專利名稱：重組突變出血敗血性巴斯德氏菌蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供由得自某些出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)基團(tuán)的DNA順序編碼的新免疫原性蛋白，所述基因編碼動(dòng)物的進(jìn)行性萎縮性鼻炎(PAR)發(fā)病過程中所涉及到的一些毒素。要求保護(hù)的蛋白毒性低、穩(wěn)定性好、易于純化，因此可用在疫苗中預(yù)防動(dòng)物體由出血敗血性巴斯德氏菌毒素(PMT)引起的各種病理作用。
PAR是動(dòng)物尤其是豬的一種廣泛傳播的、具有高度傳染性的感染性疾病，其中感染是由于鼻骨吸收作用而發(fā)生于口鼻部的正常骨結(jié)構(gòu)的，造成口鼻部變形、打噴嚏、流鼻涕和鼻粘膜出血。在養(yǎng)豬業(yè)中，這種疾病由于造成生長(zhǎng)延遲和對(duì)其他感染性疾病的易感性增加而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。
PAR的發(fā)病與動(dòng)物的鼻腔內(nèi)存在不同菌株的革蘭氏陰性菌即出血敗血性巴斯德氏菌有關(guān)，這種細(xì)菌產(chǎn)生一種具有溶骨活性的毒性蛋白，這種蛋白含有1285個(gè)氨基酸殘基，其計(jì)算分子量約為146.5kD。
天然出血敗血性巴斯德氏菌毒素(PMT)除具有溶骨活性外，還具有其他毒性作用，包括皮膚壞死作用、細(xì)胞致病作用及對(duì)細(xì)胞的促有絲分裂作用(增殖作用)。根據(jù)常規(guī)的急性毒性測(cè)試，例如測(cè)量殺死50%實(shí)驗(yàn)室小動(dòng)物所需的劑量(LD50)，得知PMT毒性很高，在小鼠體內(nèi)的LD50值據(jù)報(bào)道在10-70ng的范圍。
出血敗血性巴斯德氏菌毒素具有免疫原性，因此，將該蛋白給予動(dòng)物會(huì)誘發(fā)抗體形成，這可以保護(hù)動(dòng)物免受這種毒素生產(chǎn)菌的病理作用。然而，天然毒素由于毒性高而不能作為一種疫苗組分使用。因此，用于對(duì)包括豬在內(nèi)的動(dòng)物進(jìn)行抗出血敗血性巴斯氏菌感染作用免疫接種的已知疫苗，含有已殺死的出血敗血性巴斯德氏菌毒素生產(chǎn)細(xì)胞和/或產(chǎn)毒素出血敗血性巴斯德氏菌的失活的(去毒的)含毒素提取物作為活性組分。這類失活的疫苗可在市場(chǎng)上買到。這類疫苗中PMT的失活一般是通過熱處理或用醛(包括戊二醛和甲醛)處理而實(shí)現(xiàn)的，這兩種處理都使毒素蛋白變性。
然而，已知對(duì)免疫原性蛋白進(jìn)行熱去毒或醛去毒可能會(huì)造成免疫原性降低或改變，這是一種不良的副作用，在很大程度上可能是由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不可預(yù)測(cè)的修飾作用，包括一個(gè)或若干個(gè)抗原決定基的構(gòu)象修飾。值得注意的是，PMT的這類結(jié)構(gòu)修飾作用會(huì)使具有其他特異性的抗體的產(chǎn)生受到優(yōu)先刺激，并有可能造成對(duì)蛋白水解降解作用的敏感程度增加。此外，PMT的醛去毒過程造成一般約為1%的殘留毒性。
因此，曾試圖得到以去毒PMT為主要成分但卻未經(jīng)上述傳統(tǒng)去毒處理的疫苗。WO89/09617公開了用重組方法去毒但仍具有免疫原性的PMT衍生物。這些PMT衍生物的大致制備方法是分離PMT編碼基團(tuán)，通過用限制酶處理DNA而缺失該基因的一個(gè)較大片段，將如此截短的基因插入合適的宿主細(xì)胞中，并使該基因表達(dá)出截短形式的天然PMT。已產(chǎn)生了分子量在53-136kD范圍的一些PMT衍生物，這些衍生物的毒性降低，同時(shí)又保留了大部分免疫原性。一般來說，這種截短蛋白所含有的氨基酸殘基比天然PMT少50-500個(gè)。該文獻(xiàn)中所公開的一個(gè)優(yōu)選的PMT衍生物是衍生物O。
疫苗中合適免疫原性組分的一個(gè)重要特征是對(duì)一級(jí)、二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)的降解穩(wěn)定。免疫原的降解可能是由化學(xué)和/或酶促水解作用產(chǎn)生的，也可能是由疫苗制備或貯存過程中存在的物理或化學(xué)因子產(chǎn)生的，這種降解會(huì)影響一級(jí)、二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)，使該組分的免疫原性降低，或迅速改變或逐漸改變。
上述降解作用除了對(duì)打算用作疫苗的蛋白的免疫原性有不利影響外，在工業(yè)上可能也是不希望有的，因?yàn)槿绻呙缃M合物中所含的免疫原已發(fā)生過降解，則該組合物中所含的蛋白分子缺少均一性。這種分子均一性的缺乏使人們很難得到標(biāo)準(zhǔn)化的疫苗組合物。
低成本出血敗血性巴斯德氏菌疫苗生產(chǎn)中的另一個(gè)主要要求是，免疫原性組分要易于從產(chǎn)生該組分的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化。特別理想的是，該組分能夠用簡(jiǎn)單的一步純化法，如常規(guī)的陰離子交換色譜步驟，以基本純凈的形式分離出來。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)PMT編碼DNA順序，如toxA基因，包括編碼出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素的toxA基因，進(jìn)行定位(位點(diǎn)特異性)誘變，能夠得到具有高度免疫原性的低毒性PMT毒素相關(guān)蛋白，這些蛋白與用重組法去毒的已知PMT衍生物相比，更能耐受降解作用，更易于以工業(yè)規(guī)模純化。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種至少部分地由一個(gè)DNA順序編碼的重組突變蛋白，該DNA順序可以由toxA基因，包括編碼出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種(Pasteurella multocida sspmultocida)45/78毒素的toxA基因，通過一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到，所述蛋白能夠與針對(duì)由出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78編碼的PMT而產(chǎn)生的抗體結(jié)合，該蛋白的計(jì)算分子量至少為140kD。
本發(fā)明的另一方面提供一種制備重組突變蛋白的方法，該蛋白能夠與針對(duì)出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素而產(chǎn)生的抗體結(jié)合，其分子量至少為140kD，所述方法包括如下步驟(ⅰ)分離出DNA順序(a)或(b)，順序(a)包含編碼出血敗血性巴斯德氏菌溶骨毒素(PMT)的toxA基因，包括編碼出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78 PMT的toxA基因;順序(b)所含順序的基因產(chǎn)物能夠與針對(duì)出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78PMT而產(chǎn)生的抗體發(fā)生反應(yīng);
(ⅱ)對(duì)所述DNA順序進(jìn)行誘變處理，造成一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入，得到編碼重組突變蛋白的突變DNA順序;
(ⅲ)將所得的突變DNA順序插入到一個(gè)復(fù)制子中;
(ⅳ)用該復(fù)制子轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在該細(xì)胞中，所述復(fù)制子能夠復(fù)制，編碼重組突變蛋白的突變DNA順序能夠表達(dá);
(ⅴ)在表達(dá)突變DNA順序的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞;
(ⅵ)從培養(yǎng)物中收集重組突變蛋白。
本發(fā)明的又一方面涉及一個(gè)DNA順序，該順序包含一個(gè)編碼分子量至少為140kD的蛋白的基因，所述蛋白能夠與一種抗體反應(yīng)，而該抗體能與由toxA基因編碼的出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素(PMT)反應(yīng)，所述DNA順序是由含有toxA基因的復(fù)制子通過以下方法得到的使所述toxA基因的一個(gè)或更多個(gè)密碼子發(fā)生置換、缺失或插入，或使截短或突變的toxA基因與另一基因碼內(nèi)融合，從而導(dǎo)致本文所限定的融合蛋白基因產(chǎn)物的表達(dá)。
本發(fā)明的再一方面提供一種攜有如上所限定的DNA順序的復(fù)制子以及用這樣一種復(fù)制子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在該細(xì)胞中所述復(fù)制子能夠復(fù)制。
本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及本文所限定的突變重組蛋白作為預(yù)防出血敗血性巴斯德氏菌感染的疫苗的應(yīng)用。
出血敗血性巴斯德氏菌毒素(PMT)基因的完整核苷酸順序已由WO89/09617(同上)和Petersen(Molecular Microbiology，4821-830，1990)公開。已證明這個(gè)命名為toxA基因的毒素編碼基因是染色體基因，位于一個(gè)大于20kb的DNA片段(區(qū)段)上，并且是出血敗血性巴斯德氏菌的毒素生產(chǎn)株所獨(dú)有的。包含整個(gè)毒素編碼區(qū)和天然啟動(dòng)子的4381bp出血敗血性巴斯德氏菌DNA的核苷酸順序示于Petersen文獻(xiàn)(同上)的圖2中，此順序?qū)⒁缘怯浱?hào)X51512出現(xiàn)在EMBL/Gen Bank/DDBJ Nucleotide Sequence Databases中。
天然toxA基因編碼1285個(gè)氨基酸的PMT蛋白，該蛋白的計(jì)算分子量為146，553道爾頓，與該蛋白的表觀分子量(143kD)一致。
如上所述，toxA基因存在于出血敗血性巴斯德氏菌的毒素生產(chǎn)株中，因此，本發(fā)明提供由一個(gè)DNA順序編碼的重組突變蛋白，該DNA可由上述toxA基因，包括從出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78中分離出的toxA基因得到。在下文中，用縮寫“rmPMT”來表示本文所限定的重組突變PMT蛋白。
rmPMT編碼DNA順序可以由天然染色體toxA基因得到，也可以由含有該基因的另一個(gè)復(fù)制子如重組質(zhì)粒得到。這類可以在編碼rmPMT的DNA順序的構(gòu)建過程中作為起始物使用的質(zhì)粒包括例如如

圖1所示的pSPE312、pSPE680和pSPE1003。大小約為7kb的pSPE1003質(zhì)粒有一個(gè)獨(dú)特的EcoRI限制位點(diǎn)，它有利于rmPMT編碼DNA順序的構(gòu)建，其中在該獨(dú)特限制位點(diǎn)的下游通過一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而進(jìn)行相對(duì)于天然PMT編碼順序的修飾。
因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供由一個(gè)DNA順序編碼的rmPMT，該DNA順序可由toxA基因通過以下方法得到在所述基因的獨(dú)特EcoRI限制位點(diǎn)的下游進(jìn)行一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入，或者使截短或突變的toxA基因與第二個(gè)編碼免疫原性蛋白的基因碼內(nèi)融合，從而導(dǎo)致本文所限定的融合蛋白基因產(chǎn)物的表達(dá)。
WO89/09617中已公開了可以分離出一些截短的PMT衍生物，這些衍生物的計(jì)算分子量在53-139.337kD范圍內(nèi)，并保留了在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)預(yù)防出血敗血性巴斯德氏菌相關(guān)疾病(包括進(jìn)行性萎縮性鼻炎)的免疫應(yīng)答的能力，但據(jù)預(yù)計(jì)，通過在這里引入計(jì)算分子量接近天然PMT(如至少140kD)的免疫原性非變性PMT相關(guān)物質(zhì)，可以生產(chǎn)出在免疫原性、穩(wěn)定性和純化容易程度方面更具優(yōu)點(diǎn)的疫苗。
據(jù)此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供一種計(jì)算分子量至少為141kD的rmPMT。分子量至少為142kD的rmPMT可能更為優(yōu)選，例如計(jì)算分子量至少為143kD(例如至少為144kD)的rmPMT，特別是至少為145kD的rmPMT。
本發(fā)明所提供的重組突變蛋白的一個(gè)重要特征是，這些蛋白容易從它們存在于其中的懸浮液中回收和/或純化。這類懸浮液包括已在基因表達(dá)條件下培養(yǎng)了含有編碼蛋白的toxA衍生基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基，以及已表達(dá)了這種toxA衍生基因的宿主細(xì)胞的提取液。
在本文本中，術(shù)語(yǔ)“容易”的含義是能夠用廉價(jià)的常規(guī)工業(yè)純化方法，優(yōu)選用能夠得到基本不含基本為非降解形式的非rmPMT蛋白或任何不需要的非蛋白物質(zhì)的一步純化法，回收和/或純化出存在于懸浮液中的、有商業(yè)意義比例(例如至少50%)的rmPMT。但是，優(yōu)選可回收更高比例的存在于懸浮液中的rmPMT，例如至少75%，更優(yōu)選的是至少90%。因此，可以選擇能以高回收率得到如上所限定的基本純凈rmPMT制備物的任何合適的低成本常規(guī)純化方法。
特別重要的是，所選擇的純化方法應(yīng)使得到的rmPMT制備物基本上不含有蛋白水解活性的酶類，例如來源于表達(dá)rmPMT編碼基因的宿主細(xì)胞的酶類。如果這類酶存在于制備物中，則易受酶降解的rmPMT分子可能會(huì)發(fā)生酶促降解;這意味著該制備物可能是不穩(wěn)定的，也就是說，原來表達(dá)出的蛋白分子將會(huì)隨時(shí)間推移而逐漸降解，這可能會(huì)導(dǎo)致rmPMT的免疫原性降低或改變，如果這種rmPMT存在于疫苗組合物中則會(huì)導(dǎo)致疫苗標(biāo)準(zhǔn)化程度不足。
最好是，由所選的純化方法得到的rmPMT制備物在低于10℃的溫度下貯存時(shí)，在至少3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)對(duì)降解穩(wěn)定，并使宿主細(xì)胞中表達(dá)的rmPMT分子保留至少90%。較為優(yōu)選的是保留至少95%的分子，更為優(yōu)選的是至少97%，特別是至少99%。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，rmPMT至少80%可純化。在本文本中，術(shù)語(yǔ)“可純化”用來表示用給定的純化方法有可能得到含所指出比例rmPMT的rmPMT制備物，這一比例是按該純化方法所得的制備物中蛋白質(zhì)的總含量來計(jì)算的。按照上述rmPMT純化容易程度的定義，優(yōu)選的蛋白是至少90%(例如至少94%)可純化的蛋白，更為優(yōu)選的是至少95%可純化。
作為可以達(dá)到所需rmPMT純度的合適純化方法的實(shí)例，可以使用以下純化方法，該方法包括用Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)在2cm2×25cm色譜柱中進(jìn)行陰離子交換色譜，在該柱中加入約200mg總細(xì)菌蛋白，該蛋白為表達(dá)該蛋白的細(xì)菌的提取物形式，流速為約30cm/小時(shí)，用含0-1000mM NaCl的緩沖液線性梯度洗脫吸附的蛋白，必要時(shí)接著用Phenyl Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱對(duì)洗脫出的各組分進(jìn)行疏水性相互作用色譜，洗脫吸附的蛋白，并測(cè)定其含量，所述色譜柱的線度為2cm2×20cm，流速為30cm/小時(shí)。
如上所述，天然PMT包含1285個(gè)氨基酸。在一個(gè)有用的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如本文所限定的rmPMT，編碼該蛋白的DNA順序是由toxA基因通過用編碼不同氨基酸的密碼子置換至少一個(gè)編碼某個(gè)氨基酸的密碼子，或者通過缺失或插入至少一個(gè)密碼子而得到的。在本文中，術(shù)語(yǔ)“置換密碼子”可表示天然toxA基因中所存在的密碼子中1個(gè)、2個(gè)或所有3個(gè)堿基的交換。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)“密碼子”可以是不止一個(gè)特定的核苷酸三聯(lián)體，只要該三聯(lián)體編碼同一氨基酸就可以。
按照本發(fā)明，密碼子的置換可以在能得到本文所限定的rmPMT的任何氨基酸位置上進(jìn)行。在本文本中，術(shù)語(yǔ)“氨基酸位置”應(yīng)理解為相應(yīng)于特定氨基酸位置的密碼子。在下文中，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”有時(shí)也用于表示常用術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，密碼子置換在編碼該蛋白的基因的3′端進(jìn)行，導(dǎo)致1131-1285位之間的某個(gè)或某些氨基酸位置發(fā)生改變，例如在1175-1285位之間的位置，如1200-1230位之間的位置。
為使所得重組突變PMT的毒性充分降低，最好置換toxA基因的兩個(gè)或更多個(gè)密碼子。在可用的實(shí)施方案中，至少置換3個(gè)密碼子，例如4個(gè)密碼子。應(yīng)該理解，如上所限定的包含兩個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換可能暗含了rmPMT中同一氨基酸在兩個(gè)或更多個(gè)位置上的置換，或若干不同氨基酸殘基的置換。另外，多個(gè)氨基酸置換可以是一個(gè)連續(xù)氨基酸區(qū)段的形式，也可以是若干空間上分散置換的形式。
除了得到低毒性rmPMT之外，toxA基因中密碼子的多重置換可得到一種更為安全的免疫原性PMT相關(guān)蛋白，因?yàn)槭雇蛔兓貜?fù)到野生型毒性蛋白的概率隨著置換數(shù)目的增加而呈指數(shù)降低。
在下文中，由密碼子置換得到的rmPMT用包含被置換氨基酸殘基和置換氨基酸的單字母代碼的一種或若干種標(biāo)示方法來表示，也用已發(fā)生置換的氨基酸位置的標(biāo)示方法來表示。例如，記作SV1201的蛋白是指1201位的絲氨酸殘基被纈氨酸殘基置換的rmPMT，rmPMT記作HL1202HY1205HY1223HY1228則用來表示重組突變PMT中野生型PMT中存在的組氨酸殘基在1202位被亮氨酸殘基置換，在1205、1223和1228位被酪氨酸殘基置換(在下文中，HL1202HY1205HY1223HY1228 rmPMT也寫作4HX)。
按照本發(fā)明，rmPMT可以包含能導(dǎo)致本文所限定的rmPMT的、相對(duì)于天然PMT的任何氨基酸殘基置換。例如，有用的rmPMT可以如下得到，即，置換編碼選自絲氨酸、組氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸的氨基酸的密碼子。置換氨基酸可以是能導(dǎo)致如本文所限定的rmPMT的任何氨基酸，如纈氨酸、亮氨酸或酪氨酸。
重組突變PMT除了可以由上述氨基酸置換法得到外，也可以按照本發(fā)明由一個(gè)DNA順序編碼，該DNA順序由編碼PMT的toxA基因通過缺失至少一個(gè)編碼某個(gè)氨基酸的密碼子而得到。密碼子的缺失可以在能導(dǎo)致本文所限定的rmPMT的任何氨基酸位置上進(jìn)行。
然而，在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，密碼子的缺失在編碼天然PMT蛋白的toxA基因的3′端進(jìn)行，例如1131-1285位之間的氨基酸殘基，如1175-1285位之間，如1215-1285位之間。
毒性充分降低的rmPMT雖然可以通過缺失一個(gè)密碼子(如本文所限定的rmPMT △H1223)而得到，但最好使兩個(gè)或更多個(gè)密碼子缺失，以進(jìn)一步降低rmPMT的毒性。在有用的優(yōu)選實(shí)施方案中，缺失至少3個(gè)密碼子，例如至少4個(gè)密碼子。更為優(yōu)選的是使用相對(duì)于天然PMT缺失至少7個(gè)氨基酸的rmPMT。除了得到低毒性rmPMT外，toxA基因中堿基對(duì)的多重缺失可得到更為安全的免疫原性PMT相關(guān)蛋白，因?yàn)槭雇蛔兓貜?fù)到野生型毒素編碼基因的概率隨堿基對(duì)缺失數(shù)目的增加而呈指數(shù)下降。
在下文中，由密碼子缺失得到的rmPMT用符號(hào)“△”后接天然PMT中已缺失了氨基酸的氨基酸位置來表示。例如，記作△1215-1221的蛋白質(zhì)表示由一個(gè)由toxA得到的基因編碼的rmPMT，該基因中缺失了編碼天然toxA基因產(chǎn)物的1215-1221位(包括兩頭)氨基酸的密碼子。
本發(fā)明的rmPMT可包含能導(dǎo)致本文所限定的rmPMT的、相對(duì)于天然PMT的任何氨基酸缺失。例如，有用的rmPMT可以通過從toxA基因中缺失編碼某個(gè)氨基酸的密碼子而得到，所述氨基酸選自組氨酸、賴氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸。應(yīng)該理解，如上所限定的包含兩個(gè)或更多個(gè)密碼子的缺失，可能暗含了rmPMT中同一氨基酸在兩個(gè)或更多個(gè)位置的缺失，或者若干不同氨基酸的缺失。另外，多重氨基酸缺失可以是一個(gè)連續(xù)氨基酸區(qū)段的形式，也可以是若干空間上分散缺失的形式。
重組突變PMT除了可以通過如上所述的氨基酸置換或缺失得到外，也可按照本發(fā)明由一個(gè)DNA順序編碼，該DNA順序由編碼PMT的toxA基因通過插入至少一個(gè)編碼氨基酸殘基的密碼子而得到。密碼子的插入可以在相應(yīng)于能得到本文限定的rmPMT的任何氨基酸位置的任何密碼子的下游進(jìn)行。
然而，在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，密碼子的缺失在toxA基因的3′端進(jìn)行，例如1131-1285位之間的氨基酸位置的下游，如1175-1285位之間的位置的下游，如1200-1230位之間的位置的下游。
為得到毒性充分降低的rmPMT，最好相對(duì)于天然PMT編碼基因插入2個(gè)或更多個(gè)密碼子。在本發(fā)明的有用實(shí)施方案中，插入至少3個(gè)密碼子，例如4個(gè)密碼子。toxA基因中密碼子的多重插入除了可得到低毒性rmPMT外，還可得到更為安全的免疫原性PMT相關(guān)蛋白，因?yàn)閾?jù)認(rèn)為使突變回復(fù)到野生型毒性蛋白的概率隨插入堿基對(duì)數(shù)目的增加而呈指數(shù)下降。
在下文中，由密碼子插入得到的rmPMT的表示方法是符號(hào)“+”后接由插入密碼子編碼的氨基酸殘基的單字母代碼、以及天然PMT中緊接其上游插入了氨基酸的位置。例如，記作+G1203的蛋白表示由一個(gè)得自toxA的基因編碼的rmPMT，其中緊靠編碼天然PMT 1203位氨基酸的密碼子的上游已插入了一個(gè)編碼甘氨酸的密碼子;記作+GG1203的rmPMT表示由得自toxA的基因編碼的重組突變PMT，其中緊靠編碼天然PMT1203位氨基酸的密碼子的上游已插入了兩個(gè)編碼甘氨酸的密碼子。
根據(jù)本發(fā)明，rmPMT可以包含能導(dǎo)致如上所限定的rmPMT的、相對(duì)于天然PMT的任何氨基酸插入。應(yīng)該理解，如上所限定的包含2個(gè)或更多個(gè)密碼子的插入，可能暗含了rmPMT中相同氨基酸在兩個(gè)或更多個(gè)位置的插入，或者兩個(gè)或更多個(gè)不同氨基酸的插入。另外，多重氨基酸插入可以是相鄰插入的形式，也可以是多重空間分散插入的形式。
在重要的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種如本文所限定的蛋白，該蛋白是由一個(gè)DNA順序編碼的融合蛋白，所述DNA順序包含一個(gè)第一基因和一個(gè)第二基因，第一基因編碼一種能與一種抗體反應(yīng)的免疫原性蛋白，所述抗體則能與由toxA基因編碼的出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素(PMT)反應(yīng)，所述基因是由包含toxA基因的復(fù)制子通過所述toxA基因的一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到的;第二基因編碼第二免疫原性蛋白，第一和第二蛋白可作為融合蛋白表達(dá)。融合可以在第二基因的任何位置進(jìn)行，導(dǎo)致基氨基末端或羧基末端與得自toxA的第一基因融合。
融合蛋白所包含的第二免疫原性蛋白可以是由病原生物固有表達(dá)的蛋白，也可以是這種固有表達(dá)蛋白的免疫原性片段或衍生物。這種融合蛋白作為多用途疫苗是很有用的，因?yàn)檫@些疫苗在給予人或動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、鳥類動(dòng)物或魚類動(dòng)物)后所產(chǎn)生的防護(hù)作用，不僅針對(duì)由產(chǎn)毒素的出血敗血性巴斯德氏菌所引起的疾病，而且也針對(duì)由編碼第二免疫原性蛋白的基因原來所在的病原生物所引起的疾病。據(jù)認(rèn)為，本發(fā)明的融合蛋白可包含其他免疫原性蛋白。編碼第二免疫原性蛋白的基因可以從任何病原性病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、酵母或寄生生物中分離。在這方面，得自豬病原體的基因特別令人感興趣。
按照本發(fā)明，如上所限定的融合蛋白所包含的第一免疫原性蛋白可以是分子量小于139.337kD的蛋白，在其他有用的實(shí)施方案中也可以是計(jì)算分子量至少為139.338kD的蛋白，例如至少140kD或至少143kD。本發(fā)明融合蛋白的一個(gè)實(shí)例是含有β-半乳糖苷酶作為第二免疫原性蛋白的融合蛋白1132″β-gal。這種融合蛋白是由下文中所述的質(zhì)粒pSPE1134表達(dá)的，其計(jì)算分子量為約245kD。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，分子量低于140kD(如約126kD或更低)的免疫原性PMT相關(guān)蛋白，在貯存過程中可能不穩(wěn)定，有可能造成免疫原性喪失，或者不能純化到如本文所限定的對(duì)本發(fā)明蛋白所要求的程度。發(fā)現(xiàn)融合蛋白的純度比低分子量蛋白本身要好。
如前面已提到的，天然PMT的毒性很高，以至于不能在疫苗組合中作為免疫原使用，另外，其顯著的促有絲分裂作用將要求在生產(chǎn)過程中采取嚴(yán)格的環(huán)保措施。但是，本發(fā)明所提供的高度免疫原性toxA相關(guān)rmPMT相對(duì)于天然PMT蛋白來說毒性降低，因此允許在預(yù)防出血敗血性巴斯德氏菌感染的疫苗中直接作為活性成分使用。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“毒性”可以描述對(duì)活生物體的任何可檢測(cè)的不利作用，所述活生物體包括原核和真核細(xì)胞培養(yǎng)物，也包括活動(dòng)物(包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和家畜)。因此，PMT和PMT相關(guān)分子的毒性可如下測(cè)定使上述細(xì)胞和動(dòng)物與不同數(shù)量的分子接觸，并測(cè)定其不利作用，以獲得毒性的定量量度。有關(guān)rmPMT的相對(duì)毒性可以如下來計(jì)算在毒性試驗(yàn)中引入確定量的任選在另一種非出血敗血性巴斯德氏菌生物中表達(dá)的天然PMT作為參比毒性物質(zhì)，并將其不利作用與本文所限定的給定rmPMT的量相比較，得到等效作用值。
可以應(yīng)用任何合適的常規(guī)毒性試驗(yàn)來驗(yàn)證本文所限定的rmPMT的毒性作用的降低。這樣一種合適而方便的方法是測(cè)定促有絲分裂效力，這是用對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(包括作為實(shí)例的NIH或Swiss 3T3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物)的增殖作用來測(cè)定的，這將在下面的實(shí)施例中詳細(xì)敘述。
本發(fā)明的一個(gè)有用的實(shí)施方案提供了一種促有絲分裂效力至多為75%的rmPMT，這一效力是通過測(cè)定該蛋白對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的增殖作用而確定的，所述測(cè)定包括第一步，根據(jù)含rPMT懸浮液的連續(xù)稀釋液的PE測(cè)定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按下式計(jì)算PEPEx= (Nx-No)/(Npmt-N0) x100%其中Nx為裝有樣品稀釋液x的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，Npmt為裝有大腸桿菌SPE1036(攜有編碼rPMT的pSPE680)全細(xì)胞提取液的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，所述提取液含有終濃度為20ng/ml的rPMT，No為裝有大腸桿菌DH5α全細(xì)胞提取液的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，所述培養(yǎng)皿裝有NIH 3T3細(xì)胞的匯合單層;第二步，測(cè)定濃度在1-1000ng/ml范圍的蛋白懸浮液的PE，并利用所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖2-4)計(jì)算相對(duì)rmPMT濃度(與rPMT濃度比較)，得出某一PE值。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，如上所限定的促有絲分裂效力相對(duì)于天然PMT至多為50%，更為優(yōu)選的是至多35%，更為優(yōu)選的是至多25%，最優(yōu)選的是至多10%，例如至多5%。在一些優(yōu)越的實(shí)施方案中，促有絲分裂效力優(yōu)選低至相對(duì)于天然PMT至多為2%，例如至多為1%，甚至至多為0.1%。
測(cè)定某種物質(zhì)毒性作用的另一個(gè)常規(guī)方法是在動(dòng)物(如體重約20g的小鼠)體內(nèi)測(cè)定如上所限定的LD50值。如上所述，腹膜內(nèi)給予體重約20g的小鼠數(shù)量遞增的毒素，并記錄存活動(dòng)物的數(shù)目，由此測(cè)得天然PMT的LD50值在10-70ng范圍內(nèi)。
為使如上所限定的rmPMT用作安全的疫苗成分，其LD50值優(yōu)選比LD50值為10ng的天然PMT或rPMT降低至少100倍，更為優(yōu)選的是至少500倍，更為優(yōu)選的是至少1000倍，最優(yōu)選的至少1500倍，特別是至少2000倍，天然PMT或rPMT的LD50值是通過腹膜內(nèi)給予小鼠蛋白而測(cè)定的，這意味著本發(fā)明特別有用的rmPMT是用同樣方法測(cè)定時(shí)LD50至少50μg(例如至少51.2μg)的rmPMT。據(jù)認(rèn)為，本發(fā)明甚至有可能制備出如上所限定的LD50值降低至少10，000倍或至少100，000倍的rmPMT。
如本文所限定的rmPMT，在用于預(yù)防動(dòng)物(特別是豬)由天然出血敗血性巴斯德氏菌毒素引起的上述毒性作用的疫苗組合物中，可以作為活性免疫原性組分使用。但是，發(fā)現(xiàn)小鼠的免疫接種構(gòu)成了測(cè)試PMT相關(guān)蛋白免疫原性的有用模型系統(tǒng)(Petersen等，Infect.Immun.，59∶1387-1393，1991)。因此，可以應(yīng)用這樣一種模型系統(tǒng)作為鑒定適用于疫苗組合物的重組突變PMT蛋白的篩選系統(tǒng)。使用經(jīng)過修改的這一系統(tǒng)來測(cè)試本發(fā)明rmPMT的免疫原性，在這一修改的系統(tǒng)中用CF1×BALB/c小鼠代替自交BALB/c小鼠。
因此，本發(fā)明的一個(gè)有用的實(shí)施方案提供一種如本文所限定的蛋白，該蛋白如果以含有至少1.0μg/ml吸收在氧化鋁凝膠上的蛋白的疫苗制備物形式以兩周的間隔給予小鼠兩次，則能保護(hù)至少80%的小鼠不受在第二次給予疫苗兩周后腹膜內(nèi)注射的100ngrPMT的致死作用。本文所限定的rmPMT在以含有5.0μg/ml吸收蛋白的上述疫苗制備物形式給予時(shí)，應(yīng)優(yōu)選保護(hù)100%的小鼠。
所構(gòu)建的rmPMT蛋白的一個(gè)實(shí)例是有4個(gè)氨基酸置換并稱為HL1202HY1205HY1223HY1228(下文中也稱為4HX)的蛋白。進(jìn)行毒性測(cè)試時(shí)，這種重組突變蛋白的如上所限定的LD50值為至少102.4μg，并具有如上所限定的免疫原性作用。該蛋白由質(zhì)粒pSPE1038編碼，該質(zhì)粒已于1992年9月1日保藏在DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，保藏號(hào)為DSM 7221，保藏形式為用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α菌株SPE1038的培養(yǎng)物。
rmPMT的其他實(shí)例包括由pSPE1234編碼的△H1223、由pSPE1020編碼的+GG1203和由pSPE1134編碼的1132″β-gal。pSPE1234、pSPE1020和pSPE1134已于1993年9月9日保藏在DSM，保藏號(hào)分別為DSM8547、DSM8548和DSM8546，除pSPE1134是以大腸桿菌K12菌株MC1000的形式保藏外，其余質(zhì)粒的保藏形式均為用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)物。
如上所述，本發(fā)明的另一方面涉及制備如上所限定的免疫原性重組突變PMT蛋白的方法，所述蛋白能夠與針對(duì)出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素(PMT)而產(chǎn)生的抗體結(jié)合，其分子量至少為140kD。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，rmPMT可以是分子量至少為141kD(例如至少為143kD)的蛋白。
所述方法的第一步包括分離一個(gè)DNA順序，該DNA順序包含一個(gè)toxA基因，該基因編碼能與抗PMT抗體反應(yīng)的出血敗血性巴斯德氏菌溶骨毒素(PMT)，例如出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78PMT，或其功能等價(jià)物。該toxA基因的鑒定和分離可以方便地如Petersen(1990，同上)所述進(jìn)行。該基因可以從公認(rèn)的產(chǎn)毒素出血敗血性巴斯德氏菌菌株(如從感染動(dòng)物體內(nèi)分離出的菌株)的染色體中分離。該基因也可以從攜有含該基因的DNA順序的質(zhì)粒中分離，例如從選自pSPE308、pSPE312、pSPE481、pSPE525、pSPE680、pSPE716(Petersen，1990，同上)或pSPE1003(圖1)的質(zhì)粒中分離，也可用常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)法構(gòu)建，或者合成。
按照本發(fā)明，上述方法的第二步包括對(duì)分離出的PMT編碼基因進(jìn)行誘變處理，任選包括更多個(gè)誘變步驟，從而引起一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入。一個(gè)特別合適的誘變方法是定位突變或位點(diǎn)特異性突變，例如利用如Nelson等人(Analytical Biochemistry 180∶147-151，1989)和下面的實(shí)例1所述的經(jīng)過修改的水生嗜熱菌聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法。這里所用的方法涉及使用四種引物，其中一種是突變特異性的，另外三種則是為使突變DNA能進(jìn)行特異性擴(kuò)增而設(shè)計(jì)的。這種方法的獨(dú)特之處是兩個(gè)相關(guān)的寡聚脫氧核糖核苷酸引物(ⅰ)一個(gè)雜種引物，由一個(gè)與所要擴(kuò)增的DNA區(qū)互補(bǔ)的3′片段和一個(gè)其順序與任一靶DNA鏈都不互補(bǔ)的5′片段組成;(ⅱ)一個(gè)與上述雜種引物的5′片段相同的寡核苷酸引物。用于定位誘變的寡核苷酸引物示于下文實(shí)施例1中的表Ⅰ。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法的第二步包括對(duì)所分離出的DNA順序進(jìn)行定位誘變或位點(diǎn)特異性誘變處理，包括如下步驟構(gòu)建能夠與步驟(ⅰ)中分離出的DNA順序雜交的突變特異性引物順序;用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法使含所述引物順序的DNA片段擴(kuò)增；然后用所述擴(kuò)增出的DNA片段或其一部分置換所分離的DNA順序中的一個(gè)片段。
通過選擇適當(dāng)?shù)囊镯樞颍梢灾笇?dǎo)位點(diǎn)特異性誘變得到得自toxA基因的重組突變PMT編碼順序，在該基因中，分別通過置換改變、缺失或插入了一個(gè)或更多個(gè)預(yù)先選擇的特異性密碼子。舉一個(gè)典型的例子，可以選擇誘變策略，從而導(dǎo)致toxA基因的某個(gè)限制位點(diǎn)(如獨(dú)特EcoRI限制位點(diǎn))下游的一個(gè)或更多個(gè)密碼子發(fā)生置換、缺失或插入。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該方法步驟(ⅱ)的誘變處理引起至少一個(gè)編碼1131-1285位之間某個(gè)氨基酸的密碼子被一個(gè)編碼不同氨基酸的密碼子置換。在本發(fā)明的一個(gè)具體的有用實(shí)施方案中，誘變處理引起toxA基因的至少一個(gè)編碼1175-1285位間(如1200-1230位間)某個(gè)氨基酸的密碼子的置換。
因此，通過選擇步驟(ⅱ)中的誘變處理，從而使所分離的PMT編碼基因的至少一步誘變引起至少2個(gè)密碼子(如至少3個(gè)密碼子)的置換，可以得到有用的rmPMT。采用步驟(ⅱ)的誘變處理導(dǎo)致至少4個(gè)密碼子的置換，也可以得到有用蛋白。利用如上限定的命名法，通過一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換產(chǎn)生的toxA基因位點(diǎn)特異性突變的典型實(shí)例包括SV1201、HL1202、QL1203、HY1205、TV1206、TV1207、HY1223、HY1228、HL1202HY1205、HY1202HY1223、HL1202HY1228、HY1205HY1223、HY1205HY1228、HY1223HY1228和4HX(HL1202HY1205HY1223HY1228)。
所要置換的密碼子的選擇可以根據(jù)個(gè)別氨基酸的已知特性來進(jìn)行，例如其疏水/親水特性或其電荷。選擇用具有特別有用的物理特性的氨基酸置換一個(gè)或更多個(gè)氨基酸，會(huì)使由這種突變DNA順序編碼的rmPMT在下游過程中變得特別容易純化和回收。對(duì)一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換來說，一個(gè)更重要的選擇標(biāo)準(zhǔn)是由特異性氨基酸置換所致的上述rmPMT毒性降低的程度，以及被置換氨基酸與置換氨基酸之間的結(jié)構(gòu)相似性。
舉一個(gè)有用的實(shí)例，被置換的密碼子可以是編碼選自絲氨酸、組氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸的氨基酸的密碼子，而置換密碼子則可以是編碼選自纈氨酸、亮氨酸或酪氨酸的氨基酸的密碼子。據(jù)認(rèn)為，用疏水性氨基酸置換親水性氨基酸，可以得到有用的rmPMT。
在另一個(gè)有用的實(shí)施方案中，步驟(ⅱ)的誘變處理可以加以選擇，從而使至少一個(gè)編碼1131-1285位間某個(gè)氨基酸的密碼子缺失。這種缺失優(yōu)選涉及至少一個(gè)編碼1175-1285位間某個(gè)氨基酸的密碼子，例如缺失至少一個(gè)編碼1215-1285位間某個(gè)氨基酸的密碼子。
按照本發(fā)明，選擇本文所限定方法中步驟(ⅱ)的誘變處理，引起至少2個(gè)密碼子(例如至少3個(gè)密碼子)缺失，可以根據(jù)與上述相同的選擇標(biāo)準(zhǔn)得到有用的rmPMT。利用步驟(ⅱ)的誘變處理導(dǎo)致至少4個(gè)密碼子(例如至少7個(gè)密碼子)缺失，也可以得到有用的rmPMT蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，缺失的密碼子是編碼選自組氨酸、賴氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密碼子。通過缺失編碼PMT的toxA基因的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸而得到的有用rmPMT的實(shí)例包括△H1223和△1215-1221，參見前面定義的命名法。
在旨在通過一個(gè)或更多個(gè)密碼子的缺失獲得rmPMT的實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建位點(diǎn)特異性缺失突變體DNA順序的過程中，可能會(huì)發(fā)生與密碼子的直接缺失有同樣作用的移碼。例如，表Ⅱ中稱為△1257-1285的rmPMT，由于toxA基因的3986號(hào)胸苷殘基(即編碼1256號(hào)氨基酸殘基的密碼子中的第三個(gè)堿基)缺失，造成1256位氨基酸之后有11個(gè)氨基酸殘基的碼外(out-of-frame)延伸。
在本發(fā)明的另一個(gè)有用的實(shí)施方案中，步驟(ⅱ)的誘變處理引起在編碼1131-1285位之間某個(gè)氨基酸的密碼子的下游插入至少一個(gè)密碼子，密碼子的插入優(yōu)選發(fā)生在編碼1175-1285位間某個(gè)氨基酸的密碼子的下游，例如編碼1200-1230位間某個(gè)氨基酸的密碼子的下游。
由一個(gè)或更多個(gè)密碼子的插入得到的rmPMT一般可包含至少2個(gè)密碼子(如至少3個(gè)密碼子)的插入，更為優(yōu)選的是可包含至少4個(gè)密碼子的插入。所插入的密碼子最好是編碼甘氨酸的密碼子。這類有用rmPMT的實(shí)例包括+G1203和+GG1203。
如前面也已提到的，本發(fā)明方法的步驟(ⅲ)包括使由步驟(ⅱ)得到的突變DNA順序插入合適的復(fù)制子中，復(fù)制子的有用實(shí)例包括原核和真核細(xì)胞染色體、質(zhì)粒、線粒體、病毒和葉綠體，插入利用標(biāo)準(zhǔn)重組方法進(jìn)行。
在這方面，質(zhì)?？赡苁欠奖愕膹?fù)制子。合適質(zhì)粒的選擇可以受公知原則的指導(dǎo)，這些原則包括質(zhì)粒在大范圍的宿主生物中復(fù)制的能力，或者在宿主細(xì)胞中以高拷貝數(shù)存在的能力。一種特別有用類型的質(zhì)粒可能是顯示“逃跑”(runaway)復(fù)制行為的質(zhì)粒?？捎糜诒景l(fā)明的質(zhì)粒的實(shí)例包括選自pSPE680、pSPE888、pSPE900、pSPE1003、pSPE1020、pSPE1038、pSPE1134和pSPE1234的質(zhì)粒。
在本文所限定方法的后續(xù)步驟(ⅳ)中，用該方法步驟(ⅲ)得到的復(fù)制子轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在該細(xì)胞中，復(fù)制子能夠復(fù)制，含上述突變toxA基因的DNA順序能夠表達(dá)。允許復(fù)制子復(fù)制和編碼rmPMT的突變基因表達(dá)的合適宿主細(xì)胞，可以從包括細(xì)菌在內(nèi)的原核細(xì)胞中選擇，也可以從包括酵母、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如人細(xì)胞培養(yǎng)物)和植物細(xì)胞在內(nèi)的真核細(xì)胞中選擇。在這方面，方便的宿主細(xì)胞可從革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌屬中選擇，例如芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬，也可從革蘭氏陰性菌中選擇，包括選自腸桿菌科的物種(其實(shí)例包括大腸桿菌)，以及選自假單胞菌科和弧菌科的物種。
為制備rmPMT，在能使突變toxA基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中收集重組突變蛋白。培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、通氣和批量大小的選擇，取決于所選擇的宿主細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件的具體要求，以及調(diào)控toxA基因表達(dá)的DNA順序的本質(zhì)。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是在表達(dá)突變toxA基因時(shí)向培養(yǎng)基內(nèi)分泌rmPMT蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在這種情況下，可以通過直接從培養(yǎng)基中回收來收集蛋白，并任選用離心或過濾法除去細(xì)胞后收集。從培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)可以用任何常規(guī)蛋白回收方法進(jìn)行。另外，宿主細(xì)胞也可以是那些所表達(dá)出的rmPMT在周質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)累積的宿主細(xì)胞。使用這類宿主細(xì)胞時(shí)，rmPMT收集步驟包括進(jìn)行某種處理而使細(xì)胞破碎到使累積的rmPMT蛋白從細(xì)胞中釋放的程度。這樣一種處理可以選自機(jī)械的或化學(xué)的細(xì)胞解體處理、滲透壓處理或用細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜降解酶處理。
在本發(fā)明方法的一個(gè)方便的實(shí)施方案中，收集rmPMT的步驟包括從培養(yǎng)基中分出細(xì)胞，對(duì)分出的細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，并除去細(xì)胞碎片。以這種方式得到含蛋白的細(xì)胞粗提液。但是，這樣一種細(xì)胞粗提液將含有污染性的天然細(xì)菌蛋白和所表達(dá)的rmPMT的混合物。應(yīng)該理解，這樣一種rmPMT粗制備物不太適于直接作為疫苗成分使用。因此，本方法優(yōu)選包括細(xì)胞粗提液的純化作為進(jìn)一步的步驟。
按照本發(fā)明，合適的具體蛋白純化方法可以包括能使所要純化的蛋白與污染蛋白(優(yōu)選還有其他物質(zhì))分開的任何選擇性蛋白純化方法。這類公知方法的例子可以提到親和色譜法，在該方法中使特異性蛋白與能與蛋白選擇性結(jié)合的物質(zhì)結(jié)合。這種物質(zhì)可以是單克隆或多克隆抗體，或者合適的聚合物，包括Sepharose。親和色譜中的結(jié)合力，可以是氫鍵形成、疏水性相互作用、共價(jià)鍵形成或抗原抗體復(fù)合物形成過程中所涉及到的力。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，rmPMT的純化包括陰離子交換色譜，包括下文中所例舉的方法。這種色譜法通常要涉及使用洗脫劑，一般是溶于緩沖液中的鹽，如NaCl。
在本發(fā)明的合適實(shí)施方案中，如上所限定的方法是一種陰離子交換色譜和一種疏水性相互作用色譜，前者包括用NaCl濃度從0遞增至1000mM的緩沖液進(jìn)行洗脫的步驟，后者則可以包括用硫酸銨濃度遞減的緩沖液進(jìn)行洗脫的步驟。一般要分析這些離子強(qiáng)度遞增或遞減的流出液中相對(duì)于蛋白總含量的rmPMT含量(即rmPMT的純度)，據(jù)此，可以選擇能得到最高rmPMT含量的洗脫劑離子強(qiáng)度。使用本文所例舉的陰離子交換色譜法時(shí)，在約700mM NaCl時(shí)收集的流出液達(dá)到最高純度。
純化過程優(yōu)選以一步進(jìn)行，例如包括一個(gè)合適洗脫步驟的陰離子交換色譜。要得到純度特別高的重組突變PMT蛋白時(shí)，可能需要使用兩種或更多種純化方法，這些純化方法選自陰離子交換色譜、疏水性相互作用色譜和抗體親和色譜。因此，合適的純化步驟可以包括包括上述洗脫步驟在內(nèi)的初始陰離子交換色譜，其后再進(jìn)行對(duì)來自前一步驟且含有高濃度rmPMT的流出液進(jìn)行疏水性相互作用色譜的步驟。
如上所述，希望獲得高純度的rmPMT制備物。據(jù)此，優(yōu)選獲得按總蛋白計(jì)算純度至少為50%(重量)的流出液，更為優(yōu)選的是至少75%(重量)，更優(yōu)選的是至少90%(重量)，最優(yōu)選的是至少94%(重量)，特別是至少98%(重量)。
從工業(yè)生產(chǎn)成本的觀點(diǎn)看，特別重要的是要從包括下游過程在內(nèi)的制備過程中獲得高產(chǎn)率的重組突變r(jià)mPMT蛋白。在本文本中，rmPMT的產(chǎn)率定義為由該方法獲得的純r(jià)mPMT蛋白相對(duì)于表達(dá)所述蛋白的宿主細(xì)胞的粗提液中總蛋白含量的量。因此，按細(xì)胞粗提液的總蛋白含量計(jì)算，本方法所達(dá)到的突變重組蛋白產(chǎn)率至少為1%(重量)，更優(yōu)選的是至少2%(重量)，例如至少3.5%(重量)，更優(yōu)選的是至少5%(重量)，最優(yōu)選的是至少7.5%(重量)，特別優(yōu)選的是至少10%(重量)，例如至少12.5%(重量)，最特別優(yōu)選的是至少15%(重量)。
如上所述，本發(fā)明的再一方面涉及編碼本文所限定的重組突變PMT蛋白的DNA順序，所述DNA順序是由一個(gè)包含出血敗血性巴斯德氏菌toxA基因的復(fù)制子，通過按本文所述方法進(jìn)行的所述toxA基因中一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到的。如果重組突變PMT是如上所述的融合蛋白，則上述DNA還可包含一個(gè)編碼第二免疫原性蛋白的順序，所述順序通過截短的或突變的toxA基因與編碼第二蛋白的順序碼內(nèi)融合而與得自toxA的基因相連，從而導(dǎo)致本文所述的融合蛋白基因產(chǎn)物的表達(dá)。
該DNA順序還可包含一個(gè)啟動(dòng)子順序和一個(gè)調(diào)控位點(diǎn)特異性突變toxA基因表達(dá)的順序。啟動(dòng)子順序宜為與天然toxA基因天然相連的啟動(dòng)子，但也可以是與所述基因非天然相連的啟動(dòng)子順序。
突變r(jià)mPMT編碼基因的表達(dá)可以在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)譯水平上進(jìn)行調(diào)控。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可以以轉(zhuǎn)錄阻遏物的形式出現(xiàn)，這種阻遏物可能包括起反向作用的TxaR阻遏蛋白，該蛋白是在產(chǎn)PMT出血敗血性巴斯德氏菌的野生型菌株中表達(dá)的。編碼rmPMT調(diào)控阻遏物的DNA順序可以任選地受一個(gè)調(diào)控順序調(diào)控，該調(diào)控順序以可操縱方式與編碼阻遏物的基因相連。這種調(diào)控順序可以是溫度敏感性順序，如λcI順序。
rmPMT編碼基因可進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄后水平上進(jìn)行調(diào)控，例如由于與rmPMT mRNA雜交的反義mRNA的存在而受到調(diào)控。
如前面所提到的，本發(fā)明的另一方面提供一種攜有如上所限定的DNA順序并按上述方法制備的復(fù)制子，其典型有用實(shí)例是選自如下質(zhì)粒的復(fù)制子編碼突變重組蛋白HL1202HY1205HY1223HY1228(4HX)的質(zhì)粒pSPE1038，該質(zhì)粒于1992年9月1日保藏在DSM，保藏號(hào)為DSM7221;編碼rmPMT+GG1203的質(zhì)粒pSPE1020;編碼1132″β-gal的質(zhì)粒pSPE1134;編碼rmPMT △H1223的質(zhì)粒pSPE1234。后三個(gè)質(zhì)粒于1993年9月9日保藏在DSM，保藏號(hào)分別為DSM8548、DSM8546和DSM8547。pSPE1038、pSPE1020、pSPE1234和pSPE1134也已保藏在CCTCC(中國(guó)武漢武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。
本發(fā)明的其他方面涉及按本文所述方法用本文所述復(fù)制子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述復(fù)制子在該細(xì)胞中能夠復(fù)制;還涉及本文所述的突變重組蛋白作為疫苗的應(yīng)用，該疫苗用于預(yù)防由產(chǎn)毒素出血敗血性巴斯德氏菌引起的疾病。
rmPMT作為疫苗使用時(shí)，一般以疫苗組合物形式存在，該組合物任選包含免疫學(xué)上可接受的載體及任選的其他成分，例如佐劑，包括弗氏不完全佐劑或完全佐劑，以及凝膠態(tài)的氧化鋁;防腐劑;緩沖鹽。含rmPMT的疫苗組合物可以是水懸浮液，也可以是冰凍干燥的組合物。含rmPMT的組合物所含的rmPMT的量在常用的疫苗劑量中能達(dá)到其免疫有效量，這一數(shù)量一般取決于所要接種的特定動(dòng)物。
本發(fā)明以下列非限制性實(shí)施例和附圖來進(jìn)一步說明，在附圖中圖1是用于出血敗血性巴斯德氏菌toxA基因定位誘變的質(zhì)粒pSPE312、pSPE680和pSPE1003的示意圖。斜線區(qū)表示toxA基因，涂黑區(qū)表示載體DNA，其他出血敗血性巴斯德氏菌DNA則用空白區(qū)表示;
圖2示出重組出血敗血性巴斯德氏菌毒素(rPMT)(即，由SPE1036中的toxA基因編碼的PMT)對(duì)NIH 3T3細(xì)胞增殖作用(PE)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線示出不同濃度rPMT的增殖作用(PE)。將含rPMT的SPE1036全細(xì)胞提取液稀釋，以不同的量加到亞匯合NIH 3T3細(xì)胞中。如實(shí)施例2所述計(jì)算PE。用純化rPMT(參見實(shí)施例3)測(cè)定20μg/ml rPMT的DE;
圖3說明重組突變PMT蛋白(rmPMT)的增殖作用，這些rmPMT是由toxA通過單次定位誘變引起氨基酸置換、插入或缺失，或者通過toxA的亞順序與lacZ融合而得到的。測(cè)定含不同rmPMT的全細(xì)胞提取液對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的PE;
圖4概括了由toxA通過連續(xù)的定位誘變引起多重氨基酸置換而得到的重組突變PMT蛋白(rmPMT)的PE;
圖5示出一塊經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠，該凝膠顯示了產(chǎn)4HX、衍生物O和rPMT的大腸桿菌MC1000(dam)的蛋白圖形。在指數(shù)生長(zhǎng)后期(lx)、指數(shù)生長(zhǎng)后期和靜止期之間(lxs)、靜止早期(es)和靜止后期(ls)取培養(yǎng)物樣品。每條泳道下面標(biāo)出了樣品中rmPMT或rPMT的相對(duì)量。
圖6示出含rPMT大腸桿菌粗提液的Q-Sepharose陰離子交換色譜的色譜圖。斜線區(qū)表示含高純度rPMT的組分;
圖7示出含rPMT大腸桿菌粗提液Q-Sepharose色譜過程中收集的各組分的SDS-PAGE分析。對(duì)含10%聚丙烯酰胺的凝膠進(jìn)行銀染色。A板泳道1和B板泳道1細(xì)菌粗提液;A板泳道2-11分別為組分9、13、29、33、35、37、39、41、43和45;B板泳道2-11分別為組分47、49、51、53、55、57、59、61、63和67。rPMT的位置用箭頭表示;
圖8A說明由大腸桿菌粗提液通過陰離子交換色譜(步驟1)和疏水性相互作用色譜(步驟2)純化rPMT。對(duì)10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1分子量標(biāo)記;泳道2細(xì)菌粗提液;泳道3步驟(1)的流出液;泳道4步驟(1)的并集液;泳道5步驟(2)的流出液;泳道6步驟(2)的并集液，即純化過程得到的最終產(chǎn)物。rPMT的位置用箭頭標(biāo)出。
圖8B說明通過陰離子交換色譜(步驟1)和疏水性相互作用色譜(步驟2)純化4HX(泳道2-4)和rPMT(泳道5-7)。對(duì)10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1分子量標(biāo)記;泳道2和5分別為含4HX或rPMT的細(xì)菌粗提液;泳道3和6步驟(1)的并集液;泳道4和7步驟(2)的并集液，即純化過程得到的最終產(chǎn)物。4HX的位置用箭頭標(biāo)出。
圖9說明rPMT的純化。用SDS-PAGE(10%凝膠，銀染色)分析純化rPMT制備物的二倍稀釋液。泳道1分子量標(biāo)記;泳道2-8分別為稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍的純化rPMT。rPMT的位置用箭頭標(biāo)出。
圖10示出含衍生物O(dO)大腸桿菌粗提液Q-Sepharose陰離子交換色譜的色譜圖。斜線區(qū)表示富含dO(按這些組分的SDS-PAGE結(jié)果推出，參見圖11)并合并起來供進(jìn)行進(jìn)一步純化的組分;
圖11示出在含dO大腸桿菌粗提液Q-Sepharose色譜過程中收集的各組分的SDS-PAGE分析。對(duì)10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染色。A板泳道1和B板泳道11細(xì)菌粗提液;A板泳道2-11分別為組分8、12、30、32、34、36、38、40、42和44;B板泳道1-10分別為組分46、48、50、52、54、56、58、60、64和66。dO的位置用箭頭標(biāo)出;
圖12說明通過陰離子交換色譜(步驟1)和疏水性相互作用色譜(步驟2)從大腸桿菌粗提液中純化衍生物O的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1和5分子量標(biāo)記;泳道2細(xì)菌粗提液;泳道3步驟1的并集液;泳道4步驟2的并集液。衍生物O的位置用箭頭標(biāo)出。
圖13示出含4HX大腸桿菌粗提液Q-Sepharose陰離子交換色譜的色譜圖。斜線區(qū)表示將要合并并含有高純度4HX(按這些組分的SDS-PAGE分析結(jié)果得知，參見圖14)的組分;
圖14在含4HX蛋白的大腸桿菌粗提液Q-Sepharose色譜過程中收集的各組分的SDS-PAGE分析。對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染色。A板泳道1和B板泳道1細(xì)菌粗提液;A板泳道2-11;分別為組分9、12、31、34、36、39、41、43、45和47;B板泳道2-11分別為組分49、51、53、55、57、63、66、69和71。4HX的位置用箭頭標(biāo)出;
圖15是一塊經(jīng)銀染色的10% SDS PAGE凝膠，說明通過陰離子交換色譜(步驟1)和疏水性相互作用色譜(步驟2)從大腸桿菌粗提液中純化4HX。泳道1分子量標(biāo)記;泳道2細(xì)菌粗提液;泳道3步驟1的流出液;泳道4步驟1的并集液;泳道5步驟2的流出液;泳道6步驟2的并集液，即最終純化產(chǎn)物。4HX的位置用箭頭標(biāo)出。
圖16示出純化4HX的SDS-PAGE分析。對(duì)純化4HX制備物的兩倍稀釋液進(jìn)行分析。對(duì)10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1分子量標(biāo)記;泳道2-8分別為稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍的純化4HX。4HX的位置用箭頭標(biāo)出。
圖17說明含4HX的大腸桿菌粗提液的制備規(guī)模Q-Sepharose陰離子交換色譜。斜線區(qū)表示含高純度4HX(根據(jù)所收集組分的SDS-PAGE分析結(jié)果得知)并合并的各組分;
圖18示出通過陰離子交換色譜(步驟1)和疏水性相互作用色譜(步驟2)對(duì)4HX進(jìn)行制備規(guī)模純化的結(jié)果。對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1和6分子量標(biāo)記;泳道2含4HX的細(xì)菌粗提液;泳道3步驟1的流出液;泳道4步驟1的并集液;泳道5步驟2的并集液，即終產(chǎn)物。4HX的位置用箭頭標(biāo)出。
圖19示出由圖8所示的兩步制備規(guī)模純化得到的純化4HX二倍稀釋液的SDS-PAGE分析。10% SDS-PAGE凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。泳道1分子量標(biāo)記;泳道2-8分別為稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍的純化4HX。4HX的位置用箭頭標(biāo)出。
圖20示出純化4HX的SDS-PAGE分析和免疫印跡。樣品在10%凝膠上進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上。將印跡與抗PMT多克隆兔抗體一起保溫，然后與堿性磷酸酶結(jié)合的豬抗兔免疫球蛋白(DAKO、Denmark，代號(hào)D-306)，并對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行染色。泳道1純化的rPMT(0.15μg，陽(yáng)性對(duì)照);泳道2實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化的4HX(0.3μg);泳道3制備規(guī)模純化的4HX(1.1μg);泳道4在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組核酸酶，分子量為30，000(3μg，陰性對(duì)照)。分子量標(biāo)在左側(cè)。
圖21示出rPMT、衍生物O和4HX在37℃保溫過程中的穩(wěn)定性。純化的rPMT、衍生物O和4HX在37℃下保溫。在0時(shí)刻(對(duì)照)及24和48小時(shí)后取樣在含10%聚丙烯酰胺的凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析。對(duì)凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1和11分子量標(biāo)記;泳道2-4rPMT;泳道5-7衍生物O;泳道8-104HX。泳道2、5和8對(duì)照;泳道3、6和924小時(shí);泳道4、7和1048小時(shí)。
圖22示出rPMT在與胰蛋白酶一起保溫過程中的穩(wěn)定性。將純化rPMT的等份試樣與1%、2%或5%(重量)的胰蛋白酶混合，并在37℃下保溫24小時(shí)。樣品如圖21說明中所述進(jìn)行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量標(biāo)記;泳道2未加胰蛋白酶在37℃保溫的純化rPMT(對(duì)照);泳道3、4和5分別加1%、2%、5%胰蛋白酶。rPMT的位置用箭頭標(biāo)出。
圖23示出4HX在與胰蛋白酶保溫過程中的穩(wěn)定性。將純化4HX的等份試樣與1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保溫24小時(shí)。樣品如前面圖21說明中所述進(jìn)行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量標(biāo)記;泳道2未加胰蛋白酶在37℃保溫的純化4HX(對(duì)照);泳道3、4和5分別加1%、2%和5%胰蛋白酶。4HX的位置用箭頭標(biāo)出。
圖24示出用免疫親和色譜法純化出的衍生物O在與胰蛋白酶保溫過程中的穩(wěn)定性。將純化衍生物O的等份試樣與1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保溫24小時(shí)。如前面圖21中的說明所述對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量標(biāo)記;泳道2未加胰蛋白酶在37℃下保溫的純化衍生物O(對(duì)照);泳道3、4和5分別加1%、2%和5%胰蛋白酶。衍生物O的位置用箭頭標(biāo)出。
圖25示出用Q-Sepharose和Phenyl Sepharose色譜法富集的衍生物O在與胰蛋白酶保溫過程中的穩(wěn)定性。將富集的衍生物O的等份試樣與1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保溫24小時(shí)。如前面圖21說明中所述對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量標(biāo)記;泳道2未加胰蛋白酶在37℃下保溫的濃集衍生物O(對(duì)照);泳道3、4和5分別加1%、2%和5%胰蛋白酶。衍生物O的位置用箭頭標(biāo)出。
圖26示出含+GG1203大腸桿菌粗提液Q-Sepharose陰離子交換色譜的色譜圖。斜線區(qū)表示含高純度+GG1203的組分。
圖27示出含+GG1203大腸桿菌粗提液Q-Sepharose色譜過程中收集的選定組分的SDS-PAGE分析。對(duì)含10%聚丙烯酰胺的凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1和13分子標(biāo)記;泳道2細(xì)菌粗提液;泳道3-12分別為組分55、56、57、58、59、60、61、62、63和64。+GG1203的位置用箭頭標(biāo)出。
圖28說明通過陰離子交換色譜(步驟1)和疏水性相互作用色譜(步驟2)從大腸桿菌粗提液中純化+GG1203。對(duì)10% SDS PAGE凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1和5分子量標(biāo)記;泳道2細(xì)胞粗提液;泳道3步驟1的并集液;泳道4步驟2的并集液，即最終純化產(chǎn)物。
圖29示出純化+GG1203的SDS-PAGE分析。利用SDS-PAGE(10%凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色)分析純化+GG1203制備物的兩倍稀釋液。泳道1和8分子量標(biāo)記;泳道2-7分別為稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍的純化+GG1203。
圖30示出含△H1223大腸桿菌粗提液Q-Sepharose陰離子交換色譜的色譜圖。斜線區(qū)表示含高純度△H1223的組分。
圖31說明通過陰離子交換色譜(步驟1)和疏水性相互作用色譜(步驟2)從大腸桿菌粗提液中純化△H1223。對(duì)10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1和6分子量標(biāo)記;泳道2和3分別為稀釋2倍和4倍的細(xì)菌粗提液;泳道4步驟1的并集液;泳道5步驟2的并集液，即最終純化產(chǎn)物。
圖32示出純化△H1223的SDS-PAGE分析。利用SDS-PAGE(10%凝膠，銀染色)分析純化△H1223制備物的二倍稀釋液。泳道1和8分子量標(biāo)記;泳道2-7分別為稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍的純化△H1223。
圖33說明1132″β-gal的純化。泳道1分子量標(biāo)記;泳道2、3和4分別為稀釋2倍、4倍和8倍的細(xì)菌粗提液;泳道5APTG親和純化的1132″β-gal。1132″β-gal的位置用箭頭標(biāo)出。
圖34示出+GG1203對(duì)胰蛋白酶的耐受性。使純化+GG1203的等份試樣與1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并于37℃下保溫24小時(shí)。對(duì)照樣品不加胰蛋白酶而在37℃下保溫24小時(shí)。保溫后，樣品在含10%聚丙烯酰胺的凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析。對(duì)凝膠進(jìn)行銀染色。泳道1和7分子量標(biāo)記;泳道2純化的+GG1203;泳道3對(duì)照;泳道4、5和6分別加1%、2%和5%(重量)胰蛋白酶。
圖35示出△H1223對(duì)胰蛋白酶的耐受性。將純化△H1223的等份試樣與1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保溫24小時(shí)。對(duì)照樣品不加胰蛋酶而在37℃下保溫24小時(shí)。保溫后，如前面附圖34說明中所述對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。泳道1和7分子量標(biāo)記;泳道2純化的△H1223;泳道3對(duì)照;泳道4、5和6分別加1%、2%和5%(重量)胰蛋白酶。
圖36示出1132″β-gal對(duì)胰蛋白酶的敏感性。將純化1132″β-gal的等份試樣與1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保溫24小時(shí)。對(duì)照樣品不加胰蛋白酶而在37℃下保溫24小時(shí)。保溫后，如前面附圖34說明中所述對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。泳道1和7分子量標(biāo)記;泳道2純化的1132″β-gal;泳道3對(duì)照;泳道4、5和6分別加1%、2%和5%(重量)胰蛋白酶。
圖37示出用frPMT和4HX免疫的動(dòng)物的抗rPMT血清滴度。Log2滴度對(duì)免疫劑量作圖。
圖38示出用4HX、+GG1203和1132″β-gal免疫的動(dòng)物的抗rPMT血清滴度。Log2滴度對(duì)免疫劑量作圖。
圖39示出用4HX和△H1223免疫的動(dòng)物的抗rPMT血清滴度。Log2滴度對(duì)免疫劑量作圖。
實(shí)施例1在出血敗血性巴斯德氏菌toxA基因的3′端引入位點(diǎn)特異性突變?cè)趖oxA基因3′端獨(dú)特EcoRI限制位點(diǎn)的下游引入定位突變。每種情況下都是用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增法得到帶有所要突變的DNA片段。
用大腸桿菌菌株DH5α(supE44、△lacU169(φ80lacZM15)、hsdR17、recA1、endA1、gyrA96、thi-1、relA1)(Hanahan，D.“用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的研究”，J.Mol.Biol.166557，1983)作為各種質(zhì)粒的宿主。
用毒素編碼質(zhì)粒pSPE312(Petersen S.K.等，“出血敗血性巴斯德氏菌毒素的重組衍生物，抗進(jìn)行性萎縮性鼻炎疫苗的候選者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)、pSPE680(出處同上)、和pSPE1003來克隆PCR片段(參見圖1)。pSPE1003是pSPE680去掉toxA基因外限制酶識(shí)別位點(diǎn)后的衍生物。因此，這一質(zhì)粒的toxA基因內(nèi)EcoRI位點(diǎn)是獨(dú)特的。pSPE1003的構(gòu)建方法是用RcoRI部分限制性消化pSPE680，從瓊脂糖凝膠中分離線性化質(zhì)粒，在所有四種脫氧核糖核苷酸存在下用T4 DNA聚合酶處理分離出的片段，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α。
限制酶、T4 DNA連接酶和T4 DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs，Inc.MA，并按制造商所推薦的方法使用。用Geneclean(BIO101 Inc.，CA)法從瓊脂糖凝膠中分離DNA。簡(jiǎn)言之，該方法用于1)用4M NaI溶解含DNA的瓊脂糖;2)利用DNA與硅膠基質(zhì)的親和性提取DNA。
在Cyclone DNA合成儀(Biosearch Inc.，CA)上合成寡聚脫氧核糖核苷酸。表Ⅰ列出用于引入突變的引物DNA順序(位置編號(hào)同Petersen，S.K.，“出血敗血性巴斯德氏菌毒素基因的完整核苷酸順序及轉(zhuǎn)錄阻遏物TxaR的證據(jù)”，Mol.Microbiol.4821-830，1990)。
表Ⅰ用于定位誘變的寡聚脫氧核糖核苷酸。
寡核苷酸在相關(guān)野生型DNA和氨基酸順序(分別為3801-3938位和1195-1240位)下面列出(編號(hào)同Petersen等，1990)。每個(gè)寡核苷酸的名稱和它所引入的突變都劃了下線。
突變特異性引物用它們所引入的氨基酸改變來命名(見下文及表Ⅱ)。NsiIcw引物與toxA順序中的頭一個(gè)NsiI限制位點(diǎn)附近的2109-2129位雜交。PstIccw引物與Pharmacia LKB Biotechnology(Sweden)的pBR322 PstI引物PⅡ相同。在AB引物中，頭半部分(A部分)與具有20堿基隨機(jī)選擇順序的A引物相同，后半部分(B部分)則與toxA的3580-3600位相同。引物C和D的順序分別與toxA的4282-4257位、4105-4084位相同。
下表Ⅱ列出了rmPMT和概括的定位誘變參數(shù)，每一重組突變PMT蛋白(rmPMT)給出了以下情況1)氨基酸改變;2)重組突變體的菌株號(hào);3)用于誘變和擴(kuò)增的PCR引物;4)相應(yīng)的PCR模板;5)用于消化擴(kuò)增DNA片段和載體DNA的限制酶;6)克隆載體的名稱。rmPMT的名稱系指由有關(guān)密碼子編碼的野生型和突變型氨基酸，用標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼表示。例如，產(chǎn)生SV1201的突變體所帶有的突變是把已公開的toxA順序中的1201號(hào)絲氨酸密碼子變?yōu)槔i氨酸密碼子。類似地，產(chǎn)生+G1203的突變體帶有一個(gè)插入突變，該突變引入一個(gè)甘氨酸密碼子作為1203號(hào)密碼子;產(chǎn)生△1215-1221的突變體具有1215-1221號(hào)密碼子的缺失。這一命名法的唯一例外是△1257-1285，該蛋白是由一個(gè)攜有移碼的質(zhì)粒編碼的，這一質(zhì)粒是在其他質(zhì)粒的構(gòu)建過程中偶然制得并分離出來的?！?257-1285在1256號(hào)殘基后有一個(gè)11個(gè)氨基酸殘基的無(wú)義延伸。
表Ⅱ rmPMT的列舉及定位誘變參數(shù)的概括對(duì)每一個(gè)重組突變PMT蛋白(rmPMT)(第一欄)都給出了相應(yīng)的rmPMT生產(chǎn)株(第二欄)、突變特異性和一般性PCR引物(第三欄)、PCR模板(第四欄)，同時(shí)也給出了用于克隆步驟的限制酶(第五欄)和載體(第六欄)(各構(gòu)建方法的詳細(xì)敘述見正文)。標(biāo)有星號(hào)的寡核苷酸(第三欄)引入第五欄中給出的限制酶的識(shí)別位點(diǎn)。
如表Ⅱ所總結(jié)的，所有突變株都是通過對(duì)PCR擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行重組克隆而構(gòu)建的。除SPE888、SPE900和SPE1038外，它們都是按基本上如Nelson和Long所述的方法構(gòu)建的(Nelson，R.M.和G.L.Long，“用經(jīng)過修改的水生嗜熱菌聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變的一般方法”，Anal.Biochem.180147-151，1989)。簡(jiǎn)言之，這一方法涉及使用4個(gè)引物，其中一個(gè)是突變特異性的，另外三個(gè)是為使突變DNA能特異性擴(kuò)增而設(shè)計(jì)的。這是用下述方法來完成的。
在Techne Programmable Dri-Block PHC-1(Techne Ltd.，UK)或Hybaid熱反應(yīng)器(Hybaid Ltd.，UK)中，在100μl反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行PCR，并用20μl礦物油M3516(Sigma Chemical Co.，MO)覆蓋。反應(yīng)緩沖液中含10mM Tris HCl pH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl2、0.01%(w/v)明膠、每種dNTP 200μM、2.5單位水生嗜熱菌(Taq)聚合酶(Ampli Taq，Perkin Elmer，CT)。每次循環(huán)包括變性(95℃ 2分鐘)、退火(37℃ 2分鐘)和聚合(72℃ 3分鐘)。在所有情況下，在1毫微微摩爾模板DNA上進(jìn)行的第一次PCR擴(kuò)增(30次循環(huán))中，都使用突變特異性引物(100皮摩爾)和AB引物(100皮摩爾)。然后約0.6皮摩爾的PCR產(chǎn)物和1毫微微摩爾模板進(jìn)行92℃ 5分鐘、37℃ 2分鐘、72℃ 10分鐘的單次循環(huán)。這最后一步導(dǎo)致質(zhì)粒模板上只沿順時(shí)針方向伸長(zhǎng)，因?yàn)锳B引物的A部分沒有模板同源性，因此其互補(bǔ)順序不能在逆時(shí)針方向引發(fā)DNA合成。
然后用這一伸長(zhǎng)產(chǎn)物在進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中作為模板，在該擴(kuò)增反應(yīng)中，將引物A和C或Pstccw(各100皮摩爾)加到反應(yīng)混合物中，再進(jìn)行30次循環(huán)以實(shí)現(xiàn)突變DNA的特異性擴(kuò)增。用以下方法克隆該產(chǎn)物用指定的限制酶(表Ⅱ)消化載體和PCR產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶連接這些DNA的混合物，用Hanahan的方法(Hanahan，D.，“用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的研究”，J.Mol.Biol.166557，1983)轉(zhuǎn)化DH5α株。
要構(gòu)建SPE888、SPE900和SPE1038，則采用不同的方法，因?yàn)橥蛔兲禺愋砸風(fēng)1202和L1202 Y1205引入有用的限制位點(diǎn)(分別為一個(gè)NsiI位點(diǎn)和一個(gè)PstI位點(diǎn))。用如下的簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增法構(gòu)建SPE888和SPE900(分別編碼 HL1202或HL1202HY1205)2μg模板;每種引物各0.9μg;4次變性(95℃ 2.5分鐘)、退火(52℃ 2.5分鐘)和聚合(72℃ 10分鐘)循環(huán);如上所訂克隆擴(kuò)增出的片段。
以三步法構(gòu)建SPE1038第一步，用引物L(fēng)1202Y1205和Y1223Y1228(各10μg)作引物在用Hind Ⅲ切割過的50ng模板pSPE900 DNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增20次變性(95℃ 2.5分鐘)、退火(60℃ 2.5分鐘)和聚合(72℃ 10分鐘)循環(huán);第二步，用0.5μg用Hind Ⅲ切割過的pSPE900 DNA作為模板使PCR產(chǎn)物伸長(zhǎng)1次循環(huán)(95℃ 5分鐘、30℃ 2分鐘、70℃ 10分鐘);最后一步，加入0.9μg Pstccw引物，并再進(jìn)行20次循環(huán)(95℃ 2分鐘、35℃ 2分鐘、72℃ 2分鐘)。如上所述克隆產(chǎn)物。
利用雙鏈質(zhì)粒DNA和測(cè)序酶2.0版本方法(United States Biochemical Corporation，Ohio)，測(cè)定整個(gè)克隆PCR擴(kuò)增片段的DNA順序。所用的測(cè)序酶相應(yīng)于toxA的下列編號(hào)的核苷酸2089-2107、2400-2417、2683-2701、3004-3024、3303-3321、3580-3600、4105-4084(表Ⅰ中的引物D)。下列實(shí)驗(yàn)中所用的突變株，除了兩個(gè)菌株中的靜息第三位突變外，在克隆DNA片段中都不攜有除表Ⅱ所示突變以外的突變。
構(gòu)建一個(gè)toxA″lacZ融合基因，在該融合基因中，toxA啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和該基因的頭1132個(gè)密碼子與功能性lacZ結(jié)構(gòu)基因融合。這一構(gòu)建過程涉及到攜有toxA的質(zhì)粒pSPE1003(圖1)和攜有l(wèi)acZ的質(zhì)粒pNM482(Minton，Gene，31269-273，1984)。攜有toxA″lacZ的質(zhì)粒pSPE1134，是通過把pSPE1003的3.6kb EcoRI片段克隆到pNM482的獨(dú)特EcoRI限制位點(diǎn)中而構(gòu)建的。pSPE1134編碼的融合蛋白包含PMT的頭1132個(gè)氨基酸，它們與一個(gè)功能性β-半乳糖苷酶融合。這一融合蛋白命名為1132″β-gal。
pSPE1134已于1993年9月9日保藏在DSM，保藏號(hào)為DSM8546，并已保藏在CCTCC(中國(guó)武漢武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。
實(shí)施例2重組突變PMT毒素的促有絲分裂效力為測(cè)試重組突變PMT蛋白(rmPMT)的活性，以下列方式制備全細(xì)胞提取液將實(shí)施例1的攜質(zhì)粒菌株于30℃下培養(yǎng)在含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中(Miller，J.Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor N.Y.1972)。離心收集靜止期培養(yǎng)物，重新懸浮于0℃水中，用Branson Sonifier 250(Branson Sonic Power Co.，Conn.)進(jìn)行若干次0.5分鐘超聲處理，用孔徑為0.45μm的Millex-GV濾器(Millipore S.A.，F(xiàn)rance)進(jìn)行無(wú)菌過濾。
然后用以下方法評(píng)估每個(gè)全細(xì)胞提取液的rmPMT含量用7.5%(重量/體積)丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺/雙丙烯酰胺比例為40∶1)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[Laemmli，U.K.，“T4噬菌體頭部組裝過程中結(jié)構(gòu)蛋白的裂解”，Nature(London)227680-685，1970)，然后用考馬斯亮藍(lán)R250染色，在5%乙酸-50%乙醇中使凝膠脫色。用純化的HL1202蛋白(參見實(shí)施例3)作為濃度標(biāo)準(zhǔn)物，將所有全細(xì)胞提取液的rmPMT濃度都稀釋到約20μg/ml，這是通過經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠的一維激光光密度分析掃描(UltroScan XL Laser Densitometer，LKB/Pharmacia，Sweden)來測(cè)定的。
使用經(jīng)過稀釋的提取液，基本上按Rozengurt等人所述(Rozengurt，E.，T.Higgins，N.Chanter，A.J.Lax，和J.M.Staddon，“溶血敗血性巴斯德氏菌毒素培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的強(qiáng)效促有絲分裂劑”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87123-127，1990)如下進(jìn)行促有絲分裂活性測(cè)定將約105個(gè)NIH3T3細(xì)胞(ATCC CRL1658)接種到35mm培養(yǎng)皿中的2ml Dulbecco改良伊格耳培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基添加有10%新生牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(10μg/ml)。培養(yǎng)1天和4天后，將含有純化蛋白的新鮮培養(yǎng)基、含rmPMT或rPMT的全細(xì)胞提供取液、或DH5α株的全細(xì)胞提取液，加到三個(gè)等同的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)7天后計(jì)數(shù)細(xì)胞，此時(shí)陰性對(duì)照培養(yǎng)物已匯合至少4天。
給定樣品(x)的增殖作用(PE)如下計(jì)算PEx= (Nx-No)/(Npmt-N0) x100%其中Nx是裝有樣品x的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，Npmt是裝有SPE1036全細(xì)胞提取液(含終濃度為20ng/ml的rPMT)的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，No是裝有DH5α全細(xì)胞提取液的三個(gè)培養(yǎng)皿(即裝有匯合單層NIH3T3細(xì)胞的培養(yǎng)皿)中的平均細(xì)胞數(shù)。
用不同濃度的SPE1036全細(xì)胞提取液制做rPMT促有絲分裂活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。SPE1036是攜有pSPE680(圖1)的大腸桿菌DH5α。如圖2所示，達(dá)到50% PE的rPMT濃度約為4-5ng/ml，達(dá)到最大PE(100%)的rPMT濃度約為20ng/ml，與文獻(xiàn)(Rozengurt等)一致。rPMT的濃度再高1000倍不會(huì)使PE明顯不同。DH5α提取液即使以1000倍過量加入，與含20ng/ml rPMT的提取液相比也未觀察到毒性作用(未給出數(shù)據(jù))。在不同的實(shí)驗(yàn)中，0% PE和100% PE總是分別對(duì)應(yīng)于4-6.5×105個(gè)和2.5-4×106個(gè)NIH3T3細(xì)胞/ml。
然后測(cè)定帶有單個(gè)氨基酸置換、插入或缺失的rmPMT的PE。所有全細(xì)胞提取液的加入量都相應(yīng)于＞5ng/ml突變蛋白，優(yōu)選達(dá)到20-80% PE的量，相應(yīng)于蛋白濃度/PE曲線最陡部分的點(diǎn)(參見圖2)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)都包括一個(gè)陽(yáng)性(SPE1036)和一個(gè)陰性(DH5α)對(duì)照提取液。結(jié)果概括于圖3。三個(gè)提取液在獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中測(cè)定兩次，以確保所測(cè)得的PE在不同實(shí)驗(yàn)中不變。加入提取液使終濃度達(dá)8ng/ml TV1206得PE為37.2±6.7%和31.7±10.2%;40ng/mlSV1201得PE為51.8±5.6%和48.4±5.8%;80ng/ml HY1205得PE為43.4±8.1%和40.0±9.6%。結(jié)論是，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中所得到的PE可直接進(jìn)行比較為把rmPMT的促有絲分裂作用與rPMT做比較，將給定rmPMT的促有絲分裂效力(MP)定義為達(dá)到給定PE的rPMT濃度與達(dá)到同樣PE的rmPMT濃度的相對(duì)值。這一定義依據(jù)的是如下假定rPMT和rmPMT的蛋白濃度/PE曲線如有不同也只是平行位移，其形狀是完全相同的。在本測(cè)定中，rmPMT HY1202、QL1203、TV1207和△1257-1285保留了大于50%的MP，與PMT沒有明顯不同;SV1201、TV1206和HY1228的MP在10-35%之間;HL1202和HY1205的MP約為5%;+G1203、+GG1203、△1215-1221、HY1223、△H1223和1132″β-gal的MP則小于5%。
結(jié)論是包含4個(gè)組氨酸殘基的氨基酸1201至1228多肽區(qū)段對(duì)rPMT的PE來說至關(guān)重要;2)這種重要性反映在這一區(qū)段中某些單個(gè)氨基酸的重要性上(最明顯的是組氨酸-1223，但還有絲氨酸-1201、組氨酸-1202、組氨酸-1205、蘇氨酸-1206，某種程度上還有組氨酸-1228)，但顯然不是所有氨基酸都重要(即谷氨酰胺-1203和蘇氨酸-1207);3)涉及1200-1229位殘基間的氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)對(duì)功能活性特別重要，因?yàn)檫@一區(qū)域的插入和缺失(導(dǎo)致蛋白+GG1203、△H1223和△1215-1221)對(duì)MP有顯著的負(fù)效應(yīng)，而這一區(qū)段以外(氨基酸殘基1257-1285)的缺失則不影響MP。現(xiàn)有的證據(jù)并不排除該結(jié)構(gòu)中涉及到1201-1228位之間或別處的其他殘基。
突變的本質(zhì)和作用可能進(jìn)一步表明(但并未證明)，對(duì)PMT的功能來說，殘基1202的極性較重要，殘基1201和1206的極性或羥基較重要，殘基1205和1223的咪唑環(huán)特別重要。
同樣測(cè)試實(shí)施例1中所述的雙突變r(jià)mPMT的活性，以及帶有4個(gè)獨(dú)立突變的潛在候選疫苗HL1202HY1205HY1223HY1228(也稱為4HX，見圖4)的活性。
上述的候選疫苗蛋白4HX、+GG1203、△H1223和1132“β-gal在如實(shí)施例3所述進(jìn)行純化后也測(cè)試了促有絲分裂效力。這些純化rmPMT的MP值與上述含rmPMT全細(xì)胞提取液的數(shù)據(jù)一致。
實(shí)施例3選定重組突變PMT蛋白的制備、純化和穩(wěn)定性a.制備rPMT(即由toxA基因編碼并在大腸桿菌中表達(dá)的PMT)、前已公開的PMT缺失衍生物O(Petersen.S.K.等，“出血敗血性巴斯德氏菌毒素重組衍生物抗進(jìn)行性萎縮性鼻炎疫苗的候選者，“Infect.Immun.591387-1393，1991)、以及一種選定的新候選疫苗4HX的制備過程，在以下列方式進(jìn)行的搖瓶實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行比較于30℃下，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(Miller，J.Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中培養(yǎng)攜有質(zhì)粒pSPE680(Petersen.S.K.等，“出血敗血性巴斯德氏菌毒素的重組衍生物抗進(jìn)行性萎縮性鼻炎疫苗的候選者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)、產(chǎn)衍生物OpSPE680類似物pSPE670(出處同上)、或pSPE1038(見圖1)的大腸桿菌K-12，MC1000(dam)(由Henrik φrum惠供)。培養(yǎng)后測(cè)定培養(yǎng)物在450nm波長(zhǎng)處的光密度(OD450)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)20代以上從而使三個(gè)培養(yǎng)物稀釋到相等的光密度后，令培養(yǎng)物進(jìn)入靜止期。
在下列時(shí)間收集1ml培養(yǎng)物樣品指數(shù)生長(zhǎng)后期(每個(gè)培養(yǎng)物2個(gè)樣品(lx1和lx2))OD450＝1.0和OD450＝2.0時(shí);指數(shù)生長(zhǎng)后期和靜止期之間(1個(gè)樣品(lx5))OD450＝5.0時(shí);靜止早期(1個(gè)樣品(es)，OD450＝6.0);靜止后期13小時(shí)后(1個(gè)樣品(ls)，OD450＝6.0)。對(duì)每個(gè)培養(yǎng)物樣品進(jìn)行離心以沉淀出細(xì)菌，然后將細(xì)菌懸浮在不同量的SDS樣品緩沖液[62mM Tris-HCl pH6.8、10%(v/v)甘油、2%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.00125%(w/v)溴酚藍(lán)、0.025%(w/v)派咯寧Y、0.1mM二硫蘇糖醇]中，以使培養(yǎng)物的OD450恢復(fù)到正常值。用10%(重量/體積)丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺/雙丙烯酰胺比例為40∶1)對(duì)這些樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，接著用考馬斯亮藍(lán)染色，再用5%乙酸-50%乙醇使凝膠脫色(參見圖5)。
隨后如實(shí)施例2所述對(duì)凝膠進(jìn)行一維激光光密度分析掃描，得到每個(gè)樣品中rPMT、衍生物O或4HX的相對(duì)量。結(jié)果示于圖6。
在指數(shù)生長(zhǎng)后期，三種蛋白的產(chǎn)量相似。但是，當(dāng)培養(yǎng)物進(jìn)入靜止期時(shí)，由于衍生物O明顯優(yōu)先降解，使該蛋白每OD450的產(chǎn)量比PMT和4HX的產(chǎn)量要低。這種明顯降解反映在衍生物O的最高產(chǎn)量較低，以及在靜止早期和后期之間衍生物O損失33%。在同一時(shí)間段內(nèi)，其他兩種蛋白的產(chǎn)量相當(dāng)恒定地保持在高出300%的水平。
結(jié)論是，所測(cè)試的經(jīng)過氨基酸置換的新突變體的制備過程與rPMT的制備過程很難區(qū)分，因此，它比稱為衍生物O的已知候選疫苗的產(chǎn)量更高，也明顯地更能耐受在大腸桿菌中的降解，而衍生物O是缺失121個(gè)氨基酸殘基的rPMT衍生物(進(jìn)一步的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)還可參見下文)。
為純化目的用下列方法制備rPMT和rmPMT在氨芐青霉素(50μg/ml)存在下，在Luria Broth(Miller，J.Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中培養(yǎng)實(shí)施例1的攜質(zhì)粒菌株。收集400ml在30℃下培養(yǎng)的靜止期培養(yǎng)物，并如實(shí)施例2所述分別重新懸浮于10mlH2O中，超聲處理并無(wú)菌過濾。
b.rPMT的純化用陰離子交換色譜法，接著用疏水性相互作用色譜法，從攜質(zhì)粒pSPE680大腸桿菌的細(xì)菌粗提液中純化rPMT。純化過程中的所有步驟都在4℃下進(jìn)行。將得自400ml培養(yǎng)物的經(jīng)過超聲處理、無(wú)菌過濾的細(xì)菌提取液用2×1升含1mM PMSF的25mM Tris-HCl pH8.0透析過夜。經(jīng)過透析的樣品用緩沖液A(25mM Tris-HCl pH8.0)稀釋至100ml，并加到已在相同緩沖液中平衡過的Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱上。所加物料中的蛋白總含量約為200mg。柱的線度為2cm2×25cm，流速為60ml/小時(shí)(30cm/小時(shí))。用2.5個(gè)床體積的緩沖液A洗柱，然后用從緩沖液A到緩沖液B(緩沖液A+1M NaCl)的線性梯度洗脫吸附的蛋白10個(gè)床體積。洗脫曲線示于圖6。
以10ml為一組分進(jìn)行收集，并用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)進(jìn)行分析(參見圖7)。含10%丙烯酰胺的凝膠在Mini-PROTEAN Ⅱ裝置(Bio-Rad)中進(jìn)行電泳，并進(jìn)行銀染色(Morrissey，J.H.“聚丙烯酰胺凝膠中蛋白的銀染色一種提高了均勻靈敏度的改良方法”，Anal.Biochem.117307-310，1981)。在用氯化鈉梯度洗脫過程中，高純度rPMT在約700mM NaCl時(shí)洗脫出來，見圖6和7。rPMT晚于粗提液中的大多數(shù)其他蛋白洗脫出來，這表明它在pH8時(shí)比粗提液中存在的大多數(shù)其他蛋白帶有更強(qiáng)的負(fù)電荷。合并含純r(jià)PMT的組分，并在-20℃貯存以備進(jìn)行下述的第二個(gè)色譜步驟。每次色譜操作之后用0.5M NaOH清洗色譜柱。
用疏水性相互作用色譜法進(jìn)一步純化rPMT。將步驟1的合并后的各組分調(diào)至0.72M硫酸銨，pH調(diào)至7.0。將樣品加到已預(yù)先在緩沖液1(25mM硫酸鈉、0.72M硫酸銨、pH7.0)中平衡過的Phenyl Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱上。該柱的線度為2cm2×20cm，流速為60ml/小時(shí)(30cm/小時(shí))。
加樣后，用2個(gè)床體積的緩沖液1洗柱。所吸附的蛋白用從緩沖液1到H2O的線性梯度洗脫6個(gè)床體積，然后用4個(gè)床體積的H2O洗脫。以10ml為一組分進(jìn)行收集，并如上所述進(jìn)行SDS-PAGE分析。合并含純PMT的組分并在-20℃下貯存。但是，在這一步只有少量殘留污染物必須去除，參見圖8A和8B。由純化過程得到的最終產(chǎn)物用該制備物的兩倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖9)。這一分析表明所得rPMT的純度≥94%。
c.用常規(guī)色譜法純化衍生物O(dO)的試驗(yàn)對(duì)含有前述衍生物O(dO)的細(xì)菌粗提液進(jìn)行如上所述的陰離子交換色譜(參見圖10)。但在這種情況下，大部分dO都出現(xiàn)在過柱組分(run-through fraction)中，其余部分則作為含若干其他蛋白的混合物的一部分而在約500mM氯化鈉時(shí)洗脫出來(參見圖11)。盡管如此，將具有最佳純度的組分合并，并如上所述進(jìn)行疏水性相互作用色譜。所得dO的純度不合格(參見圖12)。因此試圖優(yōu)化dO的純化方法，例如改變離子交換色譜過程中的pH。但這些嘗試并不成功，因此得出結(jié)論dO不易用常規(guī)柱色譜法純化，rPMT也是如此，這表明121個(gè)氨基酸殘基的缺失已造成了重大的結(jié)構(gòu)變化。這與早期發(fā)表的工作相一致。早期的工作表明，dO的N末端1/4所保留的氨基酸區(qū)段以不同于天然PMT的方式折疊。
d.rmPMT 4HX蛋白的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化如前面對(duì)rPMT所述，對(duì)含4HX rmPMT蛋白的細(xì)菌粗提液進(jìn)行陰離子交換色譜。所得的洗脫曲線與rPMT的洗脫曲線即使不同也是相似的(參見圖13)。對(duì)分級(jí)分離過程中收集的各組分進(jìn)行SDS-PAGE分析，表明高純度4HX在約700mM氯化鈉處洗脫出來(參見圖14)。rPMT和4HX洗脫位置的這種相似性表明，在突變蛋白4HX中保留了rPMT的色譜性質(zhì)，并提示，4HX中的氨基酸置換只引入了微小的結(jié)構(gòu)變化(但在功能上仍然重要，參見實(shí)施例2、4和5)。
用如上所述的疏水性相互作用色譜法進(jìn)一步純化4HX。對(duì)rPMT來說這一步只需除去少量的殘留污染物(見圖3、11)。最終純化產(chǎn)物用4HX制備物的2倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行SDS-PAGE分析(參見圖16)。與rPMT類似，純度≥94%。純化4HX的產(chǎn)率一般為起始物總蛋白的3.5%(w/v)。例如，含200mg總蛋白的粗提液得到7mg純化的4HX。按Bradford的方法測(cè)定蛋白濃度(“利用蛋白-染料結(jié)合原理定量測(cè)定微克級(jí)蛋白的快速靈敏方法”，Anal.Biochem.72248-254，1976)。不可能準(zhǔn)確測(cè)定純化過程中4HX的回收率。但是，通過測(cè)定粗提液和終產(chǎn)物中的蛋白濃度，并把各SDS-PAGE泳道與粗提液和純化4HX蛋白的連續(xù)稀釋液比較，估算回收率約為50%。
e.4HX蛋白的制備規(guī)模純化為了測(cè)試上述純化方法在較大規(guī)模時(shí)的效能，從5升產(chǎn)4HX菌株過夜培養(yǎng)物的粗提液中純化4HX。如上所述收集5升過夜培養(yǎng)物中的細(xì)胞，重新懸浮于H2O中，超聲處理，無(wú)菌過濾(終體積為100ml)。純化過程中所有步驟都在室溫下(20-22℃)進(jìn)行。
細(xì)菌提取液用2×5升含1mM PMSF的25mM Tris-HCl pH8.0透析過夜。經(jīng)過透析的樣品用緩沖液A(25mM Tris-HCl pH8.0)稀釋至1750ml，并加到已在同一緩沖液中平衡過的Q-Sepharose Fast Flow柱上。該柱的線度為20cm2×25cm。流速為600ml/小時(shí)(30cm/小時(shí))。用2.5個(gè)床體積的緩沖液A洗柱，然后用從緩沖液A到緩沖液B(緩沖液A+1M NaCl)的線性梯度以10個(gè)床體積洗脫吸附的蛋白。
每次色譜操作后，用0.5M NaOH清洗色譜柱。Q-Sepharose陰離子交換色譜過程中所得的洗脫曲線(圖17)與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化中所得的曲線(圖13)相似。在梯度洗脫過程中以170ml為一組分進(jìn)行收集，并如上所述進(jìn)行SDS-PAGE分析。這一分析表明，在組分19-20中洗脫出的高純度4HX相應(yīng)于650-700mM氯化鈉。合并組分19-20，用疏水性相互作用色譜法進(jìn)一步純化。
將步驟1得到的合并后的組分調(diào)至0.72M硫酸銨，pH調(diào)至7.0。然后把樣品加到預(yù)先在緩沖液1(25mM 磷酸鈉、0.72M硫酸銨、pH7.0)中平衡過的Phenyl Sepharose CL-4B柱中。該柱的線度為20cm2×20cm，流速為600ml/小時(shí)(30cm/小時(shí))。加樣后，用2個(gè)床體積的緩沖液1洗柱。用從緩沖液1到H2O的線性梯度以6個(gè)床體積洗脫吸附的蛋白，然后用4個(gè)床體積的H2O洗柱。
洗脫過程中以170ml為一組分進(jìn)行收集，并如上所述進(jìn)行SDS-PAGE分析。合并含純4HX的組分并于-20℃下貯存。粗提液、步驟1產(chǎn)物和步驟2產(chǎn)物的SDS-PAGE分析(圖18)表明，在步驟2進(jìn)行過程中沒有達(dá)到明顯的進(jìn)一步純化。因此，4HX純化程序可以充分簡(jiǎn)化而只由一個(gè)離子交換步驟組成。
通過對(duì)純化4HX制備物的兩倍稀釋液進(jìn)行SDS-PAGE(圖19)，測(cè)定產(chǎn)物純度(步驟2之后)。這一分析表明純度≥91%。
與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化中所達(dá)到的產(chǎn)率相似，所得純化4HX為總蛋白的3.5%(由6475mg粗提液總蛋白得到225mg 4HX)。
f.4HX制備物本性的測(cè)試為了確認(rèn)由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模及制備規(guī)模純化所得的純化4HX制備物的本性，對(duì)上述制備物進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后用針對(duì)rPMT產(chǎn)生的多克隆兔抗體進(jìn)行免疫印跡分析(參見圖20)。引入rPMT作為陽(yáng)性對(duì)照(泳道1)，引入另一種重組大腸桿菌蛋白，即粘質(zhì)沙雷氏菌的核酸酶(分子量為30，000)，作為陰性對(duì)照(泳道4)。在圖20中可見，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化的及制備規(guī)模純化的4HX，只在與rPMT相同的分子量處出現(xiàn)染色。
g.+GG1203的純化如前面對(duì)rPMT所述，對(duì)含+GG1203 rmPMT蛋白的細(xì)菌粗提液(菌株SPE1020)進(jìn)行陰離子交換色譜。所得的洗脫曲線(參見圖26)與rPMT(圖6)和4HX(圖13)純化過程中所觀察到的曲線類似。對(duì)分級(jí)分離過程中收集的各組分進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，高純度+GG1203在700-800mM氯化鈉處洗脫出來(參見圖27)。這一洗脫范圍與如上所述觀察到的rPMT和4HX的洗脫范圍相似。rPMT、4HX和+GG1203洗脫位置的相似性表明，在突變蛋白4HX和+GG1203中保留了rPMT的色譜性質(zhì)。如前面對(duì)rPMT所述用疏水性相互作用色譜法進(jìn)一步純化+GG1203，以去除殘留的污染蛋白(參見圖28)。通過對(duì)+GG1203制備物的兩倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行SDS-PAGE，分析最終純化產(chǎn)物(參見圖29)。估算純度約為90%。純化+GG1203的產(chǎn)率為2.5%(從400mg細(xì)菌粗提液總蛋白中得到10mg純化的+GG1203)。
h.△H1223的純化如前面對(duì)rPMT所述，對(duì)含△H1223 rPMT蛋白的細(xì)菌粗提液(菌株SPE1234)進(jìn)行陰離子交換色譜。所得的洗脫曲線(圖30)與rPMT(圖6)、4HX(圖13)和+GG1203(圖26)純化過程中所觀察到的曲線相似但不相同。對(duì)分級(jí)分離過程中收集的各組分進(jìn)行SDS-PAGE分析表明，高純度△H1223在約700mM氯化鈉處洗脫出來，這與rPMT、4HX和+GG1203類似。
如前面對(duì)rPMT所述，用疏水性相互作用色譜法進(jìn)一步純化△H1223(參見圖31)。通過對(duì)△H1223制備物的兩倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行SDS-PAGE(參見圖32)，分析最終純化產(chǎn)物。這一分析表明，純化△H1223的純度為95%。純化△H1223的產(chǎn)率為0.6%(從485mg細(xì)菌粗提液總蛋白得到3mg純化的△H1223)。
i.1132″β-gal的純化通過硫酸銨沉淀并用偶聯(lián)在瓊脂糖上的β-半乳糖苷酶底物類似物對(duì)氨基苯基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(APTG-瓊脂糖)進(jìn)行親和色譜，從細(xì)菌粗提液(菌株SPE1134)中純化上述融合蛋白?；旧习碐ermino等人所述進(jìn)行純化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，806848-6852，1983)。離心澄清細(xì)菌粗提液，并與一倍體積的80%飽和硫酸銨混合(室溫)。離心收集沉淀物。棄去只含β-半乳糖苷酶總活性1%的上清夜。將沉淀物重新懸浮于3ml 10mM Tris-HCl、250mM NaCl、10mM MgCl2、1mM EDTA、0.1% Triton X-100，pH7.6(＝“緩沖液”)中，并用500ml緩沖液在4℃下透析過夜。將經(jīng)過透析的樣品加到已在緩沖液中平衡過的1ml APTG瓊脂糖(Sigma Chemicals，＃A-8648)柱上。室溫下進(jìn)行色譜。在整個(gè)純化過程中以1ml為一個(gè)組分進(jìn)行收集。用10ml緩沖液洗柱，然后用5ml不含Triton X-100的緩沖液洗柱。用以下緩沖液洗脫吸附的蛋白1)4ml 0.1M Tris-HCl，pH10.0;2)4ml Tris，pH10.8;3)4ml 0.1M碳酸鈉，pH11.0;4)4ml含6M脲的緩沖液。收集后立即用1M乙酸鈉pH5中和各組分，并利用SDS-PAGE和β-半乳糖苷酶測(cè)定法進(jìn)行分析。這些分析表明，大部分1132″β-gal蛋白都被0.1M碳酸鈉pH11.0洗脫出來，只有少部分在pH10.0和pH10.8時(shí)洗脫出來。但在pH10時(shí)收集的組分中β-半乳糖苷酶活性相對(duì)較高，這可能是因?yàn)棣?半乳糖苷酶在pH11左右失活。從在pH10.0、10.8和11.0時(shí)洗脫出的組分中選擇含高純度1132″β-gal的組分并合并。β-半乳糖苷酶活性的總回收率為13%?；钚曰厥章实涂赡苁怯捎讦?半乳糖苷酶在強(qiáng)堿性pH下(部分)失活，而這種強(qiáng)堿性pH是從APTG柱中洗脫這種β-gal融合蛋白所需要的。據(jù)報(bào)道，β-半乳糖苷酶融合蛋白一般是在pH10時(shí)從APTG基質(zhì)中洗脫出來，但這在上述情況下顯然不可能。利用SDS-PAGE分析用于純化的粗提液和純化的融合蛋白1132″β-gal(參見圖33)。除了分子量約為200，000道爾頓的主要成分外，純化的制備物在分子量116，000處顯示一個(gè)與β-半乳糖苷酶共同遷移的條帶。還觀察到一個(gè)分子量約為70，000的條帶。
j.dO、rPMT、4HX、+GG1203、△H1223和1132″β-gal對(duì)可能的殘留蛋白酶活性的耐受性及對(duì)胰蛋白酶的耐受性將4HX、+GG1203、△H1223和1132″β-gal對(duì)蛋白水解降解的敏感性與衍生物O進(jìn)行比較，并在這些實(shí)驗(yàn)中引入rPMT作為參照蛋白。如上所述得到純化rmPMT和rPMT的制備物(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備)。如Petersen等人所述(Infection and Immunity，591387-1393，1991)，利用與瓊脂糖偶聯(lián)的單克隆抗體進(jìn)行免疫親和色譜，得到純化dO的制備物。
在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將4HX、dO和rPMT的制備物稀釋到相同的蛋白濃度(0.1mg/ml)，加入25mM Tris-HCl pH7.5以確保各樣品中的pH相同，然后各樣品在37℃下保溫。在0時(shí)刻(對(duì)照)、24小時(shí)后和48小時(shí)后取樣進(jìn)行SDS-PAGE(參見圖21)。在保溫過程中，所測(cè)試的三種蛋白都未觀察到明顯的降解。分別代表rPMT、衍生物O或4HX的各條帶的強(qiáng)度在24小時(shí)和48小時(shí)后保持不變。未觀察到有表明降解發(fā)生的明顯低分子量條帶出現(xiàn)。由這些實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論在這些保溫條件下，4HX、dO和rmPMT就穩(wěn)定性而言具有相同的性質(zhì)。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，比較了rPMT、衍生物O和4HX在蛋白水解酶胰蛋白酶存在下的穩(wěn)定性。將這三個(gè)蛋白樣品如上所述調(diào)至相同的蛋白濃度和pH，并分別在1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶存在下于37℃下保溫24小時(shí)。在該對(duì)比實(shí)驗(yàn)中引入已在利用Q-Sepharose和Phenyl Sepharose色譜進(jìn)行純化試驗(yàn)的過程中富集的衍生物O制備物。用SDS-PAGE分析法將經(jīng)胰蛋白酶處理的樣品與在加胰蛋白酶之前收集的樣品進(jìn)行比較，參見圖22(rPMT)、圖23(4HX)、圖24(純化的衍生物O)和圖25(富集的衍生物O)。在含rPMT(參見圖22)或4HX(參見圖23)的樣品中，加1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶未觀察到明顯降解。但衍生物O對(duì)胰蛋白酶處理高度敏感。對(duì)含經(jīng)免疫親和色譜純化的衍生物O的樣品進(jìn)行SDS-PAGE表明，胰蛋白酶處理后沒有殘留的條帶(參見圖24)。在含富集的衍生物O的樣品中，133kD的衍生物O條帶在胰蛋白酶處理后已消失。但其他分子量較低的組分在胰蛋白酶處理后仍然存在(參見圖25)。這些條帶可能代表了對(duì)胰蛋白酶有耐受性的大腸桿菌蛋白，這些蛋白污染了這種富集了衍生物O的制備物。
由以上實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論在沒有蛋白水解酶存在情況下，4HX(如上所述純化)和衍生物O(用免疫親和色譜法純化)在37℃下保溫24或48小時(shí)的過程中是穩(wěn)定的。但是，在胰蛋白酶存在下，衍生物O明顯對(duì)蛋白水解降解敏感，而4HX rmPMT(和rPMT)在同樣條件下是穩(wěn)定的。因此，看來在4HX中保留了rPMT的胰蛋白酶耐受性，提示該rmPMT中的氨基酸置換并沒有在該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中引入任何明顯的結(jié)構(gòu)變化，而不管rmPMT中氨基酸置換的功能重要性如何，參見下文的實(shí)施例4。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用以下方法考察了+GG1203、△H1223和1132″β-gal對(duì)蛋白水解降解的敏感性如前面對(duì)rPMT、dO和4HX所述，在不加蛋白水解酶和加1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶的情況下，將純化制備物于37℃下保溫24小時(shí)。保溫后用SDS-PAGE法分析樣品，參見圖34(+GG1203)、圖35(△H1223)和圖36(1132″β-gal)。在本實(shí)驗(yàn)中引入dO和4HX作為對(duì)照，并如上所述進(jìn)行操作(數(shù)據(jù)未給出)。
在不加胰蛋白酶時(shí)，37℃下24小時(shí)后未觀察到+GG1203的降解。在胰蛋白酶存在下，+GG1203條帶的強(qiáng)度沒有明顯減弱，但出現(xiàn)了兩個(gè)弱的低分子量條帶，參見圖34。因此，+GG1203基本上能夠耐受蛋白水解酶的降解。類似地，在不加胰蛋白酶時(shí)，△H1223在37℃保溫24小時(shí)的過程中是穩(wěn)定的。但在蛋白水解酶存在下，出現(xiàn)許多緊密靠近的弱的低分子量條帶，并且△H1223條帶的強(qiáng)度略有減弱，參見圖35。在不加胰蛋白酶時(shí)，融合蛋白1132″β-gal在37℃保溫24小時(shí)過程中也是穩(wěn)定的。但該蛋白在與胰蛋白酶一起保溫過程中完全降解，因?yàn)榧葲]有觀察到1132″β-gal條帶，也沒有觀察到任何降解產(chǎn)物，參見圖36。
由該實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論+GG1203對(duì)蛋白水解酶胰蛋白酶降解有耐受性，而△H1223略為敏感。相反，1132″β-gal融合蛋白與dO蛋白一樣對(duì)蛋白水解降解敏感。
k.結(jié)論總的來說，已經(jīng)證明，利用簡(jiǎn)單而廉價(jià)的色譜法，可以從400ml搖瓶培養(yǎng)物中以毫克量將失活rmPMT、4HX、+GG1203、△H1223和1132″β-gal純化至純度為90%。rPMT、4HX、+GG1203和△H1223陰離子交換色譜過程中很類似的洗脫曲線表明，這些rmPMT保留了rPMT的整個(gè)結(jié)構(gòu)，因而也保留了天然PMT的整個(gè)結(jié)構(gòu)。另外，純化的rmPMT制備物不含殘留的蛋白酶活性，因?yàn)樵?7℃保溫24小時(shí)后未檢測(cè)到降解。最后，4HX和+GG1203對(duì)胰蛋白酶具有高度的耐受性，△H1223略為敏感，而1132″β-gal和dO對(duì)胰蛋白酶消化高度敏感。
實(shí)施例4選定重組突變PMT蛋白的毒性早期的研究表明，在不同的生物測(cè)定中，失活PMT的功能受到同等的影響(Petersen S.K.等，“出血敗血性巴斯德氏菌毒素的重組衍生物抗進(jìn)行性萎縮性鼻炎疫苗的候選者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)。因此，4HX不具有任何可檢測(cè)的促有絲分裂作用這一事實(shí)，提示該蛋白全面缺乏生物功能。這一問題是由于測(cè)定4HX對(duì)小鼠的毒性而提出的，這一測(cè)定基本上按Pedersen所述進(jìn)行(Pedersen，K.B.1993，“豬萎縮性鼻炎的培養(yǎng)和血清學(xué)診斷”第22-31頁(yè)，見Pedersen和N.C.Nielsen編“豬萎縮性鼻類”，CEC Agriculture EUR，8643 EN，EEC，Luxembourg)將rPMT(陽(yáng)性對(duì)照)，牛血清清蛋白(BSA)(陰性對(duì)照)或4HX溶于200μl含0.02%正常小鼠血清(DAKO，Denmark)的無(wú)菌過濾磷酸鹽緩沖鹽水中，然后以不同的濃度給成年CF1×BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射。用氨基酸分析法測(cè)定rPMT和rmPMT樣品的濃度(Barkholt，V.和A.L.Jensen.“氨基酸分析以二硫化物為添加劑進(jìn)行鹽酸水解后測(cè)定蛋白質(zhì)中的半胱氨酸和半半胱氨酸”，Anal.Biochem.177318-322，1989)。
將小鼠以3只小鼠為一組分為12組，所有三只小鼠都接受相同的蛋白劑量和制劑，記錄激發(fā)后5天內(nèi)每組中的死亡小鼠數(shù)。表Ⅲ概括了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表Ⅲ 純化4HX對(duì)小鼠的毒性與純化rPMT的比較。
給成年CF1×BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射不同濃度的純化蛋白，記錄5天內(nèi)死亡小鼠數(shù)。本表在每組中受試小鼠數(shù)的上方給出了死亡小鼠數(shù)。引入牛血清清蛋白(BSA)作為陰性對(duì)照。
數(shù)據(jù)表明，rPMT的LD50為4-16ng，與WO89/09617所公開的LD50值一致(見上)。
表Ⅲ還表明，雖然4HX的用量最高達(dá)rPMT LD50的約5000倍，但注射4HX的小鼠無(wú)一死亡。結(jié)論是，在測(cè)試條件下，4HX與BSA一樣是無(wú)毒的。
在類似的實(shí)驗(yàn)中，分別將+GG1203和1132″β-gal及△H1223的毒性與rPMT作了比較。實(shí)驗(yàn)完全如前面對(duì)4HX所述進(jìn)行，所得數(shù)據(jù)概括于表Ⅳ和表Ⅴ。
表Ⅳ 純化+GG1203和1132″β-gal的毒性與純化rPMT的比較。
用不同濃度的純化蛋白給成年CF1×BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射，并記錄5天內(nèi)的死亡小鼠數(shù)。本表在每組受試小鼠數(shù)的上方給出了死亡小鼠數(shù)。引入牛血清清蛋白(BSA)作為陰性對(duì)照。
表Ⅴ 純化△H1223的毒性與純化rPMT的比較用不同濃度的純化蛋白給成年CF1×BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射，并記錄5天內(nèi)的死亡小鼠數(shù)。本表在每組受試小鼠數(shù)的上方給出了死亡小鼠數(shù)。引入牛血清清蛋白(BSA)作為陰性對(duì)照。
實(shí)施例5選定候選疫苗的免疫原性早期的研究表明，豬體內(nèi)抗PMT抗體的誘導(dǎo)與針對(duì)進(jìn)行性萎縮性鼻炎的防護(hù)作用緊密相關(guān)(Nielsen等，Can.J.Vet.Res.，55128-138，1991)。一種用于測(cè)試失活PMT在豬體內(nèi)免疫原性的合適模型系統(tǒng)涉及小鼠的免疫接種(Petersen，S.K.，N.T.Foged，ABording，J.P.Nielsen，H.K.Riemann和P.L.Frandsen“出血敗血性巴斯德氏菌毒素的重組衍生物抗進(jìn)行性萎縮性鼻炎疫苗的候選者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)。采用經(jīng)過改良的這一模型，用CF1×BALB/c小鼠代替自交BALB/c小鼠，驗(yàn)證純化4HX的免疫原性，從而驗(yàn)證4HX是否可作為疫苗的活性成分使用。按上述方法進(jìn)行氨基酸分析，測(cè)定rPMT和rmPMT樣品的濃度。
所測(cè)試的疫苗制備物在250μl磷酸鹽緩沖鹽水(2mM磷酸鈉pH7.2、6mM NaCl)(PBS)中含有不同濃度的經(jīng)甲醛失活的純化重組PMT(frPMT)(陽(yáng)性對(duì)照)、或用遺傳學(xué)方法失活的純化4HX蛋白。候選疫苗4HX和rPMT的純化如實(shí)施例2所述進(jìn)行，rPMT的甲醛處理如Foged所述進(jìn)行(Foged，N.T.“用單克隆抗體檢測(cè)經(jīng)甲醛去毒的出血敗血性巴斯德氏菌毒素上的穩(wěn)定抗原決定基”，Vaccine 9817-824，1991)在20℃下，將純化的rPMT(0.5mg/ml，1ml)用含0.37%(w/v)甲醛、0.1%甲醇的1升PBS pH7.6透析。72小時(shí)后，在透析緩沖液中加入賴氨酸-HCl至終濃度為0.1%(w/v)，在4℃下再透析8小時(shí)，然后在4℃下用PBS pH7.2進(jìn)行若干輪透析，得到最終的frPMT制備物。使所有疫苗制備物吸附到0.26%氫氧化鋁凝膠上(Alhydrogel A級(jí);Superfos，Denmark)。
以兩周的間隔給成年CF1×BALB/c小鼠接種兩次。第二次接種兩周后，給小鼠腹膜內(nèi)注射200μl含100ng rPMT和0.02%正常小鼠血清(Dako，Denmark)的PBS，以激發(fā)小鼠。在激發(fā)前一天從所有小鼠體內(nèi)取血樣，然后用下述ELISA方法分析抗rPMT抗體用已在PBS涂布緩沖液(25nM NaH2PO4、75mM NaH2PO4、145mM NaCl、0.1% Tween 20，pH7.2)中稀釋至3μg/ml的rPMT涂布微量滴定板(96孔，高容量，Nunc，Denmark)，各小孔用洗滌緩沖液(PBS+0.5M NaCl、0.1% Tween 20，pH7.2)洗三次，在20℃下與已在洗滌緩沖液中稀釋的血清一起保溫2小時(shí)。再進(jìn)行三次上述洗滌后，加入已在洗滌緩沖液中以1∶5000稀釋的第二抗體(與兔抗鼠IgG抗體結(jié)合的辣根過氧化物酶，DAKO，Denmark)，并使其在20℃下反應(yīng)2小時(shí)。再進(jìn)行三次上述洗滌后，加入0.67mg/ml鄰苯二胺(OPD)、0.0125% H2O2、34.7mM檸檬酸、66.7mM NaH2PO4以發(fā)生顏色反應(yīng)。加入1M H2SO4停止反應(yīng)。然后在Titertek Multiskan Ⅱ Plus ELISA讀數(shù)器(Labsystems OY，F(xiàn)inland)上測(cè)定492nm處的光吸收，并測(cè)定每個(gè)血清樣品的抗rPMT抗體滴度，以使492nm光吸收達(dá)0.5的稀釋度表示。免疫接種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在下面的表Ⅵ、表Ⅶ和圖37中表Ⅵ 純化4HX的免疫原性與經(jīng)甲醛處理的純化rPMT(frPMT)的比較測(cè)定不同濃度的兩種疫苗成分在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗PMT抗體滴度的能力，以及保護(hù)這些小鼠免受100ng純化rPMT腹膜內(nèi)注射激發(fā)的能力。以兩周的間隔給成年CF1×BALB/c小鼠皮下接種兩次。第二次接種兩周后取血樣，并對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)。本表在每組中受激小鼠數(shù)上方給出了死亡小鼠數(shù)，并給出了抗rPMT滴度。
表Ⅶ 用frPMT和rmPMT接種的動(dòng)物的抗rPMT血清滴度。滴度以log2值表示(SD標(biāo)準(zhǔn)差)
以上數(shù)據(jù)表明，在該模型系統(tǒng)中，4HX對(duì)小鼠的防護(hù)作用與frPMT同樣有效(因此也與WO89/09617中所公開的上述衍生物O同樣有效)。
本實(shí)驗(yàn)的抗rPMT血清滴度數(shù)據(jù)示于圖37。
用25或5μg/ml frPMT或rmPMT免疫導(dǎo)致所有動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)化。用1μg/ml免疫也導(dǎo)致所有5只用frPMT免疫過的動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)化，而在用rmPMT的一組動(dòng)物中有4只動(dòng)物呈陽(yáng)性。未發(fā)生血清轉(zhuǎn)化的動(dòng)物在激發(fā)后死亡。在用0.2或0.08μg/ml的劑量免疫后沒有一只動(dòng)物發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。因此，使用rmPMT時(shí)發(fā)現(xiàn)血清轉(zhuǎn)化和對(duì)激發(fā)的防護(hù)作用之間有100%的相關(guān)性。用學(xué)生氏t檢驗(yàn)法分析分別用frPMT和rmPMT接種的動(dòng)物的血清抗rPMT滴度時(shí)，這些數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異(在5%顯著性水平上)，表明這些疫苗組合物在接種的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生類似的抗rPMT抗體滴度，并產(chǎn)生類似的劑量-反應(yīng)關(guān)系。
在一個(gè)類似的實(shí)驗(yàn)中，通過與4HX比較評(píng)價(jià)了+GG1203和1132″β-gal的免疫原性。rmPMT的純化、接種、取血樣及激發(fā)均如上所述進(jìn)行，不同的是激發(fā)劑量改為200ng。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表Ⅷ和Ⅸ及圖38。
表Ⅷ 純化rmPMT的免疫原性。
測(cè)定不同濃度的疫苗成分保護(hù)小鼠免受200ng純化rPMT腹膜內(nèi)注射激發(fā)的能力。以兩周的間隔給成年CF1×BALB/c小鼠皮下接種兩次。第二次接種兩周后取血樣，并對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)。本表在每組受激小鼠數(shù)的上方給出了死亡小鼠數(shù)。
表Ⅸ 用4HX、+GG1203和1132″β-gal接種的動(dòng)物的抗rPMT血清滴度。滴度以log2值+標(biāo)準(zhǔn)差表示。
表Ⅷ、表Ⅸ和圖38的數(shù)據(jù)證實(shí)，+GG1203的小鼠抗致死劑量rPMT激發(fā)保護(hù)作用，以及在該模型系統(tǒng)中在接種小鼠體內(nèi)的抗rPMT血清滴度誘導(dǎo)作用，與4HX同樣有效。用5和25μg/ml+GG1203免疫，或者用2.5和12.5μg/ml 4HX免疫，導(dǎo)致所有動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)化。這相應(yīng)地反映在0.7-1.3之間的低標(biāo)準(zhǔn)差上。用1μg/ml+GG1203免疫使組內(nèi)5只動(dòng)物都發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，而用0.5μg/ml 4HX免疫則使組內(nèi)5只動(dòng)物中有4只發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，并使平均滴度達(dá)到6.1，相比之下，用+GG1203免疫時(shí)平均滴度為7.5。因此，+GG1203的標(biāo)準(zhǔn)差低(0.7)，4HX的標(biāo)準(zhǔn)差高(3.4)。在更高的劑量下，4HX和+GG1203所達(dá)到的滴度差不多。
與4HX和+GG1203相反，1132″β-gal在劑量高達(dá)2μg/ml時(shí)仍不能誘發(fā)免疫反應(yīng)。用10μg/ml 1132″β-gal免疫使組內(nèi)5只動(dòng)物中有2只發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，平均滴度為3.6，大大低于用類似劑量的4HX和+GG1203免疫時(shí)所達(dá)到的滴度。
結(jié)論是，+GG1203、4HX和1132″β-gal都產(chǎn)生保護(hù)性的抗rPMT抗體。+GG1203和4HX產(chǎn)生與rPMT反應(yīng)的抗體的能力差不多，而1132″β-gal則需要更高的劑量才能產(chǎn)生與4HX和+GG1203的反應(yīng)差不多的抗體反應(yīng)。4HX和+GG1203引起抗rPMT血清滴度的能力之間沒有顯著差異(在5%的顯著性水平上)，表明這些疫苗組合物在所接種的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生類似的抗PMT抗體滴度，并產(chǎn)生類似的劑量-反應(yīng)關(guān)系。對(duì)所有三種候選疫苗來說，血清抗rPMT抗體滴度和抗rPMT激發(fā)保護(hù)作用之間都有高度的相關(guān)性。但是，有一只用+GG1203接種的小鼠發(fā)生了血清轉(zhuǎn)化但未受到抗激發(fā)保護(hù)。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過與4HX比較評(píng)價(jià)了△H1223的免疫原性。rmPMT的純化、接種、取血樣和激發(fā)均如上所述進(jìn)行，激發(fā)劑量為200ng。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于表Ⅹ和表Ⅺ及圖39中。
表Ⅹ 純化rmPMT的免疫原性。
測(cè)定不同濃度的疫苗成分保護(hù)小鼠免受200ng純化rPMT腹膜內(nèi)注射激發(fā)的能力。以兩周的間隔給成年CF1×BALB/c小鼠皮下接種兩次。第二次接種兩周后取血樣，并對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)。本表在每組受激小鼠數(shù)上方給出了死亡小鼠數(shù)。
表Ⅺ 用4HX和△H1223接種的動(dòng)物的抗rPMT血清滴度。滴度以log2值+標(biāo)準(zhǔn)差表示。
表Ⅹ、表Ⅺ和圖39的數(shù)據(jù)證實(shí)，△H1223在該模型系統(tǒng)中的小鼠抗rPMT保護(hù)作用至少與4HX同樣有效。兩種免疫原的最低免疫劑量都未產(chǎn)生血清反應(yīng)。在1μg/ml(0.5μg/ml)和更高的劑量下，所有動(dòng)物都發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。用學(xué)生氏t檢驗(yàn)法分析時(shí)，滴度在5%顯著性水平上相似。這表明，這兩種疫苗組合物在所接種的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生相似的抗PMT抗體滴度，并產(chǎn)生相似的劑量-反應(yīng)關(guān)系。盡管如此，有兩只用0.2μg/ml △H1223接種的小鼠在用200ng rPMT激發(fā)后存活下來。
結(jié)論證明了用純化的置換、缺失、插入或融合rmPMT接種能保護(hù)小鼠免受致死劑量純化rPMT的激發(fā)。在多數(shù)情況下，這種保護(hù)作用與抗rPMT血清抗體的誘導(dǎo)作用相關(guān)。但是，與其他rmPMT和frPMT相比，所選擇的融合蛋白需要用更高的劑量免疫才能誘導(dǎo)出相似的血清反應(yīng)和保護(hù)作用。所選擇的置換、插入和缺失rmPMT在誘導(dǎo)血清滴度方面同樣有效，它們引起抗rPMT激發(fā)保護(hù)作用的能力也差不多。但低劑量的△H1223對(duì)兩只經(jīng)過接種但未發(fā)生血清轉(zhuǎn)化的小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，+GG1203則有一例未對(duì)發(fā)生血清轉(zhuǎn)化的小鼠產(chǎn)生抗激發(fā)保護(hù)作用。
所選擇的置換、缺失和插入rmPMT，在誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)血清抗rPMT抗體滴度方面及小鼠抗rPMT激發(fā)保護(hù)作用方面，與frPMT同樣有效。
但是，據(jù)WO89/9617公開，與用fPMT接種的動(dòng)物相比，用衍生物O接種的動(dòng)物所產(chǎn)生的抗PMT血清滴度明顯較低。據(jù)認(rèn)為，這種差異的原因在于，與截短的衍生物O相比而不是與本研究中所用PMT的重組來源相比，這些rmPMT的預(yù)期結(jié)構(gòu)變化較小，因?yàn)樗幸阎矬w系中的rPMT和PMT似乎都是難以區(qū)分的。
與前人所述的限制酶缺失O衍生物相比，rmPMT的免疫原性得到改進(jìn)，產(chǎn)量更高，穩(wěn)定性也得到改進(jìn);rmPMT在簡(jiǎn)單的常規(guī)純化方法中易于純化，這反映出它保留了與PMT相關(guān)的物理性質(zhì)。這使本文所述的rmPMT成為在商業(yè)上令人感興趣的候選疫苗成分，可用于有效預(yù)防由出血敗血性巴斯德氏菌感染引起的疾病，例如進(jìn)行性萎縮性鼻炎。
所選擇的置換、插入和缺失突變基因，都包含至少3個(gè)堿基對(duì)的突變，因此，在這些情況下回復(fù)為野生型toxA的可能性可以忽略。
權(quán)利要求
1.一種重組突變蛋白，該蛋白至少部分由一個(gè)DNA順序編碼，該DNA順序可以由toxA基因，包括編碼出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種(Pasteurellamultocidasspmultocida)45/78毒素(PMT)的toxA基因，通過一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到，所述蛋白能夠與針對(duì)由出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78編碼的PMT而產(chǎn)生的抗體結(jié)合，其計(jì)算分子量至少為140kD。
2.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白由一個(gè)DNA順序編碼，該DNA順序可以由編碼出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素的toxA基因，通過所述基因中一個(gè)獨(dú)特EcoRI限制位點(diǎn)下游的一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到。
3.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白的分子量至少為141kD。
4.權(quán)利要求3的蛋白，該蛋白的分子量至少為143kD。
5.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白用某種純化方法純化時(shí)至少80%可純化，所述純化方法包括利用Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)在2cm2×25cm色譜柱中進(jìn)行陰離子交換色譜，以表達(dá)所述蛋白的細(xì)菌提取液形式加入蛋白，加到柱上的細(xì)菌總蛋白量約為200mg，流速約為30cm/小時(shí)，用含0-1000mM NaCl緩沖液的線性梯度洗脫吸附的蛋白，必要時(shí)接著用Phenyl Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱對(duì)洗脫出的組分進(jìn)行疏水性相互作用色譜，該柱的線度為2cm2×20cm，流速為30cm/小時(shí)，洗脫吸附的蛋白并測(cè)定其含量。
6.權(quán)利要求5的蛋白，該蛋白用所述純化方法至少94%可純化。
7.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白是由一個(gè)DNA順序編碼的蛋白，該DNA順序是由toxA基因通過用編碼不同氨基酸的密碼子置換至少一個(gè)編碼113-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
8.權(quán)利要求7的蛋白，該蛋白是由一個(gè)至少有兩個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)被置換的DNA順序編碼的。
9.權(quán)利要求8的蛋白，該蛋白是由一個(gè)至少有四個(gè)密碼子被置換的DNA順序編碼的。
10.權(quán)利要求7的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，被置換的密碼子是編碼選自絲氨酸、組氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸的氨基酸的密碼子。
11.權(quán)利要求7的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，被置換的密碼子是1175-1285位之間的密碼子。
12.權(quán)利要求11的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，被置換的密碼子是1200-1230位之間的密碼子。
13.權(quán)利要求1的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序是由toxA基因通過缺失至少一個(gè)編碼1131-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
14.權(quán)利要求13的蛋白，該蛋白是由一個(gè)缺失至少兩個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)的DNA順序編碼的。
15.權(quán)利要求14的蛋白，該蛋白是由一個(gè)缺失至少四個(gè)密碼子的DNA順序編碼的。
16.權(quán)利要求15的蛋白，該蛋白是由一個(gè)缺失至少七個(gè)密碼子的DNA順序編碼的。
17.權(quán)利要求13的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，所缺失的密碼子是編碼選自賴氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密碼子。
18.權(quán)利要求13的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，所缺失的密碼子是1175-1285位之間的密碼子。
19.權(quán)利要求18的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，所缺失的密碼子是1215-1285位之間的密碼子。
20.權(quán)利要求1的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序是由toxA基因通過在編碼1131-1285位間氨基酸的密碼子的下游插入至少一個(gè)密碼子而得到的。
21.權(quán)利要求20的蛋白，該蛋白是由一個(gè)插入了至少兩個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)的DNA順序編碼的。
22.權(quán)利要求21的蛋白，該蛋白是由一個(gè)插入了至少四個(gè)密碼子的DNA順序編碼的。
23.權(quán)利要求20的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，所插入的密碼子是編碼甘氨酸的密碼子。
24.權(quán)利要求23的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，所插入的密碼子是插在1175-1285位之間的位置上。
25.權(quán)利要求24的蛋白，編碼該蛋白的DNA順序中，所插入的密碼子是插在1200-1230位之間的位置上。
26.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白的促有絲分裂效力至多為rPMT的75%，這是通過測(cè)定該蛋白對(duì)NIH3T3細(xì)胞的增殖作用而測(cè)定的，所述測(cè)定包括第一步，根據(jù)含約20ng/ml PMT懸浮液連續(xù)稀釋液的PE測(cè)定結(jié)果制做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按下式計(jì)算PEPEx= (Nx-No)/(Npmt-N0) x100%其中Nx是裝有樣品稀釋液x的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，Npmt是裝有大腸桿菌SPE1036全細(xì)胞提取液的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，所述大腸桿菌SPE1036攜有編碼PMT的pSPE680，所述提取液含有終濃度為20ng/ml的PMT，N0是裝有大腸桿菌DH5α全細(xì)胞提取液的三個(gè)培養(yǎng)皿中的平均細(xì)胞數(shù)，所述培養(yǎng)皿裝有匯合單層NIH3T3細(xì)胞;第二步，測(cè)定蛋白含量在1-100ng/ml范圍的懸浮液的PE，并利用所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相對(duì)于PMT的PE。
27.權(quán)利要求26的蛋白，該蛋白如權(quán)利要求26所述計(jì)算的促有絲分裂效力至多為50%，優(yōu)選至多為35%，更為優(yōu)選的是至多25%，最優(yōu)選的是至多10%，特別是至多5%。
28.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白用權(quán)利要求5所述的純化方法至少90%可純化。
29.權(quán)利要求28的蛋白，該蛋白至少95%可純化。
30.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白在權(quán)利要求5所述的陰離子交換純化步驟中在約700mM NaCl處洗脫。
31.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白腹膜內(nèi)給予小鼠時(shí)測(cè)得的LD50至少為51.2μg。
32.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白在以含至少1.0μg/ml吸附在氫氧化鋁凝膠上的蛋白的疫苗制備物，以兩周的間隔兩次給予小鼠時(shí)，能保護(hù)至少80%的小鼠免受在第二次給予疫苗兩周后腹膜內(nèi)注射的250ng PMT的致死作用。
33.權(quán)利要求32的蛋白，該蛋白在以如權(quán)利要求31所述并含有5.0μg/ml吸附蛋白的疫苗制備物施用時(shí)，能保護(hù)100%的小鼠。
34.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白選自4HX、△H1223、+GG1203和1132″β-gal。
35.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白在以如權(quán)利要求5所述的含1.0μg/ml蛋白的疫苗組合物給予小鼠時(shí)，產(chǎn)生至少為6.2的抗rPMT滴度，這是如權(quán)利要求5所述測(cè)定的。
36.權(quán)利要求35的蛋白，該蛋白在以如權(quán)利要求5所述的含1.0μg/ml蛋白的疫苗組合物給予小鼠時(shí)，產(chǎn)生至少為9的抗rPMT滴度，這是如權(quán)利要求5所述測(cè)定的。
37.權(quán)利要求1的蛋白，該蛋白是由一個(gè)DNA順序編碼的融合蛋白，所述DNA順序包含一個(gè)第一基因和一個(gè)第二基因，第一基因編碼一種能與一種抗體反應(yīng)的免疫原性蛋白，所述抗體則能與由toxA基因編碼的出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素(PMT)反應(yīng)，所述基因是由包含toxA基因的復(fù)制子通過所述toxA基因的一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到的;第二基因編碼第二免疫原性蛋白，第一和第二蛋白可作為融合蛋白表達(dá)。
38.權(quán)利要求37的蛋白，其中第一免疫原性蛋白的計(jì)算分子量至少為140kD。
39.權(quán)利要求37的蛋白，其中第二免疫原性蛋白是由一種病原生物表達(dá)的，該蛋白對(duì)由出血敗血性巴斯德氏菌和所述病原生物引起的疾病產(chǎn)生預(yù)防作用。
40.一種制備重組突變蛋白的方法，該蛋白能夠與針對(duì)出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素(PMT)而產(chǎn)生的抗體結(jié)合，其分子量至少為140kD，所述方法包括如下步驟(ⅰ)分離出DNA順序(a)或(b)，順序(a)包含編碼出血敗血性巴斯德氏菌溶骨毒素(PMT)的toxA基因，包括編碼出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78 PMT的基因;順序(b)所含的一個(gè)順序的基因產(chǎn)物能夠與針對(duì)出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78 PMT而產(chǎn)生的抗體發(fā)生反應(yīng);(ⅱ)對(duì)所述DNA順序進(jìn)行透變處理，造成一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入，得到編碼重組突變蛋白的突變DNA順序;(ⅲ)將所得的突變DNA順序插入到一個(gè)復(fù)制子中;(ⅳ)用該復(fù)制子轉(zhuǎn)化一種細(xì)胞，在該細(xì)胞中，所述復(fù)制子能夠復(fù)制，編碼重組突變蛋白的突變DNA順序能夠表達(dá);(ⅴ)在表達(dá)突變DNA順序的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞;(ⅵ)從培養(yǎng)物中收集重組突變蛋白。
41.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(ⅰ)中所分離的DNA順序是編碼出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素(PMT)的toxA基因。
42.權(quán)利要求41的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成所述基因中一個(gè)獨(dú)特EcoRI位點(diǎn)下游的一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入。
43.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(ⅱ)中所得到的突變DNA順序是編碼分子量至少為141kD的重組突變蛋白的順序。
44.權(quán)利要求43的方法，其中步驟(ⅱ)中所得到的突變DNA順序是編碼分子量至少為143kD的重組突變蛋白的順序。
45.權(quán)利要求41的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成以編碼不同氨基酸的密碼子置換至少一個(gè)編碼1131-1285位間氨基酸的密碼子。
46.權(quán)利要求45的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少二個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)的置換。
47.權(quán)利要求46的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少四個(gè)密碼子的置換。
48.權(quán)利要求45的方法，其中被置換的密碼子是編碼選自絲氨酸、組氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸的氨基酸的密碼子。
49.權(quán)利要求45的方法，其中步驟(ⅱ)誘變處理造成以編碼不同氨基酸的密碼子置換至少一個(gè)編碼1175-1285位間氨基酸的密碼子。
50.權(quán)利要求49的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少一個(gè)編碼1200-1230位間氨基酸的密碼子的置換。
51.權(quán)利要求41的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少一個(gè)編碼1131-1285位間氨基酸的密碼子的缺失。
52.權(quán)利要求51的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少二個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)的缺失。
53.權(quán)利要求52的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少四個(gè)密碼子的缺失。
54.權(quán)利要求53的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少七個(gè)密碼子的缺失。
55.權(quán)利要求51的方法，其中所缺失的密碼子是編碼選自賴氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密碼子。
56.權(quán)利要求51的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少一個(gè)編碼1175-1285位間氨基酸的密碼子的缺失。
57.權(quán)利要求56的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少一個(gè)編碼1215-1285位間氨基酸的密碼子的缺失。
58.權(quán)利要求41的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成編碼1131-1285位間氨基酸的密碼子下游至少一個(gè)密碼子的插入。
59.權(quán)利要求58的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少二個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)的插入。
60.權(quán)利要求59的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成至少四個(gè)密碼子的插入。
61.權(quán)利要求58的方法，其中至少一個(gè)所插入的密碼子是編碼甘氨酸的密碼子。
62.權(quán)利要求58的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成編碼1175-1285位間氨基酸的密碼子下游至少一個(gè)密碼子的插入。
63.權(quán)利要求62的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理造成編碼1200-1230位間氨基酸的密碼子下游至少一個(gè)密碼子的插入。
64.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(ⅱ)的誘變處理是定位誘變，包括如下步驟構(gòu)建能夠與步驟(ⅰ)中分離的DNA順序雜交的突變特異性引物順序，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增所述引物順序，然后切下所分離的DNA順序中的一個(gè)片段，并用經(jīng)過擴(kuò)增的引物順序置換。
65.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(ⅲ)中插入了突變DNA順序的復(fù)制子是一種質(zhì)粒。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述質(zhì)粒選自pSPE680、pSPE888、pSPE900、pSPE1003和pSPE1038。
67.權(quán)利要求40的方法，其中步驟(ⅳ)中所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是一種細(xì)菌。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陰性菌。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。
70.權(quán)利要求40的方法，其中收集突變重組蛋白的方法是分離細(xì)胞，對(duì)分離出的細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，并除去細(xì)胞碎片，得到含蛋白的細(xì)胞粗提液。
71.權(quán)利要求70的方法，該方法還包括純化細(xì)胞粗提液的步驟。
72.權(quán)利要求71的方法，其中純化過程包括陰離子交換色譜，包括用含0-1000mM NaCl的遞增梯度緩沖液進(jìn)行的洗脫步驟。
73.權(quán)利要求72的方法，其中純化過程還包括一個(gè)疏水性相互作用色譜步驟，包括用含0-1000mM NaCl的遞增梯度緩沖液進(jìn)行的洗脫步驟。
74.權(quán)利要求72或73的方法，其中由洗脫步驟得到的流出液中突變重組蛋白的含量，按起始物的總蛋白含量計(jì)算至少為50%(重量)。
75.權(quán)利要求74的方法，其中突變重組蛋白的含量至少為75%(重量)。
76.權(quán)利要求75的方法，其中突變重組蛋白的含量至少為90%(重量)。
77.權(quán)利要求76的方法，其中突變重組蛋白的含量至少為94%(重量)。
78.權(quán)利要求77的方法，其中突變重組蛋白的含量至少為98%(重量)。
79.權(quán)利要求71的方法，其中突變重組蛋白的產(chǎn)率按細(xì)胞粗提液的總蛋白含量計(jì)算至少為1%(重量)。
80.權(quán)利要求79的方法，其中突變重組蛋白的產(chǎn)率按細(xì)胞粗提液的總蛋白含量計(jì)算至少為2%(重量)。
81.權(quán)利要求80的方法，其中突變重組蛋白的產(chǎn)率按細(xì)胞粗提液的總蛋白含量計(jì)算至少為3.5%(重量)。
82.一種DNA順序，該順序包含一個(gè)編碼分子量至少為140kD的蛋白的基因，所述蛋白能夠與一種抗體反應(yīng)，所述抗體能與由toxA基因編碼的出血敗血性巴斯德氏菌出血敗血亞種45/78毒素(PMT)反應(yīng)，所述DNA順序由含toxA基因的復(fù)制子通過所述toxA基因中一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到。
83.權(quán)利要求82的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過所述基因中一個(gè)獨(dú)特EcoRI位點(diǎn)下游的一個(gè)或更多個(gè)密碼子的置換、缺失或插入而得到。
84.權(quán)利要求82的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過用編碼不同氨基酸的密碼子置換至少一個(gè)編碼1135-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
85.權(quán)利要求84的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子通過置換至少二個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)而得到的。
86.權(quán)利要求85的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子通過置換至少四個(gè)密碼子而得到的。
87.權(quán)利要求84的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過置換至少一個(gè)編碼選自絲氨酸、組氨酸、谷氨酰胺和蘇氨酸的氨基酸的密碼子而得到的。
88.權(quán)利要求84的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過置換所述toxA基因中至少一個(gè)編碼1175-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
89.權(quán)利要求84的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過置換所述toxA基因中至少一個(gè)編碼1200-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
90.權(quán)利要求82的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過缺失至少一個(gè)編碼1131-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
91.權(quán)利要求90的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子通過缺失至少二個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)而得到的。
92.權(quán)利要求91的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子通過缺失至少四個(gè)密碼子而得到的。
93.權(quán)利要求92的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子通過缺失至少七個(gè)密碼子而得到的。
94.權(quán)利要求90的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過缺失至少一個(gè)編碼選自賴氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密碼子而得到的。
95.權(quán)利要求90的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過缺失至少一個(gè)編碼1175-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
96.權(quán)利要求90的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過缺失至少一個(gè)編碼1215-1285位間氨基酸的密碼子而得到的。
97.權(quán)利要求82的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過在編碼1131-1285位間氨基酸的密碼子下游插入至少一個(gè)密碼子而得到的。
98.權(quán)利要求97的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子通過插入至少二個(gè)密碼子(例如至少三個(gè)密碼子)而得到的。
99.權(quán)利要求98的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子通過插入至少四個(gè)密碼子而得到的。
100.權(quán)利要求97的DNA順序，其中所插入的至少一個(gè)密碼子是編碼甘氨酸的密碼子。
101.權(quán)利要求97的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過在編碼1175-1285位間氨基酸的密碼子下游插入至少一個(gè)密碼子而得到的。
102.權(quán)利要求101的DNA順序，該順序是由含toxA基因的復(fù)制子，通過在編碼1200-1230位間氨基酸的密碼子下游插入至少一個(gè)密碼子而得到的。
103.一種攜有權(quán)利要求82的DNA順序的復(fù)制子。
104.權(quán)利要求103的復(fù)制子，它是一種質(zhì)粒。
105.權(quán)利要求104的復(fù)制子，它是一種選自pSPE680、pSPE888、pSPE900、pSPE1003、pSPE1038、pSPE1020、pSPE1134和pSPE1234的質(zhì)粒。
106.權(quán)利要求105的復(fù)制子，它是編碼突變重組蛋白4HX的質(zhì)粒pSPE1038，該質(zhì)粒保藏在DSM，保藏號(hào)為DSM7221。
107.一種用權(quán)利要求103的復(fù)制子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在該細(xì)胞中，所述復(fù)制子能夠復(fù)制。
108.權(quán)利要求107的細(xì)胞，該細(xì)胞是一種細(xì)菌。
109.權(quán)利要求108的細(xì)胞，該細(xì)胞是一種革蘭氏陰性菌。
110.權(quán)利要求109的細(xì)胞，該細(xì)胞是大腸桿菌。
111.權(quán)利要求1的突變重組蛋白作為疫苗的應(yīng)用，所述疫苗用于預(yù)防由出血敗血性巴斯德氏菌引起的疾病。
全文摘要
能夠與針對(duì)出血敗血性巴斯德氏菌毒素而產(chǎn)生的抗體結(jié)合的新的突變重組蛋白，該蛋白可作為疫苗用于預(yù)防由出血敗血性巴斯德氏菌引起的疾病，也有可能用于預(yù)防其他疾病。該蛋白穩(wěn)定性好并易于用簡(jiǎn)單純化方法純化。
文檔編號(hào)A61K39/102GK1091773SQ93114440
公開日1994年9月7日 申請(qǐng)日期1993年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月30日
發(fā)明者S·彼得森, O·C·漢森, H·K·里曼, L·B·尼爾森 申請(qǐng)人:生物技術(shù)研究院