專利名稱：人胎胸腺素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的人胎胸腺素的制備方法。
人胎胸腺素(Human Embryo Thtmosin縮寫為HFT以上同)是人胎胸腺中提取的生物活性制劑，具有內(nèi)含胸腺素、胸腺生長素、胸腺體液因子、胸腺因子等多種免疫活性物質(zhì)，對調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤抗體的產(chǎn)生及抗衰老方面起著重要的作用，在臨床上可廣泛應(yīng)用于治療腫瘤、感染、支氣管哮喘、肝臟疾患，自身免疫性疾病、口腔粘膜疾病等都具有較好的療效。據(jù)蘇聯(lián)學(xué)者把100個癌細(xì)胞接種到無胸腺小鼠體內(nèi)，此鼠患癌癥死亡，而把1000萬個癌細(xì)胞接種到有胸腺小鼠體內(nèi)，該鼠不患癌癥，說明胸腺可使用機(jī)體抗癌能力增加萬倍，國內(nèi)有人把胎鼠胸腺移植到進(jìn)入老年期的18個月齡的無生育能力的小鼠體內(nèi)，結(jié)果已喪失生育能力的雄鼠和雌鼠都恢復(fù)了生育能力，直到24個月，說明胸腺移植能使青春期延長一倍，而研究表明，胸腺以上功能主要是通過胸腺素來完成的，因此，目前各國醫(yī)學(xué)專家為了尋找抗癌、抗病、抗衰老、提高對病毒性肝炎、空洞性肺結(jié)構(gòu)等病的治愈率的方法，都在胸腺素的制備方法及產(chǎn)品的生化性質(zhì)和生物活性方面進(jìn)行系統(tǒng)的研究。
本發(fā)明的目的就是集多年研究的成果，提供一種利用人胎胸腺組織來生產(chǎn)胸腺素的人胎胸腺素的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣來實(shí)現(xiàn)的，用胎齡5-8個月的合法水囊引產(chǎn)的胎兒，無菌解剖出胸腺組織，用細(xì)胞分離器制成生理鹽水-胸腺細(xì)胞懸液，或用高速勻漿機(jī)勻漿、凍融、加熱、離心除去大分子蛋白質(zhì)，得上清液后，再經(jīng)一系列的精制過程和PH調(diào)整，除菌過濾，灌封亦可。
本發(fā)明方法簡單，成本低，療效好，易于推廣應(yīng)用，造福于人類。
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
以胎齡5-8月的合法水囊引產(chǎn)胎兒為例，其制備方法詳述如下一、人員及環(huán)境設(shè)備條件要求1)人員要求參與本項(xiàng)工作人員，必須身體健康，無傳染病，并定期進(jìn)行體格檢查，主要負(fù)責(zé)制備和質(zhì)量檢定人員必須是具有制備細(xì)胞勻漿，裂解組織細(xì)胞和進(jìn)行相應(yīng)動物試驗(yàn)和免疫學(xué)試驗(yàn)的技術(shù)人員。其它人員必須經(jīng)嚴(yán)格無菌操作訓(xùn)練，并掌握本項(xiàng)工作的基本知識和操作技術(shù)，所有人員應(yīng)相對穩(wěn)定或固定。
2)無菌室要求無菌室應(yīng)按衛(wèi)生部生物制品要求建立GMP(優(yōu)良藥品制備標(biāo)準(zhǔn))標(biāo)準(zhǔn)的百級生物凈化工作間。若是普通無菌室應(yīng)有一定的面積，高度(2.4米)。室內(nèi)安裝紫外光燈，并有層流郊化臺。制備室至少每月用乳酸加熱生成蒸氣進(jìn)行空氣消毒一次。地面和工作臺面經(jīng)常用1‰的新潔爾滅或2%的來蘇液擦試，玻璃用70%的酒精擦試。每次使用前應(yīng)開紫外線燈30分鐘。無菌室內(nèi)定期做細(xì)菌培養(yǎng)，并記錄結(jié)果。無菌室內(nèi)各種用具應(yīng)相對固定或?qū)Ｓ谩?br> 3)設(shè)備及各項(xiàng)材料的要求一切與制品接觸的用具和器皿均應(yīng)用無菌，無熱原的雙蒸水沖洗，用前均應(yīng)以適宜的方法，進(jìn)行消毒及除熱原處理。所用所有試劑均應(yīng)符合中華人民共和國藥典或化學(xué)純的要求，并用不含熱原的餾水配制。
二、制備工藝(方法)
1)取材料本發(fā)明用的胎兒為母體健康，無傳染性疾病，胎兒發(fā)育正常，無畸形，胎齡5-8個月的合法水囊引產(chǎn)胎兒，從胎兒娩出到送至制備場所不多于8小時，并且無菌低溫(室溫以下)運(yùn)送。立即無菌解剖胸腺，-20℃保存不得超過3個月。收集前胸腺細(xì)胞活度應(yīng)在90%以上，除去包膜，脂肪和結(jié)締組織，沖去血跡。稱重;2)制懸液用細(xì)胞分離器將處理好的胸腺組織進(jìn)行均漿至鏡檢無完整細(xì)胞，制成生理鹽水-胸腺細(xì)胞懸液，使其濃度為0.9%的生理鹽水中含胸腺組織為克組織/15ml，即每15毫升內(nèi)含胸腺組織1克;3)快速凍融上述細(xì)胞懸液在溫度為-25℃的條件下，快速結(jié)冰，之后，再在溫度為30℃條件下快速融化，反復(fù)進(jìn)行三次(即快速凍融三次);4)制備上清液凍融后的懸液用4000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)進(jìn)行沉淀處理，取得上清液;5)除雜蛋白把上述上清液在80℃的溫度下水浴一小時，除去雜蛋白;6)制一清液去除雜蛋白后，用4000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)再進(jìn)行沉淀處理得一清液;7)去病毒把一清液用其濃度為1.83%的鹽酸調(diào)到PH值為4，放置4-12小時，除去病毒;8)制二清液把去除病毒的一清液，再用離心機(jī)澄清，制得二清液，把二清液用濃度為5%的NaHCO3(碳酸氫鈉)調(diào)至PH值為7.0;9)超微抽濾用超微濾膜(濾孔在2.2μ以下)正壓除菌抽濾;10)檢定除菌抽濾后，經(jīng)無菌、熱原及過敏檢查合格后灌封分裝安瓶，或制成凍干粉劑型備用。
成品檢定標(biāo)準(zhǔn)及辦法如下三、質(zhì)量要求及檢定1)性狀本發(fā)明的成品應(yīng)外觀無色透明，無異物或搖不散的沉淀物。
2)無菌試驗(yàn)按生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程執(zhí)行，細(xì)菌及霉菌培養(yǎng)結(jié)果都必須是陰性。HBSAg檢測用敏性為3ng/ml以下的試劑檢測應(yīng)為陰性。
3)熱原試驗(yàn)按中華人民共和藥典關(guān)于《生物制品熱原試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，注射劑量按家兔體重3ml/kg。判斷標(biāo)準(zhǔn)按靜脈注射規(guī)定判定。
4)安全試驗(yàn)豚鼠試驗(yàn)，取體重300-400g豚鼠2只，每只腹腔注射待體檢品5ml觀察7天，動物健在，體重增加者為合格。如不符合上述要求，應(yīng)用4只豚鼠復(fù)試一次，判定標(biāo)準(zhǔn)同前。
小白鼠試驗(yàn)，取體重18-20g小白鼠5只，每只從尾靜脈或腹腔注射待檢品0.5ml。半小時內(nèi)動物不應(yīng)有異常反應(yīng)。繼續(xù)觀察7天，動物健存為合格。不合格可用10只小白鼠復(fù)試，制定標(biāo)準(zhǔn)同前。
5)化學(xué)檢定①PH值應(yīng)為7.0;
②紫外光吸收度在250-260nm處有高吸收峰;
③蛋白質(zhì)反應(yīng)20%磺基水楊酸等量混合，本品反應(yīng)應(yīng)為陰性或微混濁;
④多肽及蛋白含量按中華人民共和國藥典1985年版二部附錄42半微量定氮法，0.07g%即0.7mg/ml(不低于0.5mg/ml)。
⑤氨基酸測定HCL110℃22小時氨基酸含量為0.02g/100ml。
6)生物活性測定①E-玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)按全量法活性花環(huán)形成試驗(yàn)進(jìn)行(血液病實(shí)驗(yàn)診斷，天津科學(xué)技術(shù)出版社，1985，409)。常規(guī)固定染色，鏡下檢200個淋巴細(xì)胞，每一淋巴細(xì)胞結(jié)合3個或3個以上紅細(xì)胞者為一個E-玫瑰花結(jié)。E-玫瑰花結(jié)形成率比空白對照提高40%(不低于20%)為合格。
②外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)按楊貴貞(醫(yī)學(xué)免疫學(xué)吉林人民出版社1980，380)形態(tài)學(xué)方法，用美國產(chǎn)1640和天津產(chǎn)小牛血清配制的培養(yǎng)基5ml加肝素抗凝全血0.3ml，實(shí)驗(yàn)組加入胎腺素30mg或60mg，37℃培養(yǎng)72小時，收獲前4小時加秋水仙素0.4mg，常規(guī)制片染色，鏡下數(shù)1000個淋巴細(xì)胞，以淋巴母細(xì)胞加上過渡型淋巴細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，計算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，比空白對照提高70%(不低于50%為合格)。
本發(fā)明和傳統(tǒng)的胸腺素制備方法相比有如下優(yōu)越性1、本法采用細(xì)胞勻漿，鹽水提取，工藝簡單，每周期7天，而國內(nèi)外丙酮法，工藝較復(fù)雜，每周期需30余天。
2、本法設(shè)備低廉，需普遍離心機(jī)和無菌室等。值人民幣3萬余元。國內(nèi)外常規(guī)法，設(shè)備昂貴，高速離心機(jī)冷凍干燥機(jī)等，值10萬美元。
3、本法正壓抽濾除菌，產(chǎn)品生物活性高，淋轉(zhuǎn)率提高88%，國內(nèi)外常規(guī)法高壓滅菌，產(chǎn)品生物活性低，淋轉(zhuǎn)率提高56%。
4、本法產(chǎn)品蛋白純度高(電泳兩條帶)，分子量小(6-7kd)，臨床無不良反應(yīng)。常規(guī)法產(chǎn)品蛋白純度差(電泳4-11條帶)，分子量大(9-58kd)，臨床5-26%不良反應(yīng)。
由上述可知，本發(fā)明工藝簡單，周期短，成品及設(shè)備價格低，治療效果好，易于推廣應(yīng)用，前景廣闊，社會與經(jīng)濟(jì)效益巨大。
權(quán)利要求
1.一種以人胎作原料的人胎胸腺素的制備方法，其特征在于將母體健康，胎兒發(fā)育正常的合法水囊引產(chǎn)胎兒，在無菌操作下解剖出胸腺，除去包膜，脂肪和結(jié)締組織，沖去血跡，用細(xì)胞分離器或勻漿機(jī)將胸腺組織進(jìn)行勻漿，用濃度為0.9%的生理鹽水制成克組織15ml的胸腺細(xì)胞懸液，再快速重復(fù)凍融三次，快凍溫度為-25℃，快融溫度為30℃，凍融后的懸液沉淀后得上清液，之后，將上清液在80℃的溫度下水浴一小時除去雜蛋白，再用離心機(jī)澄清得一清液，把一清液用濃度為1.83%鹽酸調(diào)到PH值為4，放置4-12小時，除去病毒，再用離心機(jī)澄清，制得二清液，用濃度為5%的NaHCO3調(diào)PH值為7.0后，用濾孔在2.2μ以下的超微濾膜正壓除菌抽濾，再經(jīng)無菌、熱源及過敏檢查合格后即為所需成品，成品可裝入安瓶或制成凍干粉劑型備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胎胸腺素的制備方法，其特征在于所說的胎兒為胎齡在5-8個月的合法水囊引產(chǎn)胎兒，胎兒娩出到送至制備場所不多于8小時，無菌低溫運(yùn)送，無菌解剖出的胸腺在-20℃的溫度下保存不得超過3個月，收集前胸腺細(xì)胞活度在90%以上。
全文摘要
本發(fā)明是涉及一種醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的人胎胸腺素的制備方法，主要是用5—8個月齡的正常胎兒的胸腺組織，去包膜、脂肪和結(jié)締組織，沖去血跡，用細(xì)胞分離器制成生理鹽水-胸腺細(xì)胞懸液，或高速勻漿后凍融三次，鏡檢無完整細(xì)胞，離心沉淀后，取上清液于80℃的溫度下水浴一小時，再用離心機(jī)除去大分子蛋白蛋，得上清液之后經(jīng)一系列精制過程和pH調(diào)整，除菌過濾，灌封成品備用，本發(fā)明工藝方法簡單，費(fèi)用低，所得產(chǎn)品成本低，價值低廉，療效好，易于推廣應(yīng)用，造福于人類。
文檔編號A61K35/26GK1076361SQ9310106
公開日1993年9月22日 申請日期1993年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月19日
發(fā)明者祁巖超 申請人:祁巖超