專利名稱：同時測定HbAL的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用識別HbAlc、HbSlc和HbClc的抗體免疫測定血樣中糖基化血紅蛋白含量的方法以及制備上述抗體的方法。
血紅蛋白運(yùn)輸氧和CO2，它定位于紅細(xì)胞中，由四條蛋白鏈組成，其中的兩條在各種情況下都具有相同的結(jié)構(gòu)。在任何情況下，血紅蛋白都主要由兩條非糖基化的α和β鏈組成。通常，血液中90%以上的血紅蛋白是以表示為HbAo的形式存在。
人們已知，具有改變了氨基酸順序的血紅蛋白的α鏈及β鏈的變異體會損害血紅蛋白分子的運(yùn)輸功能，并異致所謂的血紅蛋白病。在血紅蛋白病中最為人們熟知的是鐮狀細(xì)胞貧血，它是由疏水性纈氨酸替代了β鏈第6位上的親水性谷氨酸。該替代過程的發(fā)生導(dǎo)致替代的纈氨酸與β鏈第1位上的纈氨酸之間產(chǎn)生疏水性環(huán)化作用。該結(jié)構(gòu)引起含有這種被改變的β鏈的HbS分子聚積，進(jìn)而影響該被改變的血紅蛋白的運(yùn)輸功能。另外一種病理性血紅蛋白HbC不同于HbA也在于在β鏈第6位上發(fā)生了一個氨基酸取代。此時是賴氨酸取代了谷氨酸。除此之外，還已知具有一個明確氨基酸取代的大量其他血紅蛋白變異體(例如HbA2，HbE)。
由這些血紅蛋白變異體與葡萄糖在體內(nèi)借助非酶學(xué)反應(yīng)形成糖基化的血紅蛋白衍生物。該非酶學(xué)糖基化作用是一種緩慢、連續(xù)的反應(yīng)過程，它不可逆地進(jìn)行并且主要依賴于血糖濃度。在糖基化作用過程中，在葡萄糖的醛基與血紅蛋白的游離氨基酸之間形成席夫堿。所形成的醛亞胺借助Amadori重排而重排形成N-(1-脫氧-D-果糖-1-基)殘基。以該重排形式存在的糖基化血紅蛋白是穩(wěn)定的。
通常形成的糖基化血紅蛋白被表示為HbAlc。前文提到的糖基化血紅蛋白變異體表示為HbSlc或HbClc。這些糖基化血紅蛋白是由位于血紅蛋白β鏈N末端上的纈氨酸或賴氨酸的游離氨基的糖基化作用形成的。各種血紅蛋白變異體在該過程中與正常HbAo在同樣程度上被糖基化(J.Sosenko et al，Diabedtes Care 3，1980，590-593)。
血液中糖基化血紅蛋白的濃度依賴于血糖濃度。成人中糖基化的血紅蛋白與總血紅蛋白的比例正常是在3-6%的范圍內(nèi)。當(dāng)血糖水平增高時，該比例增至15%。因此，測定N末端糖基化血紅蛋白的比例是監(jiān)測血糖水平的可靠指標(biāo)。因?yàn)榧t細(xì)胞所具有的平均半衰期為120天，所以測定血液中的糖基化血紅蛋白提供了一個不依賴于血糖短期增加(如食用富含碳水化合物的飲食后)的血糖水平指標(biāo)。
因此，測定血液中的糖基化血紅蛋白對于診斷和監(jiān)測糖尿病具有重要意義。因而，已開發(fā)了許多用于檢測HbAlc的色譜和電泳方法。然而，利用這些方法不能夠同時測定糖基化的血紅蛋白與HbAlc(J.Sosenko et al.Diabetes Care 3，1980，590-593;D.Gold-stein et al.，CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 21，1984，187-225;Allen et al.，Annul.Clinical Biochemistry 29，1992，426-429)。盡管除HbAlc之外糖基化血紅蛋白變異體如HbSlc或HbCLc也用親和層析法同時測定，但該方法對發(fā)生于β鏈N末端的糖基化作用不具特異性，因?yàn)樗醒t蛋白分子的糖基化作用(例如在賴氨酸殘基上或在α鏈上)都同等被檢測(D.Goldstein et al.，CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 21，1984，187-225)。因此，用層析法在患有上文提及的血紅蛋白病之一的病人中測定N末端糖基化血紅蛋白比例的值太低，而親和層析法一般檢測較高的值。所以，這些現(xiàn)有技術(shù)的方法不能用于用患有血紅蛋白病患者的血樣診斷和監(jiān)測糖尿病。
現(xiàn)已意外地證明，用含有糖基化的寡肽果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro或其部分作為半抗原成分的免疫原進(jìn)行免疫獲得的抗體可以獲得能識別HbAlc、HbSlc和HbCLc并適用于免疫測定HbAlc、HbSlc和HbClc的方法中的抗體。
因此，本發(fā)明涉及應(yīng)用能識別HbAlc、HbSlc和HbClc并能利用至少一種含有糖基化寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu、果糖-Val-His-Leu-Thr和/或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗體原成分的免疫原進(jìn)行免疫獲得的抗體，同時免疫測定HbAlc、HbSlc和HbClc。
經(jīng)上述途徑產(chǎn)生的抗體能識別HbAlc、HbSlc和HbClc的這一事實(shí)也特別令人意外，因?yàn)樵贖bS和HbC的β鏈第6位上發(fā)生的氨基酸取代同樣導(dǎo)致由抗體識別的表位區(qū)域的三級結(jié)構(gòu)的改變，繼而將可以預(yù)料用上文提及的免疫原獲得的抗體將在HbAlc、Hb-Slc和HbClc之間有所區(qū)別。
借助于所有現(xiàn)行的免疫測定法，例如ELISA、熒光免疫測定法、放射免疫測定法、熒光-偏振免疫測定法(FPIA)、克隆酶供體免疫測定法(CEDIA)或酶多重免疫測定技術(shù)(EMIT)可以用上述抗體對N末端糖基化血紅蛋白HbAlc、HbSlc和HbClc同時進(jìn)行免疫測定。該方法中可進(jìn)行均相測定(如作為競爭性濁度免疫測定)，也可進(jìn)行非場相測定。
該測定最好是根據(jù)凝集試驗(yàn)例如TINIA或膠乳顆粒增強(qiáng)的免疫測定法(LPIA)的原理進(jìn)行。這些都是競爭性試驗(yàn)，其中來自樣本的抗原與多半抗原競爭，該試驗(yàn)中存在結(jié)合到高分子載體蛋白上的數(shù)種半抗原，以結(jié)合到特異性抗體。最好是用進(jìn)行免疫的半抗原(優(yōu)選是果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為結(jié)合到高分子載體上的半抗原。不存在來自樣本的抗原時，上述免疫原由該試驗(yàn)中所用的抗體所交聯(lián)以形成在該試驗(yàn)溶液中引起一定濁度的大凝集塊。高分子多半抗原由抗原從上述凝集物中置換出來，置換量對應(yīng)于樣本中抗原量。結(jié)果，試驗(yàn)溶液的濁度與抗原量成比例降低。通過與加入已知量的糖基化血紅蛋白所觀察到的濁度降低相比較，就有可能測定樣本溶液中的糖基化血紅蛋白(HbAlc、HbSlc和HbClc)的含量。為此，HbAlc、HbSlc和HbClc一般可以單獨(dú)或作為混合物使用。
此外，最好是根據(jù)CEDIA、EMIT、FPIA或ELISA技術(shù)實(shí)施本發(fā)明的方法。
在CEDIA技術(shù)中，來自待分析樣本的抗原本身引起無活性的酶受體與酶供體締合，形成有活性的酶，因此其酶活性與待分析樣本中的抗原量成比例(Henderson et al，Clinical Chemistry 32，1986，1637-1641)。某些酶，如β-半乳糖苷酶被用于該試驗(yàn)中并以均不具酶活性的兩種成分存在，也就是說一個大的多肽(酶受體)和一個小的多肽(酶供體)，這些成分自發(fā)締合形成一個酶活性蛋白。將作為分析物被檢測的半抗原結(jié)合到酶供體上，其方式應(yīng)使酶供體與酶受體締合而形成活性酶的過程不會因半抗原的這種結(jié)合而受阻。然而，當(dāng)抗抗原的抗體結(jié)合到抗原-酶供體復(fù)合體上時，上述締合過程受到抑制。因此，在有酶受體、抗原-酶供體復(fù)合體和相應(yīng)的抗體存在的試劑溶液中，沒有活性酶形成，也檢測不到酶活性。在加入樣本液后，來自樣本液中的抗原置換出結(jié)合到抗原-酶供體復(fù)合體中的抗體，因而能形成活性酶。
在酶多重免疫測定技術(shù)(EMIT)中，待檢半抗原與標(biāo)記酶共價偶聯(lián)，其方式應(yīng)以維持酶活性為準(zhǔn)。然而，當(dāng)抗體結(jié)合到半抗原成分上后，結(jié)合在酶上的底物受到空間位阻，以致底物的酶促轉(zhuǎn)化不能產(chǎn)生。正如在CEDIA技術(shù)中的情況一樣，來自待測樣本液中的抗原在這種情況下也從酶結(jié)合的半抗原中置換出抗體，因此能分析樣本液中與抗原濃度成比例的酶活性(Gunzer et al.，"Kontakte Ⅲ，1980，3-11;K.Rubenstein，Biochemical and Biophysical Re-search Communications 47，1972，846-851)。
在熒光-偏振免疫測定(FPIA)中，用一種熒光物質(zhì)標(biāo)記待測半抗原。這些分子吸收光能后在約10-8秒的期間內(nèi)作為更長波長的光釋放。如果熒光團(tuán)被偏振光激發(fā)，那么發(fā)射光的偏振程度依賴于示蹤物(分析物-熒光團(tuán)接合物)的旋轉(zhuǎn)速度。示蹤物與抗體的結(jié)合妨礙熒光團(tuán)的旋轉(zhuǎn)。游離的示蹤物比更大的、更具惰性的抗體-示蹤物復(fù)合體旋轉(zhuǎn)更快且使激發(fā)光去偏振更多。樣本中存在的分析物越多，所形成的抗體-示蹤物復(fù)合體就越少，并且檢測到熒光偏振也就越少(W.Dandliker et al.，Journal of Exp Med.122，1965，1029)。
在以ELISA原理為基礎(chǔ)的免疫測定中，通過檢測固相中的酶標(biāo)記物來測定酶標(biāo)抗體與來自待測樣本液、于檢測反應(yīng)之前或之中固定的抗原的結(jié)合。
此外，本發(fā)明涉及識別HbAlc、HbSlc和HbClc的單克隆和多克隆抗體，這些抗體可以通過用含有糖基化的寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原折免疫原進(jìn)行免疫并用已知的方法從被免疫的動物血清中分離抗體而獲得。
更進(jìn)一步的主題是可通過下列方法獲得的單克隆和多克隆抗體，即用含有果糖-Val-His-Leu-Thr作為半抗原的免疫原與至少一種含有果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu和/或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原成分的另一種免疫原的混合物免疫哺乳動物，并從免疫的動物血清中分離抗體。
本發(fā)明優(yōu)選的主題是識別HbAlc、HbSlc和HbClc的單克隆抗體，這些抗體可以通過用所說的免疫原免疫、使被免疫動物的脾細(xì)胞永生、克隆那些能產(chǎn)生所需抗體的永生細(xì)胞并按已知方法從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞中分離抗體而獲得。
用類似于EP-A0329994(亦屬本專利申請公開的主題)中所描述的方法能夠制備免疫原。在該過程中，半抗原被結(jié)合到載體蛋白如KLH(鎖眼
血蘭蛋白)、β-半乳糖苷酶或麻仁球蛋白上，KLH優(yōu)選用作載體蛋白。借助于偶聯(lián)基團(tuán)如賴氨酸、半胱氨酸和馬來酰亞氨基己基，KLH易于偶聯(lián)半抗原和載體蛋白。
特別優(yōu)選的是應(yīng)用具有高包被密度(被結(jié)合的半抗原基團(tuán)數(shù)相當(dāng)于載體蛋白重量的5-25%)的免疫原。借助該方法制備高血清滴度的抗血清。高血清滴度的含義應(yīng)理解為所得的多克隆抗血清能夠以高稀釋比例(1∶8，優(yōu)選1∶10及更高)應(yīng)用于糖基化血紅蛋白的測定。
然后，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法用上述免疫原免疫通常用來獲取抗體的動物。優(yōu)選的是兔或羊，或者是在制備單克隆抗體的情況下優(yōu)選小鼠。多克隆抗體可以直接加以應(yīng)用，或者最好是在經(jīng)DEAE層析純化后或經(jīng)免疫吸附純化后使用。單克隆抗體可以用一般方法使免疫動物的脾細(xì)胞永生、克隆那些產(chǎn)生所需抗體的永生細(xì)胞和根據(jù)已知方法分離抗體而獲得。
同樣優(yōu)選的是將至少兩種含有果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu、果糖-Val-His-Leu-Thr和果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原成分的免疫原的混合物用于免疫。
以常規(guī)方式借助ELISA試驗(yàn)檢測與HbAlc、HbSlc以及如果需要的話與HbClc的結(jié)合而鑒定產(chǎn)生所需抗體的永生細(xì)胞。
此外，本發(fā)明涉及制備識別HbAlc及HbSlc和HbClc抗體的方法，其中包括用含有糖基化寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原的免疫原或至少兩種上述免疫原的混合物進(jìn)行免疫，并根據(jù)已知方法從被免疫動物的血清中分離抗體。
本發(fā)明優(yōu)選的主題是制備識別HbAlc、HbSlc和HbClc的單克隆抗體的方法，其中包括用含有糖基化寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原的免疫原或至少兩種上述免疫原的混合物進(jìn)行免疫、使免疫動物的脾細(xì)胞永生、克隆那些產(chǎn)生所需抗體的永生細(xì)胞并根據(jù)已知方法從克隆的細(xì)胞中分離抗體。
本發(fā)明特別優(yōu)選的主題是根據(jù)本發(fā)明制備識別HbAlc、HbSlc和HbClc的多克隆或單克隆抗體的這種方法，其中應(yīng)用半抗原成分被結(jié)合到作為載體蛋白的KLH上的免疫原。
此外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明免疫測定糖基化血紅蛋白含量的抗體在同時免疫測定血樣中HbAlc以及糖基化血紅蛋白變異體如HbSlc和HbClc含量的方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明抗體還識別其它的Hb糖基化變異體，如HbA21c和HbE1c。
此外，本發(fā)明還涉及用于免疫測定N末端糖基化血紅蛋白含量的試劑，其中含有至少一種本發(fā)明的抗體以及用本發(fā)明的抗體對HbAlc、HbSlc和HbClc同時進(jìn)行免疫測定的方法。
下面的實(shí)施例將更為詳盡地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1制備獲得抗HbAlc型糖基化血紅蛋白抗體的免疫原1.1 β-半乳糖苷酶作為載體蛋白的應(yīng)用根據(jù)EP-A0329994中的描述，借助在半自動肽合成儀(Labortec Company，Bubendorf，Switzerland)上進(jìn)行的固相合成法合成肽果糖-Val-His-Leu-Thr-Lys-OH并將其結(jié)合到β-半乳糖苷酶上。為此，將10mg果糖-Val-His-Leu-Thr-Lys-OH溶于1ml 0.1摩爾/升磷酸鉀緩沖液(pH7)中，并加至溶于2ml乙醇的6.2mg馬來酰亞氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞氨基酯中。反應(yīng)液于室溫下攪拌14小時后在Polycosil C18上純化，并凍干HPLC純化餾分。
為制備免疫原，將48mgβ-半乳糖苷酶(β-Gal)(EIA質(zhì)量，Boehringer Mannheim GmbH，目錄號570079)在通入氬氣的條件下溶解于2ml 0.1mol/l的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中，并在無氧情況下加入5mg凍干肽果糖-Val-His-Leu-Thr-Lys(MH)-OH后于室溫?cái)嚢?小時。隨后將整個反應(yīng)液放入用氬飽和0.09%氯化鈉溶液平衡過的AcA 202柱(2×24cm，Pharmacia，Sweden)中。接著，用同樣的平衡緩沖液洗脫，并收集含所需免疫原的蛋白餾分。利用樣品與Ellman試劑的反應(yīng)檢測用半抗原基團(tuán)包被β-半乳糖苷酶的情況。
免疫原果糖-Val-His-Lys-(MH)-βGal、果糖-Val-His-Leu-Lys-(MH)-βGal和果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro-Lys-(MH)-βGal用類似的方式制備。
1.2 KLH作為載體蛋白的應(yīng)用根據(jù)EP-A 0329994中的描述，借助在半自動的肽合成儀(Labortec Company，Bubendorf，Switzerland)上進(jìn)行的固相合成法合成半抗原果糖-Val-His-Leu-Thr-Cys-OH。
載體蛋白鎖眼
血蘭蛋白(KLH)與馬來酰亞氨基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺(MHS)進(jìn)行反應(yīng)。為此，將2gKLH溶解于0.1mol/l碳酸氫鈉(pH8.35)中。離心分離不溶性蛋白質(zhì)部分。繼而用0.1mol/l NaOH將溶液的pH值調(diào)節(jié)至8.30。將溶解于3ml DMSO中的370mg馬來酰亞氨基己酰-N-羥基琥珀酰亞胺加入該蛋白溶液中。于室溫反應(yīng)15分鐘后，用0.1mol/l HCl調(diào)pH值至7.0，借助用Ultrogel AcA 202(2×24cm，Pharmacia，Sweden)進(jìn)行的凝膠滲透層析純化產(chǎn)物。根據(jù)EP-A 0329994(實(shí)施例4)利用Ellman試劑測定所得產(chǎn)物中馬來酰亞氨基己?；臄?shù)目。作為常規(guī)，可達(dá)到每摩爾KLH負(fù)載600-900個馬來酰亞氨基己?；?。
將用上述途徑獲得的KLH衍生物用氬凈化約15分鐘。然后按每摩爾馬來酰亞氨基己?；尤?摩爾肽半抗原，并在室溫中保溫3小時。再利用Ultrogel AcA202(2×24cm，Pharmacia，Sweden)進(jìn)行的凝膠滲透層析分離未反應(yīng)的肽而進(jìn)行純化。
實(shí)施例2制備抗HbAl℃的多克隆抗血清2.1免疫用根據(jù)實(shí)施例1.1獲得的免疫原和福氏(Freud)佐劑免疫5只羊。每種情況的劑量為每只動物首次及每次后續(xù)免疫用500μg。用同樣的方式免疫另外5只羊，但每種情況下每只動物每次免疫用1mg免疫原。
用類似的免疫原以同樣的方式免疫10只羊，但在免疫原中，半抗原被結(jié)合到KLH上(根據(jù)實(shí)施例1.2產(chǎn)生)，并且每只動物每次免疫也用500μg或1mg。
5個月(KLH免疫原)或6個月(β-Gal免疫原)后，從所有的動物中采集血清樣本，并利用濁度試驗(yàn)測定所得抗血清的血清滴度。
抗血清試驗(yàn)所用試劑溶血試劑20mM MES pH6.01% SDS0.02% 六氰基高鐵(III)酸鉀0.1% NaN30.5% Brij 35反應(yīng)緩沖液20mM MES pH6.0150mM NaCl0.5% Brij 350.1% NaN33% PEG 6000多半抗原溶液:
20mM MES pH6.0150mM NaCl0.5% Brij 350.1% NaN36% PEG 60000.1% BSA多半抗原 30μg/ml
制備用于檢測的抗血清用二次濃縮的反應(yīng)緩沖液1+1地稀釋血清，于4℃保溫過夜，并經(jīng)離心分離去除所形成的沉淀。上層清液在冰浴中保溫1小時，通過0.22μm的過濾器過濾，并將pH值調(diào)至6.0。如此形成的抗體溶液被直接用于試驗(yàn)中，或進(jìn)一步用反應(yīng)緩沖液稀釋。
檢測為了評估抗血清的滴度，將抗體溶液與多半抗原溶液混合，并用測光法測定所產(chǎn)生的濁度。在Hitachi 704自動分析儀中于37℃下進(jìn)行測定。測定過程如下8μl溶血試劑和350μl抗體溶液混合后保溫5分鐘。繼而加入70μl多半抗原溶液，再保溫5分鐘。于340nm(用700nm作參考波長)測定這一期間形成的濁度作為吸光度。
2.3 結(jié)果結(jié)果總結(jié)于表1(β-Gal免疫原)和2(KLH免疫原)中。許多動物表現(xiàn)出500mA的檢測信號并且在低抗血清稀釋比例(1∶2/1∶4)下更高。在抗血清稀釋比例為1∶8時，上述檢測信號僅適用于一只經(jīng)β-Gal免疫的動物，而8只用KLH免疫的動物情況卻都如此。甚至在該稀釋比例下這些血清中的大多數(shù)仍產(chǎn)生很高的檢測信號并且顯然可在高稀釋比例下用于測定糖基化血紅蛋白。用于免疫的免疫原劑量對血清滴度不產(chǎn)生任何可識別的影響。
表1應(yīng)用結(jié)合到β-半乳糖苷酶上的肽半抗原進(jìn)行免疫所獲得的多克隆抗血清時在競爭性免疫測定中的最大檢測信號。
表2利用結(jié)合到KLH上的肽半抗原進(jìn)行免疫所獲得的多克隆抗血清時在競爭性免疫測定中的最大檢測信號。
實(shí)施例3分離HbAo和HbSo并使HbSo在體外糖基化形成HbSlc市售HbS(Sigma，目錄號H0392)或人紅細(xì)胞溶血液經(jīng)層析分離后用如此純化的HbSo體外與葡萄糖反應(yīng)形成HbSIc。
3.1 分離HbSo將得自Sigma公司的HbS制劑溶解于50mmol/l MES(pH6.2)中，繼而用同樣的緩沖液透析12小時。將透析液加入用上述緩沖液平衡過的S-Sepharose HP層析柱(Pharmacia Company)中。然后進(jìn)行LiCl梯度洗脫，分離HbSo積分，正如利用MonoS/HBAlc柱(Pharmacia Company)及其測定HbAlc的操作說明進(jìn)行的HPLC分析所顯示的那樣，其中不含糖基化血紅蛋白。
3.2 制備糖基化HbS用100mmol/l磷酸鹽緩沖液(pH6.5)透析部分HbSo積分，繼而與2600倍摩爾過量葡萄糖反應(yīng)。37℃保持20小時后中止反應(yīng)，再進(jìn)一步透析保溫混合物以去除葡萄糖。利用HPLC分析透析液。層析譜顯示出部分11.1%糖基化的HbS。
3.3 分離HbAo通過裂解含于蒸餾水中的PBS洗滌人紅細(xì)胞使存在于人紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放出來。離心分離去除細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞影。如此獲得的溶血液用50mM MES(pH6.2)透析。繼而將透析液加入用上述緩沖液平衡過的S-Sepharose HP層析柱(Pharmacia Company)中。然后進(jìn)行LiCl梯度洗脫，分離HbAo積分，正如利用MonoS/HbAlc柱(Pharmacia Company)及其測定HbAlc的操作說明進(jìn)行的HPLC分析所顯示的那樣，其中不含糖基化血紅蛋白。
實(shí)施例4同時測定HbAlc和HbSlc首先，用特殊的溶血試劑使全血樣本溶血，繼而用光度計(jì)(BM/Hitachi 717，Boehringer Mannbeim GmbH)經(jīng)雙通道程序檢測。借助340nm處的濁度檢測在一個通道中進(jìn)行根據(jù)TINIA試驗(yàn)原則進(jìn)行的HbAlc免疫測定(g/dl)，同時借助570nm處的濁度檢測在另外的通道中測定總的血紅蛋白含量。根據(jù)下列公式計(jì)算HbAlc含量的百分比％HbAlC= (HbAlC[g/dl])/(總血紅蛋白［g/dl]) ×100使用了下列試劑1)溶血試劑20mM 磷酸鈉 pH7.40.9% TTAB (十四烷基三甲基溴化銨)2)抗體溶液(R1-HbAlc)20mmol MES緩沖液pH6.2[2-(N-嗎啉代)-乙烷-磺酸]150mmol NaCl3.0%PEG 6000(聚乙二醇，分子量約6000)0.5%BrijR351.0mg/ml PAb<HbAlc>S-IgG(DE)(抗HbAlc的多克隆羊抗體)，用免疫原果糖-Val-His-Leu-Thr-MH-βGal所產(chǎn)生3)多半抗原溶液(R2-HbAlc)20mmol MES緩沖液pH6.2
150mmol NaCl6.0% PEG 60000.5% BrijR3530μg/ml 多半抗原1>
1>多半抗原果糖-Val-His-Leu-Thr，如德國專利申請P.4140142.5所述，通過Cys-馬來酰亞氨基乙酸與葡聚糖偶聯(lián)4)用于總血紅蛋白(R1-Hb)測定的緩沖溶液20mM 磷酸鈉pH7.4150mmol/L NaCl5)校準(zhǔn)液a-e20mmol 磷酸鈉pH7.40.9% TTAB1.4mg/ml 羊血紅蛋白0、0.05、0.1、0.16、0.3人HbAlc4.1 測定HbAlc將溶血試劑以1+100的比例加入樣本中，于25℃保溫約5分鐘。用吸移管將250μl抗體溶液(R1-HbAlc)加入10μl溶血樣本中。于37℃保溫5分鐘后，于700/340nm雙色測定樣本空白值(A1)。測定后約20秒種，加入50μl多半抗原溶液，立即攪拌，于37℃再保溫5分鐘。然后于700/340nm雙色測定濁度(A2)。
根據(jù)下列公式計(jì)算依賴于樣品的吸光度之差
△A＝A2-K·A1其中K代表體積校正系數(shù)K= (V樣本＋VR1)/(V總)用含有HbAlc濃度漸增的校正液a-e建立校正曲線并通過依賴于樣品的吸光度之差△A讀出樣本的未知HbAlc濃度(g/dl)。
4.2 測定總血紅蛋白濃度在4.1部分獲得的溶血液用于總血紅蛋白濃度的測定。血紅蛋白被存在于溶血試劑中的試劑氧化，通過去污劑分子的配位作用得到特征血紅蛋白發(fā)色團(tuán)。20μl該溶血液與230μl緩沖液(R1-Hb)一起吸移到比色杯中，短暫攪拌并于37℃保溫5分鐘后，于660/570nm處雙色檢測吸光度。利用校正液a和生理鹽水溶液(零點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn))建立校正曲線，通過未知樣本的吸光度讀出濃度。
利用下列公式計(jì)算HbAlc的百分含量％HbAlC= (HbAlC[g/dl])/(Hb[g/dl]) ×100實(shí)施例5測定本發(fā)明抗體的特異性為了檢測根據(jù)實(shí)施例2得到的抗體的特異性，根據(jù)實(shí)施例4在Hitachi 717中進(jìn)行HbAlc測定。為此，將HbAo(根據(jù)實(shí)施例3從人血中純化得到)、HbSo(根據(jù)實(shí)施例3純化的Sigma H0392)、含HbSlc(根據(jù)實(shí)施例3在體外制得)的樣本以及具有已知HbAlc值(BioRad，LyphochekR糖尿病對照水平1和2，目錄號740)的兩個全血對照樣作為樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果總結(jié)于表3中。
表3
從上述試驗(yàn)中可以看出，本發(fā)明抗體可識別HbAlc及HbSlc，但不識別相應(yīng)的非糖基化血紅蛋白HbAo和HbSo。
實(shí)施例6在混雜的HbAS樣本中同時測定HbAlc和HbSlc。
用類似于實(shí)施例4的方法在Hitachi 717中檢測混雜的HbAS樣本(30%HbS)。作出對比，HbAlc含量是根據(jù)Bissé E.和Wieland H.，J.Chromatogr.434，1988，95-110(洗脫曲線見

圖1)所述高分辨能力的HPLC方法測定的，而糖基化血紅蛋白的含量利用親和層析Glyc-Affin測定法(IsoLab Company，目錄號SG6200)測定。結(jié)果總結(jié)于表4中。
表4
根據(jù)Bissé和Wieland用HPLC法測得HbAlc值為3.3%。因?yàn)槲创_知HbSlc峰的洗脫時間，所以不能給出糖基化HbS(HbSlc)的值。HbSlc峰可能是31-33分鐘洗脫時間時的峰之一。
由于檢測了HbSlc，所以Tinaquant試驗(yàn)值比HPLC法檢測值約高2.3%。用親和層析法測得7.25%的糖基化血紅蛋白(檢測的糖基化血紅蛋白＝HbAlc+HbSlc+HbSla+HbSlb+ε-賴氨酸-糖基化血紅蛋白)。因?yàn)橐矙z測了上述其它種類的糖基化血紅蛋白，所以Glyc-Affin試驗(yàn)檢測值比所描述的免疫試驗(yàn)值高。在用正常樣本對Tinaquant值和Glyc-Affin值進(jìn)行比較的方法中，獲得了具有很好對比度(見圖2)的對比曲線即
%HbAlc(免疫測定)＝0.66×%糖基化血紅蛋白(親和層析)+0.6如果利用檢測HbAla、HbAlb等的對比曲線公式校正Glyc-Affin值，那么用免疫測定法測定的HbAlc+HbSlc值幾乎相同。
權(quán)利要求
1.可識別HbAlC、HbSlC和HbClC并能通過用至少一種含有糖基化寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu、果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原成分的免疫原進(jìn)行免疫制備的抗體用于同時免疫測定HbAlC、HbSlC和HbClC。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中的免疫測定是根據(jù)凝集試驗(yàn)原理或按照CEDIA、EMIT、FPIA或ELISA技術(shù)進(jìn)行的。
3.可識別HbAlc、HbSlc、和HbClc的抗體，該抗體通過用含有糖基化寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu和/或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原成分的免疫原免疫哺乳動物后從被免疫動物的血清中分離抗體而獲得。
4.識別HbAlc、HbSlc和HbClc的抗體，該抗體通過用含有果糖-Val-His-Leu-Thr作為半抗原成分的免疫原與至少一種含有果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu和/或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原成分的其它免疫原的混合物免疫哺乳動物后從被免疫動物的血清中分離抗體而獲得。
5.如權(quán)利要求3或4所述的抗體，其中該抗體是單克隆抗體，可以通過用權(quán)利要求3或4中提及的免疫原之一免疫、使被免疫動物的脾細(xì)胞永生、克隆那些產(chǎn)生所需抗體的永生細(xì)胞和根據(jù)已知方法分離抗體而獲得。
6.制備可識別HbAlc、HbSlc和HbClc抗體的方法，其中用含有糖基化寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原成分的免疫原或用兩種這類免疫原的混合物免疫哺乳動物后從被免疫動物的血清中分離抗體。
7.制備可識別HbAlc、HbSlc和HbClc單克隆抗體的方法，其中用含有糖基化寡肽果糖-Val-His、果糖-Val-His-Leu或果糖-Val-His-Leu-Thr-Pro作為半抗原成分或用兩種這類免疫原的混合物免疫哺乳動物、使免疫動物的脾細(xì)胞永生、克隆那些產(chǎn)生所需抗體的永生細(xì)胞和根據(jù)已知方法分離抗體。
8.如權(quán)利要求6或7之一所述的方法，其中所用免疫原中的半抗原成分被結(jié)合到作為載體蛋白的KLH上。
9.如權(quán)利要求3-5中所述免疫測定N末端糖基化血紅蛋白含量的抗體用于同時測定血樣中HbAlc、HbSlc和HbClc含量的方法中。
10.用于免疫測定N末端糖基化血紅蛋白的試劑，其中含有至少一種如權(quán)利要求3-5之一所述的抗體。
11.用如權(quán)利要求3-5中所述的抗體同時免疫測定HbAlc、HbSlc和HbClc的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及用識別HbAl
文檔編號A61K39/395GK1094061SQ9312054
公開日1994年10月26日 申請日期1993年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月17日
發(fā)明者J·卡爾, A·芬克, W·D·恩格爾 申請人:曼海姆泊靈格股份公司