給5只18-20克重的小鼠灌胃，每只小鼠灌入0.5毫升，觀察5天，應(yīng)無(wú)不良反應(yīng)。
8.生物耗氧試驗(yàn)(平板生物厭氧培養(yǎng)法)將地衣芽孢桿菌肉湯12小時(shí)培養(yǎng)物0.1毫升，滴于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(蓋或底)，用L棒涂勻并在37℃溫度下培育3小時(shí);
再用白金耳對(duì)擬桿菌的48-72小時(shí)液體培養(yǎng)物取樣，接種于含擬桿菌選擇性固體培養(yǎng)物(BD)的平板(蓋或底);
將二者合攏，用透明膠布密封兩個(gè)平板的間隙，在37℃溫度下培育72小時(shí)，則應(yīng)有擬桿菌生長(zhǎng)。如用不接種地衣芽孢桿菌平板作對(duì)照，則擬桿菌不生長(zhǎng)。
本發(fā)明的地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑對(duì)某些重要的致病菌、條件致病菌有明顯的拮抗作用，能調(diào)整腸道內(nèi)的菌群，無(wú)毒、無(wú)不良反應(yīng)，使用安全。經(jīng)在北京協(xié)和醫(yī)院、北京軍區(qū)總醫(yī)院、及酒仙橋醫(yī)院進(jìn)行了Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，并和服用氟哌酸的療效進(jìn)行了對(duì)比如下北京協(xié)和醫(yī)院臨床觀察方案在腸道門(mén)診治療急性腹瀉139例，其中治療組(本發(fā)明制劑)83例，對(duì)照組(氟哌酸)36例，失訪20例?，F(xiàn)將符合評(píng)價(jià)的病例情況總結(jié)如下
一、各組性別例數(shù)、平均年齡和病程本發(fā)明制劑(83)氟哌酸組(36)輕型(39)重型(44)輕型(39)重型(44)性別男(52)182266女(67)21221311平均年齡36.6±11.836.2±14.639.1±16.339.8±13.2病程(天)4.8±6.61.9±2.04.2±6.71.8±1.1二.各組療效情況顯效有效無(wú)效加重輕本發(fā)明制劑(39)24(82)13(33)2(5)型氟哌酸(19)11(68)8(42)重本發(fā)明制劑(44)23(5)14(32)7(16)型氟哌酸(17)9(63)7(41)1(6)治療組(83)47(67)27(33)9(11)對(duì)照組(36)20(56)15(42)1(3)臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明制劑對(duì)急性腸炎和輕型痢疾有較好的療效，其作用與氟哌酸相同，并具有治療腸菌群失調(diào)的作用，且無(wú)毒、無(wú)不良反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種用于臨床治療急慢性腹瀉和腸道菌群失調(diào)癥的地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于使用分離正常待產(chǎn)婦女陰道拭子的地衣芽孢桿菌63516株(保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)No.0183)，作為菌種，經(jīng)在肉湯培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)制成種子液；對(duì)種子液在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌苔液；并在菌苔液中加入無(wú)水碳酸鈣脫水干燥制成原菌粉；然后再在原菌粉中加入藥用乳糖和藥用淀粉稀釋?zhuān)心ズ笾瞥擅靠撕?0億±1億活菌的成品粉。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在制種子液時(shí)使用pH值為6.0-7.8的營(yíng)養(yǎng)肉湯作為培養(yǎng)基，在37℃溫度下對(duì)菌種培育15-24小時(shí)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在制種子液時(shí)使用pH值為6.0-7.8的營(yíng)養(yǎng)肉湯作為培養(yǎng)基，在37℃溫度下對(duì)菌種培育18-24小時(shí)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)使用pH值為6.0-7.8的營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，在35-38℃溫度下對(duì)種子液培育48小時(shí)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于使用pH值為6.0-7.8的營(yíng)養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基，在37℃溫度下對(duì)種子液培育48小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1至5之一所述的方法，其特征在于在制原菌粉時(shí)菌泥與無(wú)水碳酸鈣的重量比為1∶8，并在65-75℃的烤箱中烘烤30分鐘、間歇30分鐘，如此重復(fù)三次使之干燥。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于其中所說(shuō)的烘烤溫度為65℃。
8.如權(quán)利要求1至5之一所述的方法，其特征在于在制成品粉時(shí)加入的乳糖為10%，淀粉為90%。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在制成品粉時(shí)加入的乳糖為10%，淀粉為90%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種地衣芽孢桿菌生態(tài)制劑的制備方法，其中采用地衣芽孢桿菌63516株培育后的菌苔加無(wú)水碳酸鈣脫水干燥，并用乳糖和淀粉稀釋成的每克含10億±1億活菌的制劑，在臨床上可用于治療急性腹瀉和菌落失調(diào)癥。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1087523SQ92113318
公開(kāi)日1994年6月8日 申請(qǐng)日期1992年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月30日
發(fā)明者吳鐵林 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二○三醫(yī)院