專利名稱：造影劑或其相關(guān)物的改良的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于新型造影劑，尤其是應(yīng)用于診斷成像的新型含氣或產(chǎn)氣造影劑。
眾所周知，在血管系統(tǒng)的研究中，尤其是在心動(dòng)描記術(shù)和組織微脈管系統(tǒng)的研究中，超聲成像是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的診斷工具。人們已提出了各種各樣能增強(qiáng)所獲聲像的造影劑，包括固體顆粒是浮液、乳化液滴、氣泡和包氣膠囊或包液膠囊。人們普遍認(rèn)為易于壓縮的低密度造影劑能特別有效地產(chǎn)生聲反射，因此對(duì)含氣和產(chǎn)氣體系作為超聲造影劑給予特別的關(guān)注。
含氣造影劑在磁共振(MR)成像中也是有效的，例如用于減弱MR信號(hào)強(qiáng)度的靈敏性造影劑即是含氣造影劑。含氧造景影劑也是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的順磁共振造影劑。
此外，像二氧化碳這樣的氣體可能在X-射線成像領(lǐng)域中用作負(fù)性口服型造影劑。
最初的研究是向心內(nèi)注射生理可受的物質(zhì)，它們?cè)隗w內(nèi)產(chǎn)生自由氣泡，這種氣泡作為超聲心動(dòng)描記術(shù)的造影劑相當(dāng)有效?？墒怯捎谟坞x氣泡的壽命短，此技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中受到嚴(yán)格限制。因此在超聲心動(dòng)描術(shù)和其它超聲研究中，使氣泡穩(wěn)定的方法顯得很重要，例如使用乳化劑、油、增粘劑或糖。
人們意識(shí)到為使左邊心臟和心肌在靜脈注射造影劑后更容易超聲顯像，這種應(yīng)用于超聲心動(dòng)描記術(shù)中的氣泡體系最好直徑不超過8-10微米，以使其能自由地通過肺毛細(xì)管床到達(dá)左心房和左心室。很明顯，要使左邊心臟有效顯像，要求這種氣泡體系(下文中將稱作“微泡”)有足夠的體內(nèi)穩(wěn)定性，其壽命最好能超過一個(gè)循環(huán)周期。
微泡造影劑體系同樣需具有好的貯存穩(wěn)定性，例如，其生產(chǎn)、銷售以及使用前在醫(yī)院中的貯存，都要求造影劑能穩(wěn)定存在。
人們對(duì)制備蛋白微氣泡膠囊用作超聲造影劑領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究工作。正如US-A-4718433和US-A-4774958中所述，這種造影劑可通過如下方法制備聲處理-粘性蛋白溶液以形成微泡體系，至少使部分膠囊化的蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性或化學(xué)變性以穩(wěn)定微泡。熱變性可能過加熱或者簡單地通過聲處理中產(chǎn)生的熱來實(shí)現(xiàn)，化學(xué)變性可通過在PH為4.5的水介質(zhì)中，蛋白質(zhì)與甲醛或戊二醛反應(yīng)來進(jìn)行。較好的蛋白質(zhì)原料是5%的人血清白蛋白(HSA)，據(jù)說用它能促進(jìn)形成直徑為2-4微米為主的微泡。用該技術(shù)生產(chǎn)的微球能穩(wěn)定貯存48小時(shí)或更長的時(shí)間。
EP-A-0324938敘述了一種改進(jìn)型的膠囊蛋白質(zhì)微泡體系的制備方法。這一方法包括兩步聲處理。首先將聲波發(fā)生器浸入蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生微泡體系，然后將該發(fā)生器移至液面上貼近液面的位置，使蛋白質(zhì)溶液產(chǎn)生泡沫和煙霧。據(jù)說這樣制得微泡濃分散體系，其微泡直徑大多小于10微米，且在室溫下，即20-25℃，能夠穩(wěn)定保存4-8周或者更第的時(shí)間。EP-A-0359246中敘述了適于工業(yè)上連續(xù)生產(chǎn)這種膠囊蛋白質(zhì)微泡的過程。
HSA又是上述步驟中較好的一種蛋白質(zhì)，可應(yīng)用的濃度為0.5-25%W/W，工業(yè)上用5%或者更稀的水溶液更方便，比如用0.5-3%W/W。實(shí)驗(yàn)性產(chǎn)品AlbunexR就是用HSA按這種方法制備的，它的微球由空氣微泡中心和不溶性(即變性)的HSA膜組成。
EP-A-0324938和EP-A-0359246中的這種產(chǎn)品具有適當(dāng)?shù)捏w外貯存穩(wěn)定性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)能夠提高受試對(duì)象給藥后其體內(nèi)穩(wěn)定性。例如Shapiro等人在J.Am.Coll.Cardilo.16(7)(1990)，pp.1603-1607中報(bào)道了聲處理過的HSA超聲造影劑，在人體靜脈注射后心肌渾濁化難以定量且結(jié)果不能重復(fù)。他們還觀察到在心臟收縮初期，左心室底部和頂部的造影強(qiáng)度快速減弱，心臟收縮后造影強(qiáng)度幾乎全部消失，并提出這可能是由于左心室的高收縮壓破壞了白蛋白包覆的微泡。
Wo92/05806中報(bào)道了類似的觀察結(jié)果，根據(jù)EP-A-0324938所說的方法制成比較穩(wěn)定的膠囊膜，在血流中，由于心臟搏動(dòng)時(shí)的壓力變化導(dǎo)致膜的破裂。這一文獻(xiàn)建議用下法制備超聲膜向一成膜蛋白質(zhì)水溶液鼓泡并通過切割(如研磨，聲或者超聲振動(dòng))使氣泡大小減小到期望值范圍(例如0.5-10微米，最好4-10微米)，然后通過熱變性或者用能與蛋白質(zhì)反應(yīng)的交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，使氣泡懸浮液穩(wěn)定。這些交聯(lián)劑有醛和巰基丙氨酸類硫化物，甲醛水溶液和戊二醛水溶液的應(yīng)用已列舉過。然而所得產(chǎn)品除非凍干，否則穩(wěn)定性差。而對(duì)凍干劑，在注射時(shí)需用水或其它生理可受的液體再生，人們將意識(shí)到免去用前的重新配制，在實(shí)用中有很多優(yōu)越性。
具有更好的體內(nèi)穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)膠囊包氣微泡或者產(chǎn)生氣體微泡體系造影劑不斷發(fā)展的需要。
本發(fā)明除上述之外是以我們的研究結(jié)果為基礎(chǔ)的，即蛋白質(zhì)與能使其發(fā)生交聯(lián)的雙功能醛在水介質(zhì)中，實(shí)際中性PH下發(fā)生反應(yīng)能增強(qiáng)蛋白質(zhì)型造影劑的穩(wěn)定性。尤其是我們將驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)交聯(lián)反應(yīng)在中性緩沖液的水介質(zhì)中進(jìn)行時(shí)，穩(wěn)定性提高的程度可大大超過上面US-A-4718433和US-A-4774958中的酸性甲醛水溶液以及酸性戊二醛水溶方法穩(wěn)定性。
這里所用的“實(shí)際中性PH值”一詞是指既無明顯酸性，也無明顯堿性的中間PH區(qū)域，例如PH為5-9。
本發(fā)明的側(cè)重點(diǎn)之一是提供具有蛋白質(zhì)包裹的微氣泡或氣體前體的微泡造影劑，蛋白質(zhì)在實(shí)際中性PH的水溶液中與能使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)的雙功能醛反應(yīng)而交聯(lián)。
蛋白質(zhì)可以是含有聚氨基酸的任何蛋白質(zhì)及其衍生物。典型的蛋白質(zhì)是白蛋白，動(dòng)物膠以及r-球蛋白。這些蛋白質(zhì)可從生物來源中獲得，例如從人或動(dòng)物的血液中得到，或者由低級(jí)生物體采用重組技術(shù)制得。發(fā)酵是制備人血清白蛋白的典型方法，詳見Wo90/02808。
熱處理(例如可以通過聲處理直接發(fā)生)和本發(fā)明中的交聯(lián)至少有助于膠囊的部分蛋白變性，從而使膠囊蛋白的性能更為優(yōu)越，這樣使預(yù)先經(jīng)聲處理的蛋白基造影劑(例如聲處理的白蛋白Albunex)通過交聯(lián)很容易獲得本發(fā)明的造影劑。
本發(fā)明中用以穩(wěn)定超聲造影劑的雙功能醛包括二醛和α，β-不飽和醛。典型的二醛包括10個(gè)碳原子以內(nèi)的脂肪族二醛，例如戊二醛、己二醛、1，8-辛二醛及其象2-羥基-己二醛之類的取代衍生物。典型的α，β-不飽和醛包括10個(gè)碳原子以內(nèi)的α，β-不飽和脂肪醛，例如3-8個(gè)碳原子的2位鏈烯醛，象丙烯醛(即2-丙烯醛)，甲基丙烯醛(即2-甲基-2-丙烯醛)，丁烯醛(即2-丁烯醛)，2-戊烯醛和2-己烯醛及其象3-二甲基-氨基丙烯醛之類的取代衍生物。
另外，根據(jù)本發(fā)明，造影劑與能還原席夫堿中雙鏈的還原劑(例如象氫硼化鈉和氰基氫硼化鈉三類的氫硼化物試劑)反應(yīng)有利于造影劑的穩(wěn)定。
另一方面，本發(fā)明可提供制備微泡造影劑的方法。這包括在實(shí)際中性PH的水介質(zhì)中，蛋白質(zhì)與能夠使蛋白質(zhì)交聯(lián)的雙功能醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，及在交聯(lián)進(jìn)行之前，或者在交聯(lián)進(jìn)行中，或者在交聯(lián)之后把氣體或者氣體前體囊包在該蛋白質(zhì)中的方法。
任何生物體可接受的氣體都可用于此過程及本發(fā)明的造影劑中。例如空氣、氮?dú)狻⒀鯕?、氫氣、一氧化二氮、二氧化碳、氦氣、氬氣、六氟化硫以及可任意選擇的低分子量的氟化烴，象甲烷、乙炔、四氟化碳等。氣體可以自由地存在于微泡中，或者被截留、或者被夾帶在某種所含的物質(zhì)中。這里的“氣體”包括37℃時(shí)以氣態(tài)存在的任何物質(zhì)。
氣體前體包括碳酸鹽、碳酸氫鹽，例如碳酸氫鈉、碳酸氫銨和氨基丙二酸酯。
在象超聲心動(dòng)描記述的超聲應(yīng)用中，制備和使用平均大小為0.1-10微米的微泡，比如1-7微米，可順利地通過肺部系統(tǒng)，并在約0.1-15兆赫這個(gè)較佳的成象頻率下獲得共振信號(hào)。在實(shí)際中，平均大小大至500微米的較大氣泡可用在胃腸成像、子宮以及輸卵管的研究等其它方面。
可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽湮⑴蒹w系，象前面提到的任何一種合適的方法都可。例如在氣體存在下，通過劇烈振蕩蛋白質(zhì)溶液，就可將氣體夾帶在蛋白質(zhì)溶液中，即產(chǎn)生US-A-4684479所描述的液包氣乳液。另一個(gè)人所共知的方法是用注射器把氣體注入到蛋白質(zhì)溶液中，如US-A-3900420所述，用儀器快速向高流速液體中注入氣體，在液體中產(chǎn)生低壓區(qū)，此時(shí)的液體是蛋白質(zhì)溶液。把氣體注入蛋白質(zhì)溶液中，如此而得到的液包氣乳液從制備儀中泵出。
在裝有蛋白質(zhì)溶液的容器中，可能把電解產(chǎn)生的氣體直接夾帶在溶液中。此外，電解所需的電解質(zhì)有助于穩(wěn)定蛋白膠囊微泡。電解含有一種或多種電解質(zhì)的水溶液，一般在陰極產(chǎn)生氫氣，在陽極產(chǎn)生氧氣。當(dāng)加入肼時(shí)，在陽極可產(chǎn)生氮?dú)?。電極可用鹽橋隔開。用科爾柏(Klobe)反應(yīng)通電解羧酸也可產(chǎn)生二氧化碳。
制備微泡體系的較好方法是前面提到的US-A-47184333、US-A-4774958，EP-A-0324938，EP-A-0359246中所述的方法。即在氣體存在下(例如在大氣下)聲處理蛋白質(zhì)溶液。這種聲處理技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)之一是除了產(chǎn)生所需微泡之外，還能起到控制膠囊蛋白變性質(zhì)的作用，因此增強(qiáng)了最終產(chǎn)物的穩(wěn)定性。
本發(fā)明中蛋白質(zhì)的交聯(lián)是在蛋白質(zhì)的水溶液或懸浮體中進(jìn)行的，在水緩沖液中進(jìn)行更好。所用的醛可以是純液態(tài)，或者是醛的水溶液，或者是象乙醇之類可與水混溶的低級(jí)鏈烷醇與水形成混合溶劑的醛溶液，醛的濃度為50%，所加醛的量大約是相應(yīng)蛋白質(zhì)的2-50倍。
交聯(lián)反應(yīng)可以在室溫或加熱下進(jìn)行，不過不應(yīng)使反應(yīng)溫度超過60℃，否則會(huì)引起過多的沒必要的蛋白質(zhì)變性。最好輕輕攪動(dòng)反應(yīng)介質(zhì)，比如反應(yīng)在滾動(dòng)燒瓶中進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間一般在1分鐘到24小時(shí)之間。
交聯(lián)反應(yīng)可在PH為5-9下進(jìn)行，6-8之間更好，例如PH為7。反應(yīng)在水緩沖液中進(jìn)行，一般來說所有合適的緩沖體系都可以使用，象本發(fā)明中提到的。例如檸檬酸/氫氧化鈉體系PH為5或6，磷酸鹽緩沖體系PH約為7，硼酸鹽/鹽酸體系PH約為8，硼酸鹽/氯化鉀/氫氧化鈉體系PH約為9。
在我們不希望受理論根據(jù)約束的同時(shí)，我們認(rèn)為應(yīng)用α，β-不飽和醛，其交聯(lián)反應(yīng)包含快速的米切爾(Michael)類型的加成，此加成反應(yīng)是在蛋白質(zhì)分子的伯胺基與α、β-雙鍵上的β碳原子之間進(jìn)行的，醛基和蛋白質(zhì)分子上另外的伯胺基之間發(fā)生慢反應(yīng)，形成含有-CH＝N-鍵的席夫堿和/或含有-CH(OH)-NH-鍵的產(chǎn)物(參見Polymer31(1990)PP130-134Sebenik等人的研究結(jié)果)。用二醛作交聯(lián)劑主要是通過生成-CH＝N-和-CH(OH)-NH-鍵而交聯(lián)。
如前所述交聯(lián)蛋白質(zhì)又能有效地與象氫硼化鈉、氰基氫硼化鈉之類的還原劑反應(yīng)，還原席夫堿中的雙鍵，還原劑的用量應(yīng)為相應(yīng)用于交聯(lián)反應(yīng)的醛的2-5倍。此反應(yīng)可在任一種PH為5-9的緩沖液中進(jìn)行，PH6-8更好，比如PH為7。如果必要的話，此反應(yīng)可與交聯(lián)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，這樣需在加醛以前將還原劑加到蛋白質(zhì)溶液或懸浮體中。
交聯(lián)反應(yīng)和任何還原反應(yīng)最好在氣體或氣體前體囊包在蛋白質(zhì)中以后進(jìn)行，尤其是交聯(lián)前通過控制囊包蛋白的變性進(jìn)行初步穩(wěn)定化處理時(shí)。交聯(lián)反應(yīng)可用的原料是象Albunex之類的聲處理過的白蛋白產(chǎn)品等蛋白基超聲造影劑。
后文將這種預(yù)先成形的蛋白質(zhì)材料稱作“微球”，交聯(lián)前要洗滌球，除去自由的不囊包的蛋白質(zhì)，否則它將參與不必要的交聯(lián)反應(yīng)。例如水洗微球3-4次，每欠洗滌后使微球漂浮，用移液管取走漂浮層下面的洗滌水。然后在旋轉(zhuǎn)的燒瓶中使懸浮于水或者適當(dāng)?shù)木彌_液中的微球與醛反應(yīng)，必要的話可與還原劑反應(yīng)，再用水洗以除去未反應(yīng)的醛和任何還原劑。
交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物其微泡表面具有醛基(參見PharmaceuticalResearch9(6)(1992)，P776和J.Pharm.Sci.7(12)(1982)，P1323)。此醛基在發(fā)生還原反應(yīng)時(shí)被還原成羥甲基。另外當(dāng)胺大大過量時(shí)，此醛基會(huì)與胺反應(yīng)生成席夫堿，如果需要，此席夫堿可象前述那樣與還原劑反應(yīng)，還原其中的-CH＝N-雙鍵。用雙功能胺允許選擇適當(dāng)?shù)墓δ芑源嫒┗?，例如與氨基酸反應(yīng)將引入羧基，與氨基醇反應(yīng)將引入羥基，與二胺反應(yīng)將引入氨基。
另外，除交聯(lián)和其它化學(xué)反應(yīng)外，對(duì)微泡大小分布的改善會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明造影劑的體內(nèi)、體外穩(wěn)定性。這里的“減小體積”一詞，意味著減小微泡的平均大小。這種大小分布改善包括減小微泡的平均大小，和/或縮小微泡的大小范圍，在交聯(lián)和任何化學(xué)還原反應(yīng)進(jìn)行之前，之中，最好是之后進(jìn)行這種改善。進(jìn)行這種改善使本發(fā)明更具特色。
一種大小分布的改良技術(shù)是對(duì)微泡，最好是對(duì)微泡水懸浮液，或懸浮于磷酸鹽之類緩沖液中的微泡施加外部氣壓(例如用空氣或氧氣)。例如對(duì)充氣微泡懸浮體施加20-100千帕的氣壓，30-80千帕較有利，60-70千帕更好;此操作可方便地在室溫下的壓力容器中進(jìn)行時(shí)間為30秒-5分鐘。大約1分鐘較好。
另一種大小分布改良技術(shù)是向充氣微泡中加入一種能溶解該氣體的液體，例如對(duì)充空氣微泡加水或者象磷酸鹽之類的鹽水緩沖液，在此液體中慢慢攪動(dòng)微泡，比如滾動(dòng)燒瓶。大小分布改良程度受兩個(gè)因素的控制，其一是所加液體與微泡中所含氣體的相對(duì)量，其二是氣體在液體中的溶解度，改良程度隨前者的增加而增加，隨后者的增加而減小;通過控制這兩個(gè)因素，可產(chǎn)生預(yù)期的結(jié)果。
我們發(fā)現(xiàn)通過大小分布改良，使微泡的平均體積減小了40-60%，比如50%左右。其穩(wěn)定性大大增強(qiáng)，并用作超聲造影劑時(shí)其聲頻衰減性能優(yōu)越。例如用這種改良型造影劑大大增強(qiáng)了兔子動(dòng)脈和靜脈的多普勒信號(hào)。
高體外穩(wěn)定性也是本發(fā)明中改良型造影劑的特征。例如在標(biāo)準(zhǔn)的體外超聲造影效應(yīng)測試中，超過90秒鐘其造影效應(yīng)不減弱。
應(yīng)用上述大小分布改良技術(shù)，我們可制得大多數(shù)微泡在4微米以下的交聯(lián)蛋白質(zhì)造影劑，例如至少85%，常常是至少90%的微泡大小在4微米以下，其余的微泡大小在4-10微米范圍內(nèi)。這可與US-A-4718433列舉的造影劑相比較，在US-A-4718433中列舉的造影劑，大約有20%的微泡其大小超過了4微米。具有上述大小分布的交聯(lián)蛋白囊包氣體微泡造影劑是新產(chǎn)品，它在象超聲心動(dòng)描記術(shù)之類超聲技術(shù)中特別有用，并使本更具特色。這些產(chǎn)品可用交聯(lián)了的蛋白基的微泡造影劑來制備，而不用本發(fā)明中雙功能醛交聯(lián)而穩(wěn)定的造影劑來制備。例如用WO92/17213中所述的生物可降解的交聯(lián)蛋白囊狀微泡造影劑來制備。
總的來說，按本制得產(chǎn)品其微泡的數(shù)目和大小分布可通過庫利特計(jì)分析來確定。據(jù)此可以公式化地制備微球的標(biāo)準(zhǔn)懸浮液，其單位懸浮液所含的氣體總體積是預(yù)先確定的。
本發(fā)明的造影劑可應(yīng)用于各種診斷成象技術(shù)中，包括超聲成像、MR成像，X-射線成像。本發(fā)明的最佳特點(diǎn)是其產(chǎn)品作為敏感性造影劑應(yīng)用于診斷超聲成像和磁共振成像。
下列非限制性的例子用以說明本發(fā)明，所有溫度都采用攝氏溫標(biāo)，用作起始材料的Abbunex(阿巴尼克斯)懸浮液中微球濃度一般在5-9×108個(gè)/毫升范圍內(nèi)。
例1將水洗過的阿巴尼克斯(Albunex)微球的無菌水懸浮液(3毫升)裝入玻璃瓶中，加入50%的丙烯醛乙醇溶液(30微升)，置瓶于標(biāo)準(zhǔn)滾動(dòng)混合器上慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)4小時(shí)。所得微球懸浮液通過庫利特(Coulter)計(jì)數(shù)器測量進(jìn)行表征，計(jì)算出微球的相對(duì)氣體體積。通過調(diào)節(jié)懸浮液的體積，使氣體體積等于進(jìn)行回聲(echogenicity)測量前未處理的阿巴尼克斯微球參比懸浮液有氣體體積，以使懸浮液標(biāo)準(zhǔn)化。
例2-6除了用下表中列出的醛代替丙烯醛以外，重復(fù)例1的操作步驟。
＊25%的水溶液例7將水洗過的阿巴尼克斯微球的無菌水懸浮液(3毫升)裝入玻璃瓶中，加入50%的丙烯醛乙醇溶液(30微升)，置瓶于標(biāo)準(zhǔn)滾動(dòng)混合器上慢慢滾動(dòng)4小時(shí)。用微量吸量管取30微升氰基氫硼化鈉溶液(50毫克還原劑氰基氫硼化鈉溶于500微升水中)一次加至瓶底，并滾動(dòng)過夜。
所得微球懸浮液通過庫利特計(jì)數(shù)器測量進(jìn)行表征;計(jì)算出微球的相對(duì)氣體體積，通過調(diào)節(jié)懸浮液有體積，使氣體體積等于進(jìn)行回聲(echogenicity)測量前未處理的阿巴尼克斯微球參比懸浮液的氣體體積，以使懸浮液標(biāo)準(zhǔn)化。
例8-12除了用下表中列出的醛代替丙烯醛以外，重復(fù)例7中的操作步驟。
例13將水洗過的阿巴尼克斯微球的水懸浮液(3毫升)在玻璃瓶中放置1小時(shí)后，用移液管從漂浮的微球下面取出2.5毫升液體，向瓶中加入2.5毫升PH為7的磷酸鹽緩沖液。置瓶于標(biāo)準(zhǔn)滾動(dòng)混合器上慢慢滾動(dòng)5分鐘，以促使微球再懸浮。用移液管向瓶底加入50%的丙烯醛乙醇溶液(30微升)，滾動(dòng)4小時(shí)。然后加入30微升氰基氫硼化鈉溶液(50毫克還原劑氰基氫硼化鈉溶于500微升水中)，滾動(dòng)過夜。
所得微球懸浮液通過庫利特計(jì)數(shù)器則量進(jìn)行表征計(jì)算出微球的相對(duì)氣體體積，通過調(diào)節(jié)懸浮液的體積，使氣體體積等于進(jìn)行回聲(echogenicity)測量前未處理的阿巴尼克斯微球參比懸浮液的氣體體積，以使懸浮液標(biāo)準(zhǔn)化。
例14-21除用下表中所列出的醛代替丙烯醛以外，重復(fù)例13的操作步驟。
＊25%的水溶液例22除不加氰基氫硼化鈉溶液以外，重復(fù)例13的操作步驟。
例23-26除用下表中所列出的醛代替丙烯醛以外，重復(fù)例22的操作步驟。
＊25%的水溶液以上標(biāo)準(zhǔn)化的懸浮液的體外回聲性能(echogenicity)和穩(wěn)定性是通過用7毫升的埃斯通(Iaotln)Ⅱ(英國，拉坦(Luton)庫利特電子有限公司)稀釋每份懸浮液而測得的，埃斯通過Ⅱ的氣容量與人的靜脈血近似。每份懸浮液的聲傳導(dǎo)是作為時(shí)間的函數(shù)而測得的，稀釋后立即用3.5兆赫的能量轉(zhuǎn)換器開始測量。
信號(hào)穩(wěn)定后，測試的所有產(chǎn)品的回聲性能均大于未處理的阿巴尼克斯微球參比懸浮液。
對(duì)比實(shí)驗(yàn)是用33%的甲醛水溶液代替丙烯醛乙醇溶液，重復(fù)例13的步驟。所得產(chǎn)物在信號(hào)穩(wěn)定后，體外的回聲性能最小。
例27用PH為7的磷酸鹽緩沖液洗滌阿巴尼克斯微球三次，然后再懸浮于裝有磷酸鹽緩沖液(30毫升)的玻璃瓶中，加入25%的戊二醛水溶液(300微升)，置瓶于滾動(dòng)混合器上在室溫下滾動(dòng)20小時(shí)。這樣得到的交聯(lián)微球可通過下列任一種方法進(jìn)行大小分布改良。(ⅰ)加入被空氣飽和的磷酸鹽緩沖液(制備方法將磷酸鹽緩沖液置于37℃水浴上，保持氧氣分壓Po2(注原文中寫成了PO2)約為21千帕)慢慢攪拌過夜以除去過量氣泡;(ⅱ)加入部分脫除空氣的磷酸鹽緩沖液(制備方法37℃時(shí)將(ⅰ)中制備的飽和溶液在氧氣分壓Po2大約為10千帕?xí)r脫氣1小時(shí))，并將其置于滾動(dòng)器上，室溫下滾動(dòng)3小時(shí);(ⅲ)將微球懸浮液放高壓容器中，空氣加壓1分鐘，然后將微球再懸浮于裝有磷酸鹽緩沖液的瓶中，并將瓶置于滾動(dòng)混合器上滾動(dòng)5分鐘，得到均勻的懸浮液。
交聯(lián)微球大小分布改良時(shí)所加溶液的體積(相對(duì)于微球懸浮液的體積)、施加的空氣壓力以及微球的氣體體積濃度詳見下表
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的、含有相同氣體體積的微球懸浮液進(jìn)行回聲性能測量，發(fā)現(xiàn)微球體積約減少50%是大小分布改良的最佳程度，即產(chǎn)生穩(wěn)定的盡可能大的聲衰減。這可以通過加入約5體積的飽和磷酸鹽緩沖液、或者加入約2體積的部分脫氣磷酸鹽緩沖液，以及應(yīng)用66千帕的空氣超壓來得到。加入更大量的磷酸鹽緩沖液，或者施加更高的壓力得到的微球雖然具有高穩(wěn)定性，但聲衰減減小了。應(yīng)用過大的體積/壓力導(dǎo)致微球皺縮，必然減小聲衰減。
例28根據(jù)例27中方法(ⅲ)制備大小分布改良的微球，即施加66千帕的空氣壓力。用磷酸鹽緩沖液洗滌所得的微球三遍，通過漂浮/取除下面的溶液使微球濃縮。下表中列出了各階段所得微球的物理特性(a)大小分布改良前;(b)大小分布改良后;(c)洗滌以后;(d)濃縮以后。
1用0.5微升氣量2用0.3微升氣量
例29用PH為7的磷酸鹽緩沖液洗滌阿巴尼克斯微球三次，并再分散于盛有磷酸鹽緩沖液(30毫升)的玻璃瓶中，加入50%的丁烯醛乙醇溶液(300微升)，將瓶置于滾動(dòng)混合器上室溫滾動(dòng)20小時(shí)。然后加入(300微升)氰基氫硼化鈉溶液(制備方法100毫克還原劑氰基氫硼化鈉溶于1毫升水中)，室溫下繼續(xù)滾動(dòng)1小時(shí)、如此得到的交聯(lián)微球按例27中的方法進(jìn)行大小分布改良處理，其結(jié)果與大小分布改良的戊二醛交聯(lián)微球相類似。
例30向500毫升帶蓋燒瓶中加入埃斯通Ⅱ(250毫升)將燒瓶置于37℃水浴中，在電磁攪拌下空氣飽和過夜。然后以250-300轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速在室溫水浴下進(jìn)行攪拌。5分鐘內(nèi)將燒瓶從水浴中取出，用注射器和針頭通過瓶蓋將戊二醛交聯(lián)白蛋白微球懸浮液(30毫升)注射到埃斯坦中，繼續(xù)攪拌4小時(shí)。所加戊二醛交聯(lián)白蛋白微球懸浮液是用300微升醛試劑、按例24中描述的方法制備的，含氣量為25%。然后將其放置過夜使球漂浮。用注射器和針頭從瓶底吸除埃斯通，吸除時(shí)要在瓶蓋上另插一針頭進(jìn)氣。此后加入磷酸鹽緩沖液(15毫升)，將燒瓶置滾動(dòng)混合器上滾動(dòng)20分鐘，得到均勻的微球懸浮液。此懸浮液通過庫利特計(jì)分析以及回聲測量來表征，結(jié)果如下表所示
例31用50%的丙烯醛乙醇溶液(300微升)作為交聯(lián)劑重復(fù)例30的操作步驟，得到的微球在大小分改良前含氣量為12%。
權(quán)利要求
1.造影劑包括蛋白質(zhì)囊包氣體微泡或蛋白質(zhì)囊氣體前體微泡。即在水介質(zhì)中，在實(shí)際中性PH下，用能與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)的雙功能醛與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)形成膠囊的蛋白質(zhì)外膜。
2.權(quán)利要求1中的造影劑里的蛋白質(zhì)是白蛋白、動(dòng)物膠或者r-球蛋白。
3.權(quán)利要求2中的造影劑里的蛋白質(zhì)是人血清白蛋白。
4.前面任何一條權(quán)利要求中的造影劑里的醛是二醛或是α、β-不飽和醛。
5.權(quán)利要求4中的造影劑里的醛是從戊二醛、己二醛、2-羥基己二醛、1，8-辛二醛、丙烯醛、3-二甲氨基丙烯醛、甲基丙烯醛、丁烯醛、2-戊烯醛、2-己烯醛中選擇的。
6.前面任何一種權(quán)利要求中的造影劑里的交聯(lián)蛋白質(zhì)已與還原劑反應(yīng)，用以還原席夫堿中的雙鍵。
7.前面任何一種權(quán)利要求中的造影劑里的氣體微泡進(jìn)行了大小分布改良。
8.權(quán)利要求7中的造影劑的體外跟蹤測試表明，超過90秒鐘其造影效果不減弱。
9.由交聯(lián)蛋白質(zhì)外膜包囊的囊狀氣體微泡造影劑，至少85%的微泡大小小于4微米，其余微泡大小在4-10微米之間。
10.權(quán)利要求9中的造影劑里至少有90%的微泡大小小于4微米。
11.以上任何一種造影劑在診斷成像中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求1-10中任何一種造影劑在診斷超聲成像中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1-10中任何一種造形劑在磁共振成像中的應(yīng)用。
14.增強(qiáng)人體或動(dòng)物體成像的方法，包括在人體或動(dòng)物體上使用權(quán)利要求1-10中任何一種造影劑，以致至少在人體或動(dòng)物體的一部分產(chǎn)生超聲或磁共振圖像。
15.權(quán)利要求1中提到的制備微泡造影劑的過程，包括在水介質(zhì)中，在實(shí)際中性PH下，用能使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)的雙功能醛與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。在上述交聯(lián)反應(yīng)之前、期間或之后，氣體或氣體前體被囊包在蛋白質(zhì)中。
16.權(quán)利要求15中的過程包括使預(yù)先聲處理的蛋白基微球發(fā)生交聯(lián)。
17.權(quán)利要求15、16中的交聯(lián)過程在PH6-8范圍內(nèi)進(jìn)行。
18.權(quán)利要求17中的交聯(lián)過程在PH約為7時(shí)進(jìn)行。
19.權(quán)利要求15-18中的任一交聯(lián)過程是在水緩沖體系中進(jìn)行的。
20.權(quán)利要求19中的緩沖液是磷酸鹽緩沖液。
21.權(quán)利要求15-20中任何一條的交聯(lián)蛋白質(zhì)也與某種還原劑發(fā)生反應(yīng)，還原席夫堿中的雙鍵，或者是這種還原劑存在于交聯(lián)反應(yīng)過程中。
22.權(quán)利要求21中的還原劑是氫硼化鈉或者氰基氫硼化鈉。
23.對(duì)權(quán)利要求15-22任何制備的含氣造形劑，對(duì)微泡的大小分布進(jìn)行改善的過程。
24.權(quán)利要求23中的大小分布改善過程是在蛋白質(zhì)交聯(lián)之后進(jìn)行的。
25.權(quán)利要求23或24的大小分布改善過程是通過對(duì)微泡或其懸浮液施加外氣壓實(shí)現(xiàn)的。
26.權(quán)利要求23或24的大小分布改善過程是以可溶氣液體處理微球來實(shí)現(xiàn)的。
27.權(quán)利要求23-26的微泡的平均體積減小40-60%的實(shí)現(xiàn)過程。
全文摘要
用于超聲和/或磁共振(MR)成像中的造影劑，是含有氣體或氣體前體的蛋白質(zhì)微泡，其中蛋白基質(zhì)的交聯(lián)是通過在水介質(zhì)中，實(shí)際中性pH下，與雙功能醛(例如象戊二醛這樣的二醛或者是烯醛這樣的α，β-不飽和醛)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。此種造影劑提高了其體內(nèi)穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性，尤其是當(dāng)?shù)鞍谆|(zhì)也與氫硼化物之類席夫堿還原劑發(fā)生反應(yīng)后，這些交聯(lián)的含氣蛋白質(zhì)造影劑，在進(jìn)行大小分布改善后，減小了微泡的平均大小，進(jìn)一步提高了微泡的穩(wěn)定性，并能制備出微泡大小分布范圍特別狹小的新穎造影劑。
文檔編號(hào)A61K49/22GK1088114SQ9311769
公開日1994年6月22日 申請(qǐng)日期1993年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月16日
發(fā)明者J·克拉維尼斯, P·龍威德, J·H·約翰森, P·A·福斯, A·霍塞思, A·M·沃瑟夫 申請(qǐng)人:奈科姆成像有限公司