專利名稱：鈣通道阻塞多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中發(fā)現(xiàn)的多肽以及與該多肽具有大致相同的氨基酸順序和活性的一類多肽。此類多肽及其藥學(xué)上可接受的鹽能夠阻塞無脊椎動物和脊椎動物細(xì)胞(包括神經(jīng)和肌肉細(xì)胞)的鈣通道。本發(fā)明還涉及用此類多肽及其鹽阻塞有機體細(xì)胞(如神經(jīng)和肌肉細(xì)胞)的鈣通道，以治療哺乳動物由鈣通道傳遞的疾病。另外，本發(fā)明還涉及含有該類多肽的合成物及其鹽。
鈣拮抗物有很多用途，臨床上可用于治療心絞通、高血壓、心肌病、室性心律失常、aesophogeal achalasia、早產(chǎn)、雷諾病(Raynaud′s disease)及其它疾病。見W.G.Nayler.Calaium Antagonists，Academic Press Harcourt Brace Jovanovich Publshers.New York，NY 1988，其內(nèi)容并入本文作為參考。另外，此類合在物還可用于細(xì)胞生理(如神經(jīng)和肌肉細(xì)胞生理)的研究。
從Agelenopsis aperta中分離出的其它多肽在美國專利第5122596號中有公開。
本發(fā)明涉及從Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中發(fā)現(xiàn)的一種多肽。本發(fā)明的多肽及其所呈現(xiàn)的部分如下Agelenopsis肽J2有以下的氨基酸順序，SEQ ID NO1。
H2N-Glu-Ala-Cys-Ala-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Cys-Asp-Lys-Val-Lys-Cys-Cys-His-Asp-Arg-Arg-Cys-Arg-Cys-Asn-lle-Ala-Met-Asp-Asn-Cys-Val-Cys-Lys-Leu-Phe-Tyr-Cys-Glu-Leu-Phe-Gly-Thr-Cys-Asp-Arg-Leu-Lys-Pro
本發(fā)明的多肽能阻塞細(xì)胞的鈣通道。因此，此多肽本身可用來阻塞細(xì)胞鈣通道。此多肽還用來控制無脊椎的害蟲，治療哺乳動物由細(xì)胞鈣通道功能傳遞的疾病。
本發(fā)明還包括與上述多肽具有大致相同的氨基酸順序和鈣通道阻塞活性的多肽。
本發(fā)明還包括含有該多肽的藥用組合物及該多肽類的施用方法。
Agelenopsis aperta蜘蛛的毒液按本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的電刺激提取方法得到。最好用能夠防止反胃物和血液污染，這種技術(shù)本領(lǐng)域技術(shù)人員均熟知。得到的全毒液貯存在-78℃的冷凍狀態(tài)下直至用于下述純化過程。全毒液中組分的純化在一第列制備或半制備的色譜柱如C-4和C-18 Vydac
柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road，Noburn Massachusetts 01801)上用反相高效液相色譜法完成。峰值檢測在220-230nm下單色進(jìn)行，該部分的進(jìn)一步分析可用例如多色紫外吸收數(shù)據(jù)收集用一個Waters 990二極管系統(tǒng)檢測儀完成(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)。色譜柱上餾分的收集可用已知方法進(jìn)行。例如用一個ISCO/“FOXY”餾分收集器和一個ISCO 2159峰值檢測器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)收集。收集到的餾分置于適當(dāng)大小的器器中，例如無菌聚乙烯的實驗室器皿。然后用從洗脫液中冷凍干燥再從水中冷凍干燥的方法濃縮那些餾分。所得餾分的純度可用色譜分析決定，所用分析柱的梯度系統(tǒng)比最終純化餾分系統(tǒng)具有更高的同溶劑性。
本發(fā)明的多肽可用已知方法進(jìn)行順序分析，決定主要結(jié)構(gòu)的一般方法包括例如以下步驟。1)二硫鍵半胱氨酸殘基的還原和S-吡啶化，以增強底物對酶作用的敏感性，2)通過單酶和多步酶消化作用控制肽段分裂，3)通過反相高效液相色譜法(HPLC)分離和純化肽段，4)用N-末端順序測定和離子濺射質(zhì)譜分析鑒定肽段。
所研究多肽半胱氨酸殘基的S-吡啶化可在多肽氨基酸順序測定后的溶液中進(jìn)行?？砂聪率霾襟E完成。
將約1至10μg的多肽用緩沖液溶解或稀釋至50μl，緩沖液用1份1MTris HCl，PH8.5，含有4mM EDTA和3份8M鹽酸胍，2.5μl的2-巰基乙醇的10%水溶液加入混合物中，室溫、暗處、氬氣中保溫兩小時。保溫后，加入2ml 4-乙烯基吡啶(在氬氣、-20℃下保存的新鮮試劑)，混合物在室溫、暗處、氬氣中再保溫兩小時。然后將混合物脫鹽，最好用色譜法在短的、反相色譜柱中進(jìn)行。生成的烷基化的多肽用已知的方法進(jìn)行順序測定。
本公開的另一益處在于，其中Agelenopsis aperta毒液J2片段的肽，還可用從全毒液分離純化以外的方法得到。本發(fā)明的多肽可用重組DNA技術(shù)通過無性繁殖該多肽或其部分的編碼序列產(chǎn)生。例如，可按照本專業(yè)技術(shù)人員熟知的方法，運用已知氨基酸序列的雜交探針克隆整個多肽的氨基酸密碼順序?？捎弥亟MDNA技術(shù)和體外蛋白質(zhì)合成的方法產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。這樣的體外蛋白質(zhì)合成方法包括，但不限于，運用一種ABI 430A固相肽合成器(Applied Biosystems，Inc.850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，California 94404)用標(biāo)準(zhǔn)的Merrifield化學(xué)或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的固相化學(xué)方法。
本專業(yè)領(lǐng)域已知多肽中某些氨基酸更替不會影響或大致不會影響該多肽的功能。具體的替代物隨多肽的不同而不同，容許的取代物由本專業(yè)技術(shù)人中熟知的方法決定。因此，所有具有大致相同的氨基酸順序和大致相同的鈣通道阻塞活性的多肽，均在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的多肽阻塞多種細(xì)胞的鈣通道，如脊椎和無脊椎動物的神經(jīng)和肌肉細(xì)胞。
本發(fā)明的多肽阻塞鈣通道的能力可用以下步驟來演示。從8天大的鼠小腦制備小腦顆粒細(xì)胞(Wilkin et al.，Brain Res，115，181-199，1976)。將Aclar方塊(1cm2)(Proplasties Inc.，5033 Industrial Ave.Wall，NJ 07719)用聚-L-顆氨酸包膜置于含有1ml Eagles基礎(chǔ)培養(yǎng)基的12-孔盤中，分離細(xì)胞，將含有6.25×106個細(xì)胞的等分試樣加入每一個有Aclar方塊的孔中。24小時后加入胞嘧啶-β-D-阿拉件呋喃糖苷(最終濃度為10μM)。這些細(xì)胞在培養(yǎng)6，7和8天后用于fura 2分析。將細(xì)胞(粘在Aclar方塊上的)轉(zhuǎn)移到含有1ml 2μM fura2/AM(Molecular Probes Inc.Eugene，OR 97402)于HEPES緩沖液的12孔盤中。HEPES緩沖液(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸緩沖液含有0.01%的牛血清蛋白，0.01%的葡萄糖，PH值為7.4，不含鎂)。細(xì)胞在37℃下保溫40分鐘，取出含有fura 2/AM的緩沖液，再換入同種不含fura 2/AM的緩沖液1ml。在每一個石英比色杯中加2.0ml預(yù)熱(37℃)的緩沖液。將Aclar方塊上的細(xì)胞置入比色杯中，將比色杯置于裝置有磁力攪拌器的恒溫(37℃)支架上，用一熒光分光光度計(Biomedical Instrument Group，University of Pennsylvania)測定熒光度。熒光信號可穩(wěn)定約2分鐘。然后將適當(dāng)濃度的所研究化合物的溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，PH7.4)中的貯存溶液5-20μl加入比色杯。每個試驗完成后熒光標(biāo)記的校準(zhǔn)和fura/AM損失的修正按Nemeth et.al.J.Biol.Chem.262，5188(1987)所述的方法進(jìn)行。最大熒光值(Fmax)由加入35μm的肌霉素后測得。最小熒光度(Fmin由隨后加入EGTA(12mM)螯合鈣之后測得。按照上述步驟，所測多肽的鈣通道阻塞作用表現(xiàn)為加入該多肽后熒光度的減小。本發(fā)明的多肽顯示出低的IC50值，低于200nm。相比較，兩種已知的市售鈣通道拮抗物，硝苯吡啶和戊脈安，分別具有33nm和4800nm的IC50值。
本發(fā)明的多肽用作細(xì)胞鈣通道阻塞劑。因此，此類多肽還可用于無脊椎害蟲的控制及哺乳動物由鈣通道功能傳遞的疾病的治療，如心絞痛，高血壓，心肌病，室性心律失常，aesophogeal achalasial，早產(chǎn)和雷諾病。另外，這類多肽還可用于研究細(xì)胞生理，包括(但不限于)神經(jīng)和肌肉細(xì)胞。
本發(fā)是范圍還包括本發(fā)明的多肽的藥學(xué)上可接受的鹽。此種鹽的制備方法為本專業(yè)技術(shù)人員熟知。例如此多肽的堿基鹽可按常規(guī)的方法制備。
當(dāng)本發(fā)明的多肽用于哺乳動物時，可以單獨使用，也可以與藥學(xué)上可接受的載體或按標(biāo)準(zhǔn)藥劑操作稀釋于藥物中使用。該多肽可口服，或按適合于多肽的方法經(jīng)非腸道途徑施用。非腸道施用包括靜脈注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、皮下注射和局部施用。
本發(fā)明的多肽用于口服時，可以片劑或膠囊的形式服用，或以水溶液或懸浮液的形式服用。如以片劑口服，載體通常包括乳糖和粟粉以及潤滑劑，如通常加入硬脂酸鎂。以膠囊形式口服時，稀釋劑通常為乳糖和干粟粉。當(dāng)口服水溶懸浮液時，活性成分與乳化和懸浮價質(zhì)混合。如需要還可加入增甜劑和調(diào)味劑。
用于肌肉、腹膜內(nèi)、皮下和靜脈注射時，通常需要制備活性成分的無菌溶液，溶液的PH應(yīng)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)和緩沖。用于靜脈注射，應(yīng)控制溶液的總濃度使其與組織液等滲。
當(dāng)本發(fā)明的多肽及其鹽用于人體時，每日劑量應(yīng)由處方醫(yī)師決定。此外，劑量應(yīng)隨所齡、體重、病人的個體反應(yīng)而不同，以及由病癥的嚴(yán)重性和所施用藥的效能而定。
當(dāng)本發(fā)明的多肽及其鹽用于控制無脊椎的害蟲時，該多肽直接施用于該無脊椎動物體或其環(huán)境中。例如，本發(fā)明的化合物可以溶液的形式噴灑于該無脊椎動物上。控制此無脊椎動物所需的化合物的量將隨無脊椎動物及其環(huán)境條件而變化，由施用者決定。
當(dāng)本發(fā)明的多肽及其鹽用于細(xì)胞生理的研究時，該多肽將按照本專業(yè)技術(shù)人員熟知的方法施用于細(xì)胞上。例如，該多肽可于一種適當(dāng)?shù)纳砭彌_液中施于細(xì)胞上。這類研究所用的此種多肽的適合濃度應(yīng)為200μM。但是也可大于或小于200μM。多肽的施用量將由本專業(yè)技術(shù)人員按熟知的方法決定。
實施例1A.將原Agelenopsis aperta的毒液(約40μl)加入一個反相高效液相色譜儀的色譜柱(VYDAC
C-18，300
，22×250mm)中用一個雙相線性梯度操作系統(tǒng)，由95%A和5%B至80%A至和20%B經(jīng)30分鐘后，用30%A和70%B25分鐘(A為0.1%的三氟乙酸，B為乙腈)，監(jiān)測波長為220nm，流速為15ml/min，所需片段在38.3-38.7分鐘內(nèi)收集。匯集每一次得到的相似片段，然后用冷凍干燥法濃縮。
B.將從100μ的原毒液按步驟A分離出來的物質(zhì)，加入一個反向高效液相色譜柱(Vydac
，C-18，300
，22×250mm)中，用線性梯度系統(tǒng)操作，從77%A和23%B至70%A和30%B25分鐘(A為0.1%三氟乙酸，B為乙腈)，監(jiān)測波長為220nm，流速為12ml/min，所需片段在17.3至17.7分鐘內(nèi)收集。匯集每次得到的相似片段，然后用冷凍干燥法濃縮。
肽J2的結(jié)構(gòu)用下述的方法確定和證實。三份1至10nmol樣品用Waters Pico-Tag系統(tǒng)進(jìn)行異硫氰苯酯(PTC)氨基酸分析。用一個脈沖液相順序分析儀(ABI)測定原來還原和與吡啶乙醇作用過的多肽N-末端順序。多肽的主要結(jié)構(gòu)可用自動脈沖液相順序分析儀(Applied Biosystems，model 473A)測得。用質(zhì)譜儀的BIO-ION等離子解吸時間可得到質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)。
適用于N末端順序測定的多肽J2的吡啶乙基化的衍生物可按下列方法制備。將多肽J2(50mg)溶于10μl的緩沖液(比率為1∶3的1M tris，PH8.4，4μM二元EDTA和8M鹽醇胍)，用2μl0.454M(10%V/V)的2-巰基乙醇處理，在室溫、暗處放置3小時。反應(yīng)混合物在緩沖液中用2μl的4-乙烯基吡啶0.456M的溶液處理，在室溫、暗處放置18小時。反應(yīng)混合物用90μl的水和40μl的乙腈稀釋經(jīng)加入一個HPLC色譜柱(Baker WPC-18，4.6-250mm)，用雙相線性梯度系統(tǒng)處理，80%A和20%B5分鐘，然后80%至50%A和29%至50%B經(jīng)30分鐘(A為三氟乙酸、B為乙腈)，監(jiān)測波長為220nm，流速為1.0ml/min所需片段在20.8至21.3分鐘內(nèi)收集，用冷凍干燥法濃縮。
得到以下數(shù)據(jù)，確認(rèn)了多肽J2的結(jié)構(gòu)。
SEQ 1D NO1，48殘基，10個半胱氨酸，5個二硫鍵。
計算質(zhì)量＝5474.4測得質(zhì)量＝5474估計長度＝7.98順序表(1)一般資料(ⅰ)申請者(A)名稱Dfizer Inc.
(B)街道235 East 42mol Street(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家美國(F)郵政編碼(ZIP)10017(G)電話(203)441-4905
(H)傳真(203)441-5221(A)名稱NPS Pharmaceuticals，Inc(B)街道420 Chipeta Way(C)城市鹽湖城(D)州猶它州(E)國家美國(F)郵政編碼(ZIP)84108(G)電話(801)583-4939(H)傳真(801)583-4961(ⅱ)發(fā)明標(biāo)題Agetenopsis aperta的鈣通道阻塞多肽(ⅲ)序列編號1(ⅳ)計算機可讀形式(A)傳導(dǎo)形式軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patemtln Release ＃1.0 Version ＃1.25(EPO)(ⅵ)先有申請資料(A)申請?zhí)朥S 07/919538(B)申請時間1992年7月27日(2)SEQ ID No.1資料(ⅰ)序列特征(A)長度48個氨基酸(B)形式氨基酸
(C)鏈單鏈(D)拓樸學(xué)特征線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)來源(A)生物Agelenopsis aperta(B)組織類型毒液(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO權(quán)利要求
1.一種大致純的多肽，包括其氨基酸序列SEQIDNO∶1，或一種與該多肽有大致相同的氨基酸順序和大致相同的鈣通道阻塞活性的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.權(quán)利要求1的大致純的多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO1，其其藥學(xué)上可接受的鹽。
3.一種阻塞細(xì)胞鈣通道的方法，包括施用權(quán)利要求1的阻塞鈣通道量的多肽于所述細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述細(xì)胞為哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。
全文摘要
一種由Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中分離出來的多肽，它能阻塞不同有機體細(xì)胞的鈣通道，可用于阻塞細(xì)胞的鈣通道。用來治療由鈣通道傳遞的疾病和控制無脊椎害蟲。
文檔編號A61K38/16GK1086824SQ9310915
公開日1994年5月18日 申請日期1993年7月26日 優(yōu)先權(quán)日1992年7月27日
發(fā)明者R·A·?？寺? N·A·薩科曼諾, D·菲利普斯, M·E·凱利 申請人:美國輝瑞有限公司