專利名稱：持續(xù)釋放制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含生理活性肽的持續(xù)釋放制劑及其生產(chǎn)方法。
現(xiàn)有技術(shù)包括(如EP-A-481.732所公開的)一種包含藥物、聚乳酸和乙醇酸(glycolic acid)-羥基羧酸[HOCH(C2-8烷基)COOH]共聚物的持續(xù)釋放制劑。所公開的方法包括制備W/O乳狀液，該乳狀液由含生理活性肽水溶液的內(nèi)水相和含在有機(jī)溶劑中的生物可降解聚合物溶液的外油相組成，將所述W/O乳狀液加至水或含水介質(zhì)中，使所得到的W/O/W乳狀液處理成為持續(xù)釋放的微膠囊(干燥內(nèi)水(drying-in-water)法)。
EP-A-52510描述一種含類激素活性多肽、生物可降解聚合物和聚合物水解控制劑的微膠囊。公開的其生產(chǎn)方法為凝聚法，該法包括向W/O乳狀液加凝聚劑，所述乳狀液由作為內(nèi)水相的多肽水溶液和作為油相的鹵代有機(jī)溶劑組成，以制備微膠囊。
GB-A-2209937描述一種藥物組合物，它含有聚丙交酯、聚乙交酯、乳酸-乙醇酸共聚物或這些聚合物的混合物以及水不溶性肽。還公開了一種生產(chǎn)方法，該方法包括將一種水不溶性肽的鹽分散于所述聚丙交酯、聚乙交酯、乳酸-乙醇酸共聚物或這些聚合物的混合物的溶液中，通過蒸發(fā)除去溶劑并將所得到的混合物模制成為固體顆粒。
EP-A-58481描述一種生產(chǎn)藥物組合物的方法，該組合物包括聚丙交酯和酸穩(wěn)定多肽，例如溶解四肽胃泌素鹽酸鹽和聚丙交酯于含水二噁烷中，然后將該溶液鑄成薄膜，再蒸發(fā)掉溶劑。
EP-A-0467389報道一種方法適于通過聚合物沉淀或微球體技術(shù)提供供蛋白和多肽用的藥品釋放系統(tǒng)。然而，該文獻(xiàn)不包括有關(guān)LH-RH衍生物系統(tǒng)的具體說明。
釋放促黃體激素的激素，稱為LH-RH(或GnRH)，是由下丘腦分泌的，并與腦下腺上的受體結(jié)合。然后釋放的LH(促黃體激素)和FSH(刺激激素的濾泡)，在生殖腺上起合成類固醇激素的作用。作為LH-RH的衍生物，興奮肽和拮抗肽兩者的存在是已知的。當(dāng)重復(fù)服用大劑量興奮肽時，使有效受體數(shù)目降低，從而抑制衍生類固醇激素的生殖腺形成。因此，希望LH-RH衍生物能成為依賴激素的疾病治療劑的有用成分，所述疾病如前列腺癌、良性前列腺肥大、子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、早熟青春期、乳房癌等，或作為避孕劑的有用成分。尤其是，應(yīng)當(dāng)指出有關(guān)所謂第一和第二代LH-RH拮抗物釋放組胺的活性問題(ThePharmaceuticalsMonthly32，1599-1605，1990)，然而由于許多化合物已被合成，并且近來研制出不明顯釋放組胺活性的LH-RH-拮抗肽(例如，參閱US5110904)，為了使任何這樣的LH-RH拮抗肽能顯示其藥理效應(yīng)，有必要控制釋放系統(tǒng)以便持久抑制內(nèi)生LH-RH的競爭。然而，由于在這類肽中，釋放組胺的活性可能低但不可能不存在，所以要求在給藥后立即抑制起始急劇增強(qiáng)的持續(xù)釋放制劑。
尤其是，在持續(xù)釋放(如1-3個月)制劑的情況下，為了更加確實而安全地達(dá)到理想的效果，保證肽可靠而恒定釋放是重要的。
同時，長期(long-felt)需要生產(chǎn)一種持續(xù)釋放制劑的方法，該制劑對于生理活性肽，特別是LH-RH-拮抗肽具有較高的肽捕集速度。
按照本發(fā)明，可以提供
1)一種持續(xù)釋放制劑，它含有下列通式的生理活性肽
其中X表示?；?R1、R2和R4各表示芳環(huán)基;R3表示D-氨基酸殘基或下式的基團(tuán)
其中R′3是雜環(huán)的基團(tuán);R5表示通式-(CH2)n-R′5基團(tuán)，其中n為2或3，和R′5為取代或未取代的氨基基團(tuán)，芳環(huán)基或O-糖基基團(tuán);R6表示通式-(CH2)n-R′6的基團(tuán)，其中n為2或3，和R′6為取代的或未取代的氨基基團(tuán);
R7表示D-氨基酸殘基或氮雜甘氨酰殘基;和Q表示氫或低級烷基或其鹽和具有末端羧基的生物可降解聚合物，2)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中X是C2-7鏈烷?；?，它可被5-或6-節(jié)雜環(huán)羧基酰胺基取代或未取代，3)按上述2)所述持續(xù)釋放制劑，其中X是C2-4鏈烷?；?，它可被四氫呋喃基羧基酰胺基取代或不取代，
4)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中X是乙?；?，5)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和下列通式羥基羧酸共聚物和(B)聚乳酸的混合物，所述通式為
其中R表示2-8個碳原子的烷基，6)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中X是乙?；?，生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和通式[Ⅱ]羥基羧酸的共聚物和(B)聚乳酸的混合物，7)按上述5)所述持續(xù)釋放制劑，其中共聚物按GPC法測定重均分子量約2000-50000，8)按上述5)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述共聚物分散值約1.2-4.0，9)按上述5)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述聚乳酸按GPC法測量重均分子量約1500-30，000，10)按上述5)所述持續(xù)釋放制劑，其中聚乳酸分散值約1.2-4.0，11)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述生物可降解聚合物是乳酸和乙醇酸的共聚物，12)按上述11)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述共聚物按GPC法測定的重均分子量約為5，000-25，000，13)按上述11)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述共聚物分散值約1.2-4.0，14)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述生理活性肽的比例約0.01-50%(W/W，以生物可降解聚合物計)，15)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述生理活性肽是LH-RH拮抗物，16)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中生理活性肽是
-CONHCH2COD2Nal-D4Clphe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽，17)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中生理活性肽是NAcD2Nal-D4Clphe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽，18)按上述1)所述持續(xù)釋放制劑，其中所述生理活性肽是NAcD2Nal-D4Clphe-D3Pal-Ser-Tyr-DhArg(Et2)-Leu-hArg(Et2)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽，19)一種生產(chǎn)持續(xù)釋放制劑的方法，該方法包括溶解通式[Ⅰ]生理活性肽或其鹽和具有末端羧基的生物可降解聚合物于一種溶劑中，該溶劑與水基本上不溶混，然后除去所述溶劑，20)按上述19)所述的方法，其中所述生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和通式[Ⅱ]羥基羧酸的共聚物和(B)聚乳酸的混合物，21)按上述19)所述的方法，其中X是乙酰基，和生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和通式[Ⅱ]羥基羧酸的共聚物和(B)聚乳酸的混合物，22)按上述19)所述的方法，其中生物可降解聚合物是乳酸和乙醇酸的共聚物，23)按上述19)所述的方法，包括溶解所述生物可降解聚合物和生理活性肽于一種溶劑中，該溶劑與水基本上不溶混，再將所得到的溶液加到含水介質(zhì)中以制備O/W乳狀液，24)一種生產(chǎn)持續(xù)釋放制劑的方法，包括溶解生物可降解的聚合物于溶劑中，該聚合物含(A)乙醇酸和羥基羧酸的共聚物和(B)聚乳酸和基本上水不溶性生理活性肽或其鹽，所述羥基羧酸通式為
其中R表示2-8個碳原子的烷基，所述溶劑基本上與水不溶混，然后除去所述溶劑，和25)按上述24)所述的方法，該方法還包括在溶解所述生物可降解聚合物和基本上水不溶性肽或其鹽于所述溶劑中以后，將所得到的溶液加到含水介質(zhì)中以制備O/W乳狀液。
用于本說明書的略語具有下列含義NAcD2NalN-乙?；?D-3-(2-萘基)丙氨酰D4ClPheD-3-(4-氯代苯基)丙氨酰D3PalD-3-(3-吡啶基)丙氨酰NMeTyrN-MethylthyrosylDLys(Nic)D-(Ipsilon-N-煙酰)賴氨酰Lys(Nisp)(Ipsilon-N-異丙基)賴氨酰DLys(AzaglyNic)D-[1-氮雜-(N-煙酰)甘氨酰]賴氨酰DLys(AzaglyFur)D-[1-氮雜-(N-2-糠酰)甘氨酰]賴氨酰用略語表示任何其它氨基酸的地方，都可使用由生物化學(xué)術(shù)語IUPAC-IUB委員會推薦的略語(EuropeanJournalofBiochemistry138，9-37，1984)或現(xiàn)有技術(shù)中通用的略語。
對于任何化合物來說，如存在光學(xué)異構(gòu)體時，則用L-異構(gòu)體表示，除非另有說明。
在本發(fā)明中，肽[Ⅰ]具有LH-RH拮抗活性，因而對治療依賴激素的疾病如前列腺癌、前列腺肥大、子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤、子宮纖維瘤、早熟青春期、乳房癌等或作避孕劑都是有效的。
相對于通式[Ⅰ]，?；鵛最好是由羧酸衍生物的酰基。酰基的例子包括C2-7鏈烷?；?、C7-15環(huán)烯酰基(Cycloalkenoyl)(例如環(huán)己烯酰)、C1-5烷基氨基甲酰(例如乙基氨基甲酰)、5-或6-節(jié)雜環(huán)羰基(如哌啶子基羰基)和取代或未取代的氨基甲?；?。酰基最好是取代或未取代的C2-7鏈烷?；?如乙酰、丙酰、丁酰、異丁酰、戊酰、己?；蚋?，比較好的是取代或未取代的C2-4鏈烷酰基(如乙酰、丙酰、丁酰、異丁酰)。取代基例如是C1-6烷氨基(如甲氨基、乙氨基、二乙氨基、丙氨基)，C1-3鏈烷酰基氨基(如甲酰氨基、乙酰氨基、丙酰氨基)，C7-15環(huán)烯酰氨基(如環(huán)己酰氨基)，C7-15芳羰基-氨基(如苯甲酰氨基)，5-或6-節(jié)雜環(huán)羧基酰氨基(如四氫呋喃基羧基酰氨基、吡啶基羧基酰氨基、呋喃基羧基酰氨基)，羥基、氨基甲酰基、甲酰基、羧基、5-或6-節(jié)雜環(huán)基(如吡啶基、嗎啉代)。該取代基最好是5-或6-節(jié)雜環(huán)羧基酰氨基(如四氫呋喃基羧基酰氨基、吡啶基羧基酰氨基、呋喃基羧基酰氨基)。
X最好是被5-或6-節(jié)雜環(huán)羧基酰氨基取代或未取代的C2-7鏈烷?；?。
比較好的X是C2-4鏈烷?；?，它可被四氫呋喃基羧基酰氨基取代或未取代。
X的特定例子是乙酰，
-CONHCH2CO-(四氫呋喃基羧基酰氨乙酰基)等等。
芳環(huán)基R1、R2、或R4例如是6-12個碳原子的芳環(huán)基。芳環(huán)基的例子是苯基、萘基、蒽基等。優(yōu)選的是6-10個碳原子的芳環(huán)基，如苯基和萘基。這些芳環(huán)基環(huán)上的合適位置各有1-5、優(yōu)選1-3個合適的取代基。這些取代基包括羧基、鹵素、氨基三唑基取代的氨基、烷氧基等等。優(yōu)選的是羥基、鹵素和氨基三唑基取代的氨基。
上述的鹵素包括氟、氯、溴和碘。
所述氨基三唑基取代的氨基的氨基三唑基部分包括，其中，3-氨基-1H-1，2，4-三唑-5-基、5-氨基-1H-1，3，4-三唑-2-基、5-氨基-1H-1，2，4-三唑-3-基、3-氨基-2H-1，2，4-三唑-5-基、4-氨基-1H-1，2，3-三唑-5-基、4-氨基-2H-1，2，3-三唑-5-基等。
烷氧基優(yōu)選的是1-6個碳原子的烷氧基(如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基等)。
更優(yōu)選的R1是萘基或鹵代苯基。更優(yōu)選的R2是鹵代苯基。更優(yōu)選的R4是羥苯基或氨基三唑基氨基取代的苯基。
D-氨基酸殘基R3最好是3-12個碳原子的α-D-氨基酸殘基。氨基酸的例子是亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、α-氨基丁酸、苯基丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、色氨酸和氨基異丁酸。這些氨基酸都具有合適的保護(hù)基(通?，F(xiàn)有技術(shù)所用的保護(hù)基如叔-丁基、叔-丁氧基、叔-丁氧基羰基等)。
雜環(huán)基R′3包括5-或6-節(jié)各含1-2個氮或硫原子作為雜原子的雜環(huán)基，與苯環(huán)稠合或未稠合。尤其應(yīng)提到噻吩基、吡咯基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、3-吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡唑基、3-苯并[b]噻吩基、3-苯并[b]-3-噻吩基、吲哚基、2-吲哚基、異吲哚基、1H-吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基等。特別優(yōu)選的R′3是吡啶基或3-苯并[b]噻吩基。
芳環(huán)基R5與芳環(huán)基R1、R2或R4相同。該芳環(huán)基在該環(huán)合適的位置上可具有1-5、優(yōu)選1-3個合適的取代基。取代基也可與上述用于R1、R2或R4的取代基相同。特別優(yōu)選的取代基是氨基三唑基取代的氨基。
對于0-糖基R5的糖基最好是己糖或其衍生物。己糖包括D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖等等。作為所述的衍生物，值得指出脫氧糖(L-和D-巖藻糖、D-異鼠李糖、L-鼠李糖等)和氨基糖(D-葡萄胺、D-半乳糖胺等)。比較好的是脫氧糖(L-和D-巖藻糖、D-異鼠李糖、L-鼠李糖等)。更好的是L-鼠李糖。
在取代或未取代氨基上的取代基R′5，包括，其中，?；?、氨基甲?；鶠轷；〈倪沁蚧?Carbazoyl)或為烷基單或雙取代的脒基。
上述?；蜕鲜霰货；〈倪沁蚧孽；燉；酋；?、噻吩甲?；鹊?。
上述單或雙烷基脒基的烷基部分包括1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，因此包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲-丁基和叔-丁基等。優(yōu)選的烷基部分是甲基或乙基。
取代或未取代氨基的取代基R′6包括烷基和被烷基單取代或雙取代的脒基。
上述烷基和上述單或雙烷基脒基的烷基包括適用于R′5的上述烷基。
優(yōu)選的D-氨基酸殘基R7是3-9個碳原子的D-氨基酸殘基，如D-丙氨?；-白氨?；-纈氨?；?、D-異白氨?；?、D-苯丙氨酰基等。比較好的是3-6個碳原子的D-氨基酸殘基，如D-丙氨酰基、D-纈氨酰基等等。最好R7是D-丙氨?；?。
低級烷基Q可以是為R′5限定的烷基。最好的Q是甲基。
當(dāng)肽[Ⅰ]具有一個或多個不對稱碳原子時，則存在兩種或多種立體異構(gòu)體。任何這種立體異構(gòu)體及其混合物都在本發(fā)明范圍內(nèi)。
通式[Ⅰ]肽是由本來已知的方法生產(chǎn)的。有代表性的特定方法描述于US5110904中。
肽[Ⅰ]可以鹽的形式使用，最好是藥用鹽。當(dāng)肽具有堿性基團(tuán)如氨基時，所述鹽包括用無機(jī)酸(例如鹽酸、硫酸、硝酸等)和有機(jī)酸(例如碳酸、酸式碳酸、琥珀酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸等等)生成的鹽。當(dāng)肽具有酸性基團(tuán)如羧基時，可與無機(jī)堿(例如堿金屬如鈉、鉀等和堿土金屬如鈣、鎂等)或有機(jī)堿(例如有機(jī)胺如三乙胺和堿性氨基酸如精氨酸)生成鹽。肽[Ⅰ]可呈金屬絡(luò)合化合物的形式(例如銅絡(luò)合物、鋅絡(luò)合物等)存在。優(yōu)選肽[Ⅰ]的鹽是與有機(jī)酸(例如碳酸、酸式碳酸、琥珀酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸等)生成鹽。最好的是乙酸鹽。
特別優(yōu)選的肽[Ⅰ]或鹽如下(1)NAcD2Nal-D4Clphe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽(2)NAcD2Nal-D4lphe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyNic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽(3)NAcD2Nal-D4Clphe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyFur)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽(4)
-CONHCH2COD2Nal-D4Clphe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽(5)NAcD2Nal-D4Clphe-D3Pal-Ser-Tyr-DhArg(Et2)-Leu-hArg(Et2)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽，
在持續(xù)釋放制劑中，肽[Ⅰ]的比例可根據(jù)肽的類型、期望的生理效應(yīng)和效應(yīng)持續(xù)時間及其它因素而變化，按生物可降解聚合物計可從約0.01變至約50%(W/W)。優(yōu)選范圍約0.1-約40%(W/W)，比較好的范圍約1-約30%(W/W)。
現(xiàn)描述具有末端羧基的生物可降解聚合物。
使大約1-3g的生物可降解聚合物溶解于丙酮(25ml)和甲醇(5ml)的混合物中，并用酚肽作指示劑，在室溫(20℃)攪拌條件下，迅速用0.05N醇的氫氧化鉀溶液滴定該溶液中的羧基。通過端基測定法按下列方程式計算數(shù)均分子量。
按端基測定法的數(shù)均分子量＝20000×A/B，其中A是生物可降解聚合物的質(zhì)量(g);
B是加至反應(yīng)滴定終點的0.05N醇的氫氧化鉀溶液(ml)量。
上述計算結(jié)果稱為端基測定法數(shù)均分子量。
為便于說明，把具有末端羧基的聚合物看作是由一種或多種α-羥基酸通過作為例子的非催化脫水縮聚法合成的，端基測定法數(shù)均分子量與GPC法的數(shù)均分子量大致相同。相反，在基本上不含游離末端羧基的聚合物情況下，可看作通過開環(huán)聚合法并用催化劑由環(huán)狀二聚合成的，端基測定法的數(shù)均分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于GPC測定法的數(shù)均分子量。根據(jù)這一差別，能清楚地鑒別具有末端羧基的聚合物與不具末端羧基的聚合物。因此，本文所用術(shù)語“具有末端羧基的生物可降解聚合物”意思是指GPC測定法的數(shù)均分子量和端基測定法的數(shù)均分子量基本一致的生物可降解聚合物。
鑒于端基測定法的數(shù)均分子量是絕對值，而GPC測定法的數(shù)均分子量是相對值，這些值按照分析和程序條件(如流動相和柱的類型、參比物、選擇片寬、選擇基線等)而變化。因此，兩種值在數(shù)值上不可能統(tǒng)一關(guān)聯(lián)。然而，GPC測定法的數(shù)均分子量和端基測定法的數(shù)均分子量之間的‘基本一致’這術(shù)語含義是端基測定法數(shù)均分子量約為GPC測定法數(shù)均分子量的0.4-2倍，較好的約0.5-2倍，最好約0.8-1.5倍。上述使用的術(shù)語“遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于”的含義是端基測定法的數(shù)均分子量約為GPC測定法數(shù)均分子量的兩倍或更多。
用于本發(fā)明目的的優(yōu)選聚合物是GPC測定法的數(shù)均分子量和端基測定法的數(shù)均分子量基本一致的聚合物。
作為具有末端羧基的生物可降解聚合物的具體例子可為聚合物和共聚物及其混合物，它們是由一種或多種α-羥基酸(如乙醇酸、乳酸、羥基丁酸等)、羥基二羧酸(如蘋果酸等)、羥基三羧酸(如檸檬酸等)通過非催化脫水縮聚反應(yīng)合成的，還可為聚-α-氰基丙烯酸酯、聚氨基酸(如聚-γ-芐基-L-谷氨酸等)、馬來酸酐共聚物(如苯乙烯-馬來酸共聚物等)等等。
聚合模式可以是無規(guī)、嵌段或接枝。上述任何α-羥基酸、羥基二羧酸和羥基三羧酸(在其分子內(nèi)均具有光學(xué)活性中心，任何D-、L-和DL-型)都可使用。
具有末端羧基的生物可降解聚合物最好是包含(A)乙醇酸和如下通式羥基羧酸
其中R表示2-8個碳原子烷基的共聚物和(B)聚乳酸或乳酸-乙醇酸共聚物的混合物。
有關(guān)通式(Ⅱ)，2-8個碳原子的直鏈或支鏈烷基，用R表示，包括，尤其是乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲-丁基、叔-丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔-戊基、1-乙丙基、己基、異己基、1，1-二甲丁基、2，2-二甲丁基、3，3-二甲丁基和2-乙丁基。其中優(yōu)選的是2-5個碳原子的直鏈或支鏈烷基。特別優(yōu)選的是，乙基、丙基、異丙基、丁基和異丁基。最佳的R是乙基。
通式[Ⅱ]的羥基羧酸包括尤其是α-羥基丁酸、α-羥基戊酸、α-羥基-3-甲基丁酸、α-羥基己酸、α-羥基異己酸和α-羥基癸酸。優(yōu)選的是α-羥基丁酸、α-羥基戊酸、α-羥基-3-甲基丁酸和α-羥基己酸。通式[Ⅱ]的羥基羧酸最好的是α-羥基丁酸。盡管這些羥基羧酸可以是任何D-、L-和DL-化合物，但是D-/L-比值(mol%)最好約為75/25-25/75。最佳實施方案是D-/L-比值在約60/40-約40/60范圍內(nèi)的羥基羧酸。最佳的是D-/L-比值(mol%)在約55/45-約45/55范圍內(nèi)的羥基羧酸。
對于乙醇酸和通式[Ⅱ]的所述羥基羧酸共聚物(下文稱作乙醇酸共聚物)，共聚模式可以是無規(guī)、嵌段或接枝的。優(yōu)選的是無規(guī)共聚物。
通式[Ⅱ]的羥基羧酸可單獨使用或混合使用。
乙醇酸和羥基羧酸[Ⅱ]在所述乙醇酸共聚物(A)中的優(yōu)選比例是乙醇酸約10-約75mole%，其余為羥基羧酸。較理想的是，該共聚物由約20-約75mole%的乙醇酸和余量的羥基羧酸組成。最理想的是，該共聚物由約40-約70mole%的乙醇酸和余量為羥基羧酸組成。所述乙醇酸共聚物的重均分子量范圍約2，000-約50，000。優(yōu)選范圍約3，000-約40，000。最好的范圍約8，000-約30000。分散值(重均分子量/數(shù)均分子量)優(yōu)選范圍約1.2-約4.0。特別好的是分散值在約1.5-約3.5范圍內(nèi)的共聚物。
乙醇酸共聚物(A)可用已知方法合成，例如日本待公開專利申請28521/1986說明書中所述的方法。
用于本發(fā)明的聚乳酸可L-和D-化合物及其混合物。優(yōu)選的是D-/L-比值(mole%)在約75/25-約20/80范圍內(nèi)的一種。較好的聚乳酸D-/L-比值(mole%)在約60/40-約25/75。最為有利的聚乳酸D-/L-比值(mole%)在約55/45-約25/75。聚乳酸重均分子量優(yōu)選范圍約1500-約30000，較好的約2000-約20000，更好的約3000-約15000。優(yōu)選的聚乳酸分散值約1.2-約4.0，較理想的約1.5-約3.5。
聚乳酸可用兩種已知的可替換方法合成，即涉及乳酸二聚體的丙交酯開環(huán)聚合方法和涉及乳酸脫水縮聚的方法。為生產(chǎn)用于本發(fā)明的分子量較低的聚乳酸，優(yōu)選的是涉及乳酸直接脫水縮聚的方法。該法如日本待公開專利申請28521/1986所述。
在用于本發(fā)明的藥物堿中，使用(A)/(B)比值(按重量計)約10/90-約90/10的乙醇酸共聚物(A)和聚乳酸(B)。優(yōu)選的混合比約20/80-約80/20。最理想比值約30/70-約70/30。假若(A)或(B)的比例過大時，最終制劑顯示的藥品釋放模式與僅用(A)或(B)時所得到的模式相差無幾，也就是說在用混合堿獲得的釋放晚期中不可能獲得線性釋放模式。乙醇酸共聚物和聚乳酸的降解和消除速率隨著它們的分子量和成分顯著變化，但是一般說來，由于乙醇酸共聚物的分解和消除速率相對高些，所以釋放時間會因聚乳酸分子量的增加或混合比(A)/(B)的減少而延長。相反地，釋放期限會因聚乳酸分子量減少或(A)/(B)混合比的提高而縮短。此外，釋放期限可通過改變通式[Ⅱ]羥基羧酸的種類或相對量得到調(diào)節(jié)。
當(dāng)用乳酸和乙醇酸的共聚物作生物可降解聚合物時，它的聚合比(乳酸/乙醇酸)(moie%)優(yōu)選約100/0約40/60。較好的比值約90/10-約50/50。
所述共聚物重均分子量優(yōu)選的5000-約25000。較好的范圍約7，000-約20，000。
所述共聚物的分散程度(重均分子量/數(shù)均分子量)優(yōu)選約1.2-約4.0。較好的范圍約1.5-約3.5。
上述乳酸和乙醇酸的共聚物可通過已知方法合成，例如通過描述于日本待公開專利申請28521/1986中的方法。
乳酸和乙醇酸共聚物的分解和消失速率會隨成分和分子量而大大改變，然而一般說來，乙醇酸越少，分解和消失速率越低。此外，藥品釋放期限會通過減少乙醇酸或提高分子量而延長。相反，釋放期限能通過提高乙醇酸分?jǐn)?shù)或降低分子量而縮短。為了制備長期(例如1-4個月)持續(xù)釋放制劑，最好使用聚合比在上述范圍內(nèi)和重均分子量也在上述范圍內(nèi)的乳酸和乙醇酸的共聚物。在用分解速率高于上述聚合比和重均分子量范圍內(nèi)的乳酸和乙醇酸共聚物時，控制起始急劇增加是困難的。相反，使用低于上述聚合比和重均分子量范圍內(nèi)分解速率的乳酸和乙醇酸共聚物時，在該期間將不能釋放有效量藥物。
在本說明書中，重均分子量和分散度意味著分別用重均分子量120，000、52，000、22，000、9200、5050、2950、1050、580和162的9種聚苯乙烯作參比物通過凝膠滲透色譜(GPC)測得的聚苯乙烯分子量和用該分子量計算該分散值。上述測定是用GPC柱KF804L×2(ShowaDenko)，RI檢測器L-3300(Hitachi)和氯仿作流動相進(jìn)行的。
本發(fā)明持續(xù)釋放制劑是通過溶解肽[Ⅰ]和具有末端羧基的生物可降解聚合物于一種溶劑中而生產(chǎn)的，該溶劑與水基本上不溶混，然后除去所述溶劑。
與水基本不溶混的溶劑是一種不僅基本與水不溶混而且能溶解生物可降解聚合物的溶劑，該溶劑還能使產(chǎn)生的聚合物溶液能溶解肽[Ⅰ]。最好溶劑在水中在室溫下(20℃)溶解度不超過3%(W/W)。該溶劑的沸點不高于120℃。這樣所述溶劑包括鹵代烴(如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)、3個或更多個碳原子的烷基醚(如異丙醚等)、脂肪酸烷基(4個或更多個碳原子的)酯(如乙酸丁酯等)、芳族烴(如苯、甲苯、二甲苯等)等等。這些溶劑可以2種或更多種適當(dāng)混合使用。比較好的溶劑是鹵代烴(如二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、三氯乙烷、四氯化碳等)。最好的是二氯甲烷。
溶劑的去除可按本質(zhì)上已知的程序進(jìn)行。例如，所述方法包括大氣壓下蒸發(fā)溶劑或用推進(jìn)式混合器恒定攪拌或電磁攪拌逐漸分解下蒸發(fā)溶劑或在可控真空度下用旋轉(zhuǎn)式汽化器蒸發(fā)溶劑，這些方法都可使用。
有關(guān)本發(fā)明生產(chǎn)持續(xù)釋放制劑的方法，溶解肽[Ⅰ]和具末端羧基的生物可降解聚合物意味著達(dá)到一種條件以使得到的溶液在一般溫度(20℃)下沒有用肉眼可觀察到未溶解的肽殘渣。在這種由肽[Ⅰ]、生物可降解聚合物和溶劑組成的三元體系中，能溶解的肽量取決于每單位重量生物可降解聚合物的末端羧基數(shù)。在肽和末端羧基以1∶1的比例相互反應(yīng)的情況下，理論上溶解的肽摩爾量與末端羧基相等。因此，溶劑的組合與肽和生物可降解聚合物分子量很難統(tǒng)一。然而，在生產(chǎn)持續(xù)釋放制劑中，就溶解于溶劑中的生物可降解聚合物而論，肽可溶解范圍約0.1-約100%(W/W)，優(yōu)選約1-約70%(W/W)，最好約2-約50%(W/W)。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)持續(xù)釋放制劑的方法，該法包括溶解生物可降解聚合物和基本上水不溶性生理活性肽或其鹽于一種溶劑中，所述聚合物包含(A)乙醇酸和下列通式羥基酸的共聚物，所述通式為
其中R表示2-8個碳原子的烷基，和(B)聚乳酸的混合物，所述溶劑與水基本上不溶混，然后除去所述溶劑。
基本上水不溶性的生理活性肽是沒有限制的，而且包括天然存在的、合成的和半合成肽。優(yōu)選的是在其側(cè)鏈含一個或多個芳基(如由苯、萘、菲、蒽、吡啶、吡咯、吲哚等衍生出來的基團(tuán))的生理活性肽。較好的生理活性肽是其側(cè)鏈具有2個或更多個芳基的肽。特別好的生理活性肽是其側(cè)鏈具有3個或更多芳基的所述肽。這些芳基可被進(jìn)一步取代。
用於本發(fā)明的基本上水不溶性生理活性肽優(yōu)選的是在水中溶解度不大于1%、由兩種或更多種氨基酸組成并具有約200-30，000分子量的肽。分子量范圍較好的約300-20，000，更好的范圍約500-10，000。
所述生理活性肽實例為釋放激素拮抗物的促黃體激素(LH-RH)(見US4，086，219、4，124，577、4，253，997和4，317，815等)、胰島素、生長激素釋抑制因子、生長激素抑制因子衍生物(見US4，087，390、4，093，574、4，100，117、4，253，998等)、生長激素、催乳激素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、促黑激素(MSH)、釋放激素的甲狀腺激素鹽和衍生物(見JP公開S-50-121273和S-52-116465)、促甲狀腺(刺激)激素(TSH)、促黃體激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、加壓素、加壓素衍生物、催產(chǎn)素、降鈣素、胃泌素、胰泌素、促胰酶素、膽囊收縮素、血管緊張素、人胎盤催乳激素、人絨促性素(HCG)、腦啡肽、腦啡肽衍生物(見US4，277，394、EP-A31567)、內(nèi)啡肽、kyotrphin、tuftsin、促胸腺生長素(thymopoietin)、胸腺素、胸腺刺激素(thymostimulin)、胸腺素體液因子(THF)，facteurthymiqueserique(FTS)及其衍生物(見US4，229，438)、其它胸腺素因子、瘤壞死因子(TNF)、促菌落因子(Colonystimulatingfactor(CSF)、蠕動素(motilin)、dynorphin、bombesin、神經(jīng)降壓素、cerulein、緩激肽、atrialnatrureticfactor、神經(jīng)生長因子、細(xì)胞生長因子、neurotrophicfactor、具有endothelin拮抗活性的肽(見EP-A436189、457195和496452、JP公開H-3-94692和03-130299)以及這些生理活性肽的片段或衍生物。
生理活性肽的具體實例是能釋放激素(LH-RH)的促黃體激素拮抗物的生理活性肽和鹽，并且可用于治療依賴激素的疾病，如前列腺癌、前列腺肥大、子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤、早熟青春期、乳房癌等和用于避孕。
用于本發(fā)明的生理活性肽可以鹽的形式存在，優(yōu)選為藥用鹽。當(dāng)所述肽具有堿性基團(tuán)如氨基時，上述鹽例如可用無機(jī)酸(如鹽酸、硫酸、硝酸等)或有機(jī)酸(如碳酸、酸式碳酸、琥珀酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸等)成鹽。當(dāng)肽具有如羧基的酸性基團(tuán)時，所述鹽例如可用無機(jī)堿(例如堿金屬如鈉、鉀等和堿土金屬如鈣、鎂等)或有機(jī)堿(例如有機(jī)胺如三乙胺等和堿性氨基酸如精氨酸)成鹽。
生理活性肽或其鹽的具體實例可見美國專利5110904、JournalofMedicinalChemistry34，2395-2402，1991，RecentRusultsinCancerRessarch124，113-136，1992，和其它文獻(xiàn)中。
此外，也可為通式[Ⅰ]的生理活性肽及其鹽。
然而，即使生理活性肽是水溶性時，也可轉(zhuǎn)化成為不溶性的衍生化合物或用水不溶性酸(例如雙羥萘酸、鞣酸、硬脂酸、棕櫚酸等)轉(zhuǎn)化成不溶性鹽而用於本發(fā)明方法中。
所述生理活性肽在本發(fā)明制劑中的量取決於肽的種類、期望的生理效應(yīng)以及效應(yīng)的所要持續(xù)時間等等。然而，一般來說使用的比例相對於生物可降解聚合物堿來說約0.001-50%(w/w)，優(yōu)選約0.01-40%(w/w)，較好的約0.1-30%(w/w)。
用于所述方法中的溶劑與上述相同。
溶劑的去除可用與上述同樣方法完成。
生產(chǎn)本發(fā)明持續(xù)釋放制劑的優(yōu)選方法是使用內(nèi)水干燥技術(shù)或相分離技術(shù)的微囊包封法(如下所述)或任何與此類似的方法。
下文描述的方法可用肽[Ⅰ]或包括肽[Ⅰ]在內(nèi)的基本上水不溶性生理活性肽來完成。
于是，將肽[Ⅰ]按上述最終重量比加到生物可降解聚合物的有機(jī)溶劑溶液中以制備含肽[Ⅰ]和生物可降解聚合物的有機(jī)溶劑溶液。就此而論，生物可降解聚合物在有機(jī)溶劑中的濃度隨生物可降解聚合物的分子量和有機(jī)溶劑的類型而變化，但通常選擇的范圍約0.01-約80%(w/w)。優(yōu)選范圍約0.1-約70%(w/w)。更好的范圍約1-約60%(w/w)。
然后，將這種含肽[Ⅰ]和生物可降解聚合物(油相)的有機(jī)溶劑溶液加到水相中以制備o(油相)/w(水相)乳狀液。然后將油相溶劑蒸發(fā)掉以制成微膠囊。用于該步驟水相的體積通常選擇的范圍為油相體積約1-約10000倍。優(yōu)選范圍約2-約5000倍，更好的范圍約5-約2000倍。
將乳化劑加到上述水相中。通常乳化劑可以是任何對形成穩(wěn)定o/w乳狀液有貢獻(xiàn)的物質(zhì)。本文提到的是陰離子表面活性劑(油酸鈉、硬脂酸鈉、十二烷基硫酸鈉等)、非離子表面活性劑(聚氧乙烯-山梨糖醇酐脂肪酸酯[吐溫80和吐溫60，Atlaspowder]、聚氧乙烯-蓖麻油衍生物[HCO-60和HCO-50，NikkoChemicals]等)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纖維素、卵磷酯、明膠、透明質(zhì)酸等等。這些乳化劑可單獨使用也可混合使用。選擇的濃度范圍約0.001-約20%(w/w)。優(yōu)選范圍約0.01-約10%(w/w)。更好的范圍約0.05-約5%(w/w)。
所得到的微膠囊通過離心或過濾回收，再用若干蒸餾水洗滌以除去表面上的游離肽、載體和乳化劑，然后再分散於蒸餾水或類似物中并凍干。如需要的話，使微膠囊在減壓條件下加熱以進(jìn)一步除去微膠囊內(nèi)的殘余水份和有機(jī)溶劑。最好，該法通過微膠囊在稍高于5℃或更高溫度下，用差示掃描量熱計以10-20℃/分的溫度增值測量的生物可降解聚合物中等玻璃轉(zhuǎn)化溫度下加熱完成，通常在微膠囊已達(dá)到目的溫度后持續(xù)加熱不超過1周或2-3天，最好不超過24小時。
在用相分離技術(shù)生產(chǎn)微膠囊時，將凝聚劑逐漸加到恒定攪拌的所述肽[Ⅰ]和生物可降解聚合物的有機(jī)溶劑溶液內(nèi)，以使生物可降解聚合物分離后固化。所加凝聚劑的體積為肽[Ⅰ]和生物可降解聚合物有機(jī)溶劑溶液體積約0.01-約1000倍。優(yōu)選范圍約0.05-約500倍，更好的范圍約0.1-約200倍。
凝聚劑是一種聚合物、礦物油或植物油型的化合物，它與供生物可降解聚合物用的溶劑溶混但不溶解該聚合物。特別是，值得提出硅油、芝麻油、豆油、玉米油、棉籽油、椰子油、亞麻子油、礦物油、正-己烷、正-庚烷等。這些物質(zhì)可混合使用。
所得到的微膠囊通過過濾回收，并用庚烷或類似物反復(fù)洗滌以除去凝聚劑。然后再按內(nèi)水干燥技術(shù)所述的相同程序除去游離的肽和溶劑。
在用內(nèi)水干燥技術(shù)或凝聚技術(shù)時，可加聚集抑制劑以防顆粒聚集。聚集抑制劑包括水溶性多糖類如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、淀粉(如玉米淀粉)等、甘氨酸、蛋白質(zhì)如血纖維蛋白、膠原等，和無機(jī)鹽如氯化鈉、磷酸氫鈉等等。
在用噴霧干燥技術(shù)生產(chǎn)微膠囊時，使所述肽[Ⅰ]和生物可降解聚合物的有機(jī)溶劑溶液通過噴嘴以霧狀噴入噴霧干燥器的干燥室以便在很短時間內(nèi)從很細(xì)液滴中蒸發(fā)出有機(jī)溶劑，形成細(xì)微膠囊。噴嘴可以是一種雙流體噴嘴、壓力噴嘴、轉(zhuǎn)盤式噴嘴等等。為了防止膠囊間的聚集，在噴霧肽[Ⅰ]和生物可降解聚合物的有機(jī)溶劑溶液的同時最好在該工序從另一個噴嘴噴入所述聚集抑制劑的水溶液。
如有必要，可在上述相同方法的減壓條件下加熱所得到的微膠囊，從而除去殘余水份和有機(jī)溶劑。
該微膠囊可直接給藥或加工成各種適於非口服或口服的藥用制劑而給藥，非口服給藥例如肌肉、皮下和器官內(nèi)注射或植入、鼻、直腸或子宮轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)釋放體系等，口服給藥例如固體制劑如膠囊(例如硬膠囊、軟膠囊等)、顆粒、粉劑等和液體制劑如糖漿、乳狀液、懸浮液等。
對于供注射用的微膠囊方法來說，例如為了制成供可控釋放注射用的油懸浮液，可用分散劑(例如表面活性劑如吐溫80、HCO-60等、羧甲基纖維素、多糖類如藻酸鈉等)、防腐劑(例如羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯等)、或等滲劑(例如氯化鈉、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖等)配制微膠囊以制備水懸浮液或?qū)⑵浞稚㈧吨参镉腿缰ヂ橛?、玉米油或其它同類物中?br> 用于可注射懸浮液的微膠囊粒徑不僅其分散性和針形通道要求在含人滿意的范圍內(nèi)，而且可從例如約0.1到約500μm變化。優(yōu)選粒徑范圍約1-約300μm，更好的范圍約2-約200μm。
為了提供作消毒產(chǎn)品用的微膠囊，整個生產(chǎn)過程需經(jīng)消毒管理，微膠囊可通過γ-射線輻射消毒或加防腐劑消毒，不過這些并不是唯一的工序。
除了上述微膠囊外，用合適方法使含有均勻分散的活性成分肽的生物可降解聚合物組合物熔融并模制成球形、棒形、針形、丸狀或膜狀，以制成本發(fā)明持續(xù)釋放的制劑。上述生物可降解聚合物組合物可通過JP公開S-50-17525所述方法生產(chǎn)。具體來說，先使肽藥品和聚合物溶於溶劑中，然后，通過合適的方法(例如噴霧干燥、閃蒸等)除去溶劑以制成所要的生物可降解聚合物組合物。
本發(fā)明持續(xù)釋放制劑可按下列形式如肌肉、皮下或器官內(nèi)注射或植入、用于鼻腔、直腸或子宮轉(zhuǎn)化粘液質(zhì)釋放系統(tǒng)，或口服制劑(例如固體制劑如膠囊(例如硬或軟的)、粒劑、粉劑等，或液體制劑如糖漿、乳狀液、懸浮劑等)給藥。
本發(fā)明的持續(xù)釋放制劑具有很低的毒性，因而可安全地用于哺乳動物(例如人、牛、豬、犬、貓、小白鼠(murine)、老鼠(rat)和(兔)。
持續(xù)釋放制劑的劑量取決于活性藥用肽的類型和含量、最終劑型、肽釋放持續(xù)時間、治療對象(如依賴激素的疾病，例如前列腺癌、前列腺肥大、子宮內(nèi)膜異位、子宮纖維瘤、早熟青春期、乳房癌等或用于避孕)和處理對象動物的類別，然而在任何情況下，均必須成功釋放有效量的肽?；钚运幱秒牡膯挝粍┝?，取一個月的釋放體系作例子，選擇的范圍最好約0.01-約100mg/kg成人體重。優(yōu)選范圍約0.05-約50mg/kg體重。最好的范圍約0.1-約10mg/kg體重。
因此，對每個成人來說持續(xù)釋放制劑的單位劑量可選范圍約0.1-約500mg/kg體重。優(yōu)選范圍約0.2-約300mg/kg體重。約藥次數(shù)例如幾周、一月一次或幾月一次，并且能按活性藥用肽的類型和含量、最終劑型、設(shè)計的肽釋放期限、欲控制的疾病以及研究對象動物進(jìn)行選擇。
下列參考和工作實例是想進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但決不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限定。(除非另有規(guī)定，%系指按重量計的%)。
用于下文的略語具有下列定義BOC叔-丁氧基羰基FMOC9-芴基甲氧基羰基Cbz芐氧基羰基參考例1在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入300g90%的D，L-乳酸水溶液和100g90%的L-乳酸水溶液，進(jìn)料在減壓的氮氣流下從100℃/500mmHg到150℃/30mmHg加熱4個多小時，同時不斷移出蒸餾水、在3-5mmHg/150-180℃的減壓條件下再使反應(yīng)混合物加熱7小時，然后使之冷卻制成琥珀色的聚乳酸。
將該聚合物溶解於1000ml的二氯甲烷中，在恒定攪拌下將該溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物，再于30℃下的真空中干燥。
上述聚乳酸按GPC測定重均分子量和數(shù)均分子量和按端基測定法測定數(shù)均分子量分別為3，000;1，790和1，297。
這些數(shù)據(jù)表明該聚合物具有末端羧基。
參考例2在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入500g90%的D，L-乳酸水溶液，進(jìn)料在減壓的氮氣流下(從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱4個小時，同時持續(xù)移出蒸餾水，在3-5mmHg/150-180℃的減壓條件下再使反應(yīng)混合物加熱12小時，然后使之冷卻制成琥珀色的聚乳酸。
將該聚合物溶解於1000ml的二氯甲烷中，再于恒定攪拌下將該溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物并于30℃下的真空中干燥。
上述聚乳酸按GPC測定重均分子量和數(shù)均分子量，并按端基測定法測定數(shù)均分子量，分別為5，000;2，561;和1，830。
這些數(shù)據(jù)表明該聚合物具有末端羧基。
參考例3在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入300g90%的D，L-乳酸水溶液和100g90%的L-乳酸水溶液，進(jìn)料在減壓氮氣流下(從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱5小時，同時不斷移出蒸餾水，在5-7mmHg/150-180℃的減壓條件下使反應(yīng)混合物再加熱18小時，然后使之冷卻制成琥珀色聚乳酸。
將該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，所得溶液在恒定攪拌下倒入60℃的溫水中。收集生成的粘性聚合沉淀物并于30℃的真空中干燥。
上述聚乳酸按GPC測定重均分子量和數(shù)均分子量，再用端基測定法測定數(shù)均分子量，分別為7，500;3，563;和2，301。
這些數(shù)據(jù)表明該聚合物具有末端羧基。
參考例4在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入300g90%的D，L-乳酸水溶液和100g90%的L-乳酸水溶液，進(jìn)料在減壓的氮氣流中(從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱5小時，同時不斷移出蒸餾水，在5-7mmHg/150-180℃的減壓條件下使反應(yīng)混合物再加熱26小時，然后使之冷卻制成琥珀色的聚乳酸。
將該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，并在恒定攪拌條件下將溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物，并于30℃的真空中干燥。
上述聚乳酸按GPC測定重均分子量和數(shù)均分子量，并按端基測定法測定數(shù)均分子量，分別為9，000;3，803;和2，800。
這些數(shù)據(jù)表明該聚合物具有末端羧基。
參考例5在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入182.5g乙醇酸和166.6g的D，L-2-羥基丁酸，進(jìn)料在減壓的氮氣流下(從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱3.5小時，同時不斷移出蒸餾水，在5-7mmHg/150-180℃的減壓條件下再使反應(yīng)混合物加熱26小時，然后使之冷卻制成琥珀色乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物。
將該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，并在恒定攪拌條件下將溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物，并于25℃的真空中干燥。
所得乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物，按GPC法測定的重均分子量為13，000。
參考例6在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入197.7g乙醇酸和145.8g的D，L-2-羥基丁酸，進(jìn)料在減壓的氮氣流中(從100℃/500mmHg-155℃/30mmHg)加熱4小時，同時不斷移出蒸餾水，在3-6mmHg/150-185℃的減壓條件下，使反應(yīng)混合物再加熱27小時，然后使之冷卻制形成琥珀色乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物。
使該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，在恒定攪拌條件下將溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物，并于25℃的真空中干燥。
用GPC法測定上述所得乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物的重均分子量為13，000。
參考例7在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入212.9g乙醇酸和124.9g的D，L-2-羥基丁酸，進(jìn)料在減壓的氮氣流中(從100℃/500mmHg-160℃/30mmHg)加熱3.5小時，同時不斷移出蒸餾水，在3-6mmHg/160-180℃的減壓條件下使反應(yīng)混合物加熱27小時，此后使之冷卻形成琥珀色乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物。
使該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷內(nèi)，拌隨恒定攪拌將溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物，并于25℃的真空中干燥。
用GPC法測定所得乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物的重均分子量為11，000。
參考例8在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入300g90%的D，L-乳酸水溶液和100g90%的L-乳酸水溶液，使進(jìn)料在減壓的氮氣流內(nèi)(從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱4小時，同時不斷移出蒸餾水。使反應(yīng)混合物在3-5mmHg/150-180℃的減壓條件下再加熱10小時，然后冷卻，形成琥珀色的聚乳酸。
將該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，拌隨恒定攪拌將溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物，并于30℃的真空中干燥。
上述聚乳酸按GPC法測定重均分子量和用端基測定法測定數(shù)均分子量，分別為4，200;2，192;和1，572。
這些數(shù)據(jù)表明該聚合物具有末端羧基。
參考例9在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入182.5g乙醇酸和166.6gD，L-2-羥基丁酸，使進(jìn)料在減壓的氮氣流內(nèi)(從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱3.5小時，同時不斷移出蒸餾水，在5-7mmHg/150-180℃的減壓條件下使反應(yīng)混合物再加熱32小時，然后使之冷卻，形成琥珀色乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物。
將該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，拌隨恒定攪拌將溶液倒入60℃的溫水中。收集所得到的粘性聚合沉淀物，并于25℃的真空中干燥。
所得乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物按GPC法測定重均分子量和數(shù)均分子量，用端基測定法測定數(shù)均分子量，分別為16，300;5，620;和2，904。
這些數(shù)據(jù)表明該聚合物具有末端羧基。
參考例10合成NAcD2NaL-D4Clphe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyFur)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2參考例10和11是按US5，110，904和US專利申請(號07/987，921)所述方法進(jìn)行的。
往肽合成器的反應(yīng)器加1g的D-Ala-NH-樹脂(4-甲基-benzohydrylamine樹脂)，隨后按下列合成工序相繼加入氨基酸，以合成標(biāo)題肽。
1.去保護(hù)(deprotecting)反應(yīng)為了除去肽的α-氨基酸的保護(hù)BOC基團(tuán)，使用一種由45%三氟乙酸(下文稱TFA)、2.5%茴香醚、2.0%亞磷酸二甲酯和50.5%二氯甲烷組成的溶液。用該溶液預(yù)洗滌樹脂1分鐘后，進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)20分鐘。
2.用堿性溶液洗滌為了除去和中和用於去保護(hù)的三氟乙酸，使用含10%N，N′-二異丙基乙胺的二氯甲烷溶液。每次去保護(hù)反應(yīng)，該樹脂都要洗滌1分鐘，重復(fù)三次。
3.偶合反應(yīng)使用作活化劑的有3倍摩爾量的0.3M二異丙基碳化二亞胺/二氯甲烷溶液和3倍摩爾量的0.3MBOC氨基酸衍生物/DMF(N，N′-二甲基甲酰胺)溶液進(jìn)行偶合反應(yīng)，活化過的氨基酸在樹脂上與肽的游離α-氨基偶合。反應(yīng)時間說明如下。
4.洗滌每個反應(yīng)過程完在以后，用二氯甲烷、二氯甲烷/DMF和DMF洗樹脂，各1分鐘。
使氨基已被保護(hù)的氨基酸與樹脂偶合，次序、次數(shù)和時間如下所示。次序氨基酸次數(shù)-時間1BOC-Pro2次-1小時2BOC-Lys(N-epsilon-Cdz,異丙基)2次-1小時3BOC-Leu2次-1小時4BOC-D-Lys(N-epsilon-FMOC)2次-1小時5BOC-NMeTyr(0-2,6-diCl-Bzl)2次-1小時6BOC-Ser(OBzl)2次-1小時7BOC-D-3Pal2次-6小時8BOC-D-4Clphe2次-2小時9BOC-D2Nal2次-2小時10乙酸2次-2小時合成反應(yīng)完成后，用30%哌啶的DMF溶液處理樹脂4-24小時以除去保護(hù)FMOC基團(tuán)。該樹脂用二氯甲烷洗若干次，然后與溶於DMF(18ml)中的羰基二咪唑(0.9g)反應(yīng)15分鐘，再用二氯甲烷洗三次，以后使其與溶解於DMF(18ml)中的2-糖酰肼(2-furoichydrazide)(0.53g)反應(yīng)過夜。所得到的肽-樹脂用二氯甲烷洗三次，然后在五氧化二磷存在下干燥過夜，在此之后使其在茴香醚存在下于0℃，用干燥的氟化氫處理1小時，以便從樹脂上切下肽。在真空條件下除去過量的反應(yīng)試劑。如此獲得的樹脂首先用乙醚洗，然后在室溫下於50ml的水/乙腈/乙酸混合物(1∶1∶0.1)中攪拌15分鐘，并過濾。濾液經(jīng)凍干生成絨毛粉末狀的不純肽。這種肽可在下列條件下經(jīng)高效液相色譜純化(1)柱DynamaxC-18(25×2.5cm，8微米)(2)溶劑得自89%水/11%乙腈/0.1%TFA的乙腈上升梯度超過20分鐘(3)檢測波長260nm(UV法)收集按保留時間25.7分鐘的單峰檢測的肽并凍干生成的三氟乙酸鹽的NAcD2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyFur)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2純化產(chǎn)品。有關(guān)純化產(chǎn)品的物理性質(zhì)數(shù)據(jù)如下FAB(快原子轟擊，并用於下文)質(zhì)譜分析m/e 1591(M+H)+;
氨基酸分析0.98Ala，1.02Pro，1.58Lys，1.00Leu，1.12NMeTyr，0.52Ser將上述肽的三氟乙酸鹽轉(zhuǎn)化成乙酸鹽，使用事先用1N乙酸平衡過的凝膠過濾柱。凝膠過濾條件如下(1)填充SephadexG-25(柱內(nèi)直徑16mm，填充床高度40mm)(2)溶劑1N乙酸
(3)檢測波長254nm(UV法)收集最先被淋洗的峰餾份并凍干，得到乙酸鹽形式的NAcD2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyFur)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2純化產(chǎn)品。
參考例11合成NAcD2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyNic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2按參考例10相同的方法合成標(biāo)題肽，除了用2-煙酰肼(0.575g)代替2-糖酰肼外。如此獲得的純化產(chǎn)品的HPLC保留時間為16.0分鐘。有關(guān)純化產(chǎn)品的物理性質(zhì)如下FAB質(zhì)譜分析m/e 1592(M+H)+氨基酸分析1.02Ala，1.01Pro，1.61Lys，0.99Leu，1.12NMeTyr，0.48Ser按與參考例10相同的方法使上述肽的三氟乙酸鹽轉(zhuǎn)化成乙酸鹽。
參考例12在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入322g90%的，L-乳酸水溶液和133g乙醇酸并使用加熱套(mantleheater)(so-goRikagakuGlassCo.)，使進(jìn)料在減壓的氮氣流中(從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱4小時，同時不斷移出蒸餾水，在3-30mmHg/150-185℃的減壓條件下使反應(yīng)混合物再加熱23小時，以后使之冷卻，形成乳酸-乙醇酸共聚物。
使該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，拌隨恒定攪拌將溶液倒入60℃的溫水中。收集得到的粘性聚合沉淀物，并于30℃的真空中干燥。
按GPC法測定所得到的乳酸-乙醇酸共聚物的重均分子量和數(shù)均分子量，和按端基測定法測定數(shù)均分子量，分別為10，000;4，000;和4，000。這些數(shù)據(jù)表明該共聚物是一種具有末端羧基的聚合物。
參考例13在裝有氮入口管和冷凝器的1000ml四頸瓶中，注入347g90%的D，L-乳酸水溶液和266g乙醇酸，并使用加熱套(so-goRikagakuGlassCo.)，使進(jìn)料在減壓的氮氣流中從100℃/500mmHg-150℃/30mmHg)加熱5小時，同時不斷移出蒸餾水，在3-30mmHg/150-185℃的減壓條件下使反應(yīng)混合物再加熱23小時，然后使之冷卻，形成乳酸-乙醇酸共聚物。
使該聚合物溶於1000ml的二氯甲烷中，并拌隨攪拌將溶液倒入60℃的溫水中。收集所得到的粘性聚合沉淀物，并于30℃的真空中干燥。
按GPC法測定所得到的乳酸-乙醇酸共聚物的重均分子量和數(shù)均分子量，并按端基測定法測定數(shù)均分子量，分別為10，000;3，700;和3，900。這些數(shù)據(jù)表明該共聚物是一種具有末端羧基的聚合物。
例1將NAcD2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2(由TAP制造，下文簡稱生理活性肽A)的乙酸鹽，200mg，溶於參考例5獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例1獲得的聚乳酸50∶50混合物(3.8g)在5.3g(4.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)。使所得到的溶液冷卻至17℃并倒入預(yù)先已調(diào)至10℃的1000ml 0.1%(W/W)聚乙烯醇(EG-40，Nippon Synthetic Chemical Industry Co.，Ltd.)水溶液中，該混合物用一臺渦輪均質(zhì)混勻機(jī)以7000 rpm進(jìn)行乳化以制備O/W乳狀液。將該O/W乳狀液于室溫下攪拌3小時以蒸發(fā)二氯甲烷。使油相固化，并用2000rpm的離心機(jī)(05PR-32 Hitachi，Ltd.)收集。使該固體重新分散于蒸餾水中，并進(jìn)一步離心以洗掉游離的藥品等。收集的微膠囊再次分散在少量的蒸餾水中，隨后加入0.3g D-甘露糖醇并凍干形成粉末。微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量各為5-60μm和4.7%(W/W)。
按與上述相同方法制造下列生理活性肽(1)和(2)的制劑。
(1)NAcD2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyNic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2(2)NAcD2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyFur)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2例2在參考例5中獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例2獲得的聚乳酸50∶50混合物(3.8g)在二氯甲烷6.7g(5.0ml)中的溶液內(nèi)溶解200mg生理活性肽A的乙酸鹽。使該溶液冷卻至17℃再倒入預(yù)先已調(diào)至17℃的1000ml0.1%聚乙烯醇水溶液中，再按例1處理所得混合物以制成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量各為5-65μm和5.0%(W/W)。
例3在參考例5獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例3獲得的聚乳酸50∶50混合物(3.8g)於6.7g(5.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)溶解200mg生理活性肽A的乙酸鹽。使該溶液冷卻至17℃再倒入預(yù)先已調(diào)至17℃的1000ml0.1%聚乙烯醇水溶液中，按例1處理該混合物以形成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為10-60μm和4.8%(W/W)。
例4在由參考例5獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例4獲得的聚乳酸50∶50混合物(3.8g)在6.7g(5.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)溶解200mg生理活性肽A乙酸鹽。使該溶液冷卻至17℃后倒入預(yù)先已調(diào)至17℃的1000ml0.1%聚乙烯醇水溶液中，按例1處理該混合物以形成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為10-75μm和4.6%(W/W)。
例5在由參考例6獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例2獲得的聚乳酸50∶50混合物(3.8g)在6.0g(4.5ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)溶解200mg生理活性肽A乙酸鹽。使該溶液冷卻至17℃后再倒入預(yù)先已調(diào)至10℃的1000ml0.1%聚乙烯醇水溶液中，按例1處理該混合物以形成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為10-60μm和4.9%(W/W)。
例6在由參考例7獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例2獲得的聚乳酸50∶50混合物(3.8g)在6.0g(4.5ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)溶解200mg生理活性肽A乙酸鹽。使該溶液冷卻至17℃后再倒入預(yù)先已調(diào)至17℃的1000ml0.1%聚乙烯醇水溶液中，并按例1處理所得混合物以制成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為10-65μm和4.9%(W/W)。
例7在由參考例9獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例8獲得的聚乳酸50∶50混合物(3.8g)在7.0g(5.3ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)溶解400mg生理活性肽A乙酸鹽。使該溶液冷卻至17℃后再倒入預(yù)先已調(diào)至17℃的1000ml0.1%聚乙烯醇水溶液中，所得混合物按例1方法處理，以制成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為5-65μm和7.2%(W/W)。
例8使參考例11獲得的240mg NAcD2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyNic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2(下文簡稱生理活性肽B)的乙酸鹽溶于一種溶液中，該溶液為參考例9獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例8獲得的聚乳酸50∶50混合物(1.76g)在3.2g(2.4ml)二氯甲烷中的溶液。使所得到的溶液冷卻至18℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至16℃的400ml0.1%聚乙烯醇水溶液中，按例1方法處理該混合物，以制成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽B的含量分別為5-70μm和10.3%(W/W)。
例9將參考例10獲得的240mg NAcD2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(AzaglyFur)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2(下文簡稱生理活性肽C)的乙酸鹽溶于一種溶液中，該溶液為參考例9獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例8獲得的聚乳酸50∶50混合物(1.76g)在3.2g(2.4ml)二氯甲烷中的溶液。使所得到的溶液冷卻至18℃后再倒入預(yù)先已調(diào)至16℃的400ml 0.1%聚乙烯醇水溶液中，所得混合物按例1方法處理，以制成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽C的含量分別為5-65μm和10.9%(W/W)。
例10將N-TeTrahydrofur-2-oyl-Gly-D2NaL-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2由TAP制造，下文簡稱生理活性肽D的乙酸鹽[FAB質(zhì)譜分析m/e 1647(M+H)+]，240mg，溶于一種溶液中，該溶液為參考例9獲得的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物和參考例8獲得的聚乳酸50∶50混合物(1.76g)在3.2g(2.4ml)二氯甲烷中的溶液。使所得溶液冷卻至18℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至16℃的400ml 0.1%聚乙烯醇水溶液中，按例1方法處理所得混合物以制成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽D的含量分別為5-70μm和10.5%(W/W)。
例11加入200mg生理活性肽A乙酸鹽，并溶於乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25(mole%)，GPC重均分子量＝5，000，GPC數(shù)均分子量＝2，000，按端基測定法的數(shù)均分子量＝2，200;廠商WakopureChemical(Lot.920729))在5.3g(4.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)。使所得到的溶液冷卻至17℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至16℃的1000ml0.1%聚乙烯醇(EG-40，NipponSyntheticChemicalIndustryCo.，Ltd.)水溶液中，所得混合物用渦輪混合器以7000rpm進(jìn)行乳化以制備o/w乳狀液，使該o/w乳狀液在室溫下攪拌3小時以蒸發(fā)二氯甲烷。油相固化后用2000rpm的離心機(jī)(05PR-22，Hitachi)收集。將該固體再次分散於蒸餾水中，并進(jìn)一步離心以洗掉游離的藥物等。使收集起來的微膠囊再次分散於少量的蒸餾水中，隨后加入0.3g的D-甘露糖醇，再凍干以形成粉末。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為5-60μm和4.7%(W/W)。
按與上述相同方法生產(chǎn)下列肽(1)和(2)的持續(xù)釋放制劑。
(1)生理活性肽B乙酸鹽(2)生理活性肽C乙酸鹽例12加入200mg生理活性肽A乙酸鹽并使其溶解於3.8g乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25(mole%)，GPC重均分子量＝10，000，GPC數(shù)均分子量＝4，400，按端基測定法的數(shù)均分子量＝4，300;廠商WakopureChemical(Lot.880530))在6.7g(5.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)。使所得到的溶液冷卻至17℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至11℃的1000ml0.1%聚乙烯醇的水溶液中。此后，重復(fù)例11的步驟以形成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為5-65μm和4.5%(W/W)。
例13加入400mg生理活性肽A乙酸鹽溶於參考例12所獲得的乳酸-乙醇酸共聚物3.6g在8.0g(6.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)。使所得到的溶液冷卻至15℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至14℃的1000ml0.1%聚乙烯醇的水溶液中。此后，重復(fù)例11的步驟以形成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為5-65μm和8.2%(W/W)。
例14加入400mg生理活性肽A乙酸鹽溶於參考例13所獲得的乳酸-乙醇酸共聚物3.6g在8.0g(6.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)。使所得到的溶液冷卻至15℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至15℃的1000ml0.1%聚乙烯醇的水溶液中。此后，重復(fù)例11的步驟以形成微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為5-65μm和8.4%(W/W)。
例15將leuprolerin乙酸鹽(廠商TakedaChemicalIndustries)，400mg，加到用于例12中的同樣乳酸-乙醇酸共聚物3.6g在8.0g(60ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)。以制備清亮均勻溶液。使所得到的溶液冷卻至15℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至15℃的1000ml0.1%聚乙烯醇的水溶液中。此后，重復(fù)例11的步驟以形成微膠囊。
實驗例1將大約30mg例1中所得到的微膠囊分散於分散介質(zhì)中(2.5mg羧甲基纖維素、0.5mg多乙氧基醚80和25mg甘露糖醇於蒸餾水中的溶液)，用22G針在10周齡期的雄SD鼠的皮下注射該分散液(微膠囊的劑量為60mg/kg)。連續(xù)給藥后，將鼠殺死，從給藥部位取出微膠囊的殘余物，測量微膠囊中生理活性肽A的量。結(jié)果示于表1中。
實驗例2-6使用例2-6所獲得的微膠囊，按實驗例1方法測定微膠囊內(nèi)生理活性肽A的殘留量。結(jié)果也示于表1中。
從表1可明顯看出，本發(fā)明所有的微膠囊特征都在于基本上恒定釋放生理活性肽，并且另一特征在于基本上無初始急劇增強(qiáng)。
表2表示按x-折射計算的線性回歸模式、校正系數(shù)和釋放時間，按生物檢驗法(MethodsofBioassay)(authoredbyAkiraSakuma，TokyoUniversityPress，June5，1987，p.111)所述程序進(jìn)行測定。
從表2可明顯看出，改變與乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物混合的聚乳酸重均分子量即可將釋放期限自由地控制在約3.5周-約11.5周的范圍內(nèi)。
表3顯示按x-折射的線性回歸模式、校正系數(shù)和釋放時間，這些都是通過用表2相同程序根據(jù)表1的數(shù)據(jù)測定的。
從表3可明顯看出，通過改變與聚乳酸混合的乙醇酸-2-羥基丁酸共聚物中乙醇酸的摩爾比值，能自由地控制釋放時間在約3.1周-約6.6周的范圍內(nèi)。
實驗例7-9使用例7-9所獲得的微膠囊，按例1測定微膠囊中生理活性肽的殘余量，除微膠囊劑量約為30mg/kg外。結(jié)果列于表4。表5顯示按x-折射計算的線性回歸模式、校止系數(shù)和釋放時間，這些結(jié)果都是根據(jù)表4的數(shù)據(jù)通過用表2相同程序測定的。
從表4和5可明顯看出，本發(fā)明的微膠囊特征在於生理活性肽基本上恒定釋放，和另一特征在于基本上沒有起始急劇增強(qiáng)。
實驗例10使用例10獲得的微膠囊，按實驗例7測量微膠囊中生理活性肽的殘余量。結(jié)果列于表6。表7表明按x-折射計算的線性回歸模式、校正系數(shù)和釋放時間，這些結(jié)果都是根據(jù)表2所用相同程序按表6的數(shù)據(jù)測定的。
從表6和7可明顯看出，本發(fā)明的微膠囊特征在於生理活性肽基本上恒定釋放，且另一特征在于基本上沒有起始急劇增強(qiáng)。
實驗例11將大約30mg例11所獲得的微膠囊分散于0.5ml的分散介質(zhì)中(通過溶解羧甲基纖維素(2.5mg)、多乙氧基醚80(0.5mg)和甘露糖醇(25mg)于蒸餾水中制備的)，用22G針在10周齡期的雄性SD鼠背上注射該分散液(微膠囊的劑量為60mg/kg)。連續(xù)給藥后，殺死小鼠，由給藥部位取出微膠囊的殘余物，并測定微膠囊中生理活性肽A的量。結(jié)果示于表8中。
實驗例12使用例12獲得的微膠囊，另外重量實驗例11的程序，檢驗生理活性肽A的殘余物。結(jié)果列于表8中。
實驗例13使用例13獲得的微膠囊，另外重復(fù)實驗例11的程序，并檢驗生理活性肽A的殘余物。結(jié)果列于表8中。
實驗例14使用例14獲得的微膠囊，另外重復(fù)實驗例11的程序，并檢驗生理活性肽A的殘余物。結(jié)果列于表8中。
(-未測)表9表明按x-折射計算的線性回歸模式、校正系數(shù)和釋放時間，這些都是通過與表2所用相同程序按表8數(shù)據(jù)測量的。
從表8和9可明顯看出，本發(fā)明的持續(xù)釋放制劑在不同時間段內(nèi)總是保證基本上恒定釋放肽。
對比例1將400mg生理活性肽A乙酸鹽加到乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50(摩爾%)，GPC重均分子量＝58，000，GPC數(shù)均分子量＝14，000，按端基測定法的數(shù)均分子量＝45，000廠商Boehringer-Ingelheim(Lot.RG505-05077))3.6g於33.2g(25.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)，但生理活性肽A乙酸鹽不能完全溶解。
對比例2將400mg生理活性肽A乙酸鹽加到乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25(摩爾%)，GPC重均分子量＝18，000，GPC數(shù)均分子量＝8，400，按端基測定法的數(shù)均分子量＝30，000;廠商Boeh-ringer-Ingelheim(Lot.RG752-15057))3.6g在8.0g(6.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)，但生理活性肽A不能完全溶解。使該分散液冷卻至17℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至15℃的1000ml0.1%聚乙烯醇的水溶液中。以相同于例11的方法制備微膠囊。微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為10-90μm和2.5%(W/W)。
對比例3將400mg生理活性肽A乙酸鹽加到乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25(摩爾%)，GPC重均分子量＝58，000，GPC數(shù)均分子量＝15，000，按端基測定法的數(shù)均分子量＝53，000;廠商Boehringer-Ingelheim(Lot.RG755-05019))3.6g于21.2g(16.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)，但是生理活性肽A不能完全溶解。使該分散液冷卻至17℃，再倒入預(yù)先已調(diào)至16℃的1000ml0.1%聚乙烯醇的水溶液中。以相同于例11的方法制備微膠囊。該微膠囊的粒徑分布和生理活性肽A的含量分別為10-90μm和3.6%(W/W)。
正如對比例1-3所示，如使用基本上沒有末端羧基的乳酸-乙醇酸共聚物時，則本發(fā)明肽[Ⅰ]不能完全溶解。
對比例4將Leuprolerin乙酸鹽(廠商TakedaChemicalIndustries)，400mg，加到對比例2使用的同樣乳酸-乙醇酸共聚物，3.6g，於8.0g(6.0ml)二氯甲烷中的溶液內(nèi)，但Leuprolerin乙酸鹽不能完全溶解。
本發(fā)明的持續(xù)釋放制劑能在長時間范圍內(nèi)恒定釋放藥品，尤其是肽[Ⅰ]，因此有利于延長和穩(wěn)定作用。此外，易於控制藥品釋放的期限并且能抑制給藥后立即過量的釋放。尤其是抑制持續(xù)釋放制劑給藥后肽[Ⅰ]中的釋放組胺活性。本持續(xù)釋放制劑具有優(yōu)良的分散性。而且，該制劑是穩(wěn)定(例如對光、熱、溫度、著色)而低毒的，因此，能安全地給藥。
按照本發(fā)明的生產(chǎn)方法，含一種生理活性肽的持續(xù)釋放制劑能很容易地獲得高產(chǎn)率。由此所獲得的持續(xù)釋放制劑具有平滑的表面和優(yōu)良的流動性。
權(quán)利要求
1.一種持續(xù)釋放制劑，包含下列通式的生理活性肽
其中X表示酰基R1、R2和R4各表示芳環(huán)基R3表示D-氨基酸殘基或通式如下的基團(tuán)
其中R3′是雜環(huán)基R5表示一種通式-(CH2)n-R5′的基團(tuán)，其中n為2或3，R5′是取代或未取代的氨基、芳環(huán)基或O-糖基R6表示通式-(CH2)n-R6′的基團(tuán)，其中n為2或3和R6′為取代或未取代的氨基R7表示D-氨基酸殘基或氮雜甘氨酰殘基；和Q表示氫或低級烷基，或其鹽和具有末端羧基的生物可降解聚合物。
2.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中X是被5-或6-節(jié)雜環(huán)甲酰氨基取代或未取代的C2-7鏈烷酰基。
3.按權(quán)利要求2所述持續(xù)釋放制劑，其中X是被四氫呋喃基羧基酰胺基取代或未取代的C2-4鏈烷?；?。
4.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中X是是乙?；?。
5.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和通式
的羥基羧酸共聚物和(B)聚乳酸的混合物，通式中R表示2-8個碳原子的烷基。
6.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中X是乙?；?，和生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和通式
的羥基羧酸共聚物和(B)聚乳酸的混合物，通式中R表示2-8個碳原子的烷基。
7.按權(quán)利要求5所述持續(xù)釋放制劑，其中所述共聚物按GPC法測定的重均分子量約為2，000-50，000。
8.按權(quán)利要求5所述持續(xù)釋放制劑，其中共聚物分散值約為1.2-4.0。
9.按權(quán)利要求5所述持續(xù)釋放制劑，其中聚乳酸按GPC法測定的重均分子量約為1500-30，000。
10.按權(quán)利要求5所述持續(xù)釋放制劑，其中聚乳酸分散值約1.2-4.0。
11.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中生物可降解聚合物是乳酸和乙醇酸的共聚物。
12.按權(quán)利要求11所述持續(xù)釋放制劑，其中所述共聚物按GPC法測定的重均分子量約為5，000-25，000。
13.按權(quán)利要求11所述持續(xù)釋放制劑，其中所述共聚物分散值約為1.2-4.0。
14.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中所述生理活性肽的比例以生物可降解聚合物計為0.01-50%(W/W)。
15.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中所述生理活性肽是LH-RH拮抗物。
16.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中生理活性肽是
-CONHCH2COD2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽。
17.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中生理活性肽是NAcD2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-NMeTyr-DLys(Nic)-Leu-Lys(Nisp)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽。
18.按權(quán)利要求1所述持續(xù)釋放制劑，其中生理活性肽是NAcD2Nal-D4ClPhe-D3Pal-Ser-Tyr-DhArg(Et2)-Leu-hArg(Et2)-Pro-DAlaNH2或其乙酸鹽。
19.一種生產(chǎn)持續(xù)釋放制劑的方法，該法包括溶解下式
的生理活性肽，其中X表示?；?R1、R2和R4各表示芳環(huán)基;R3表示D-氨基酸殘基或通式如下的基團(tuán)
其中R3′是雜環(huán)基;R5表示一種通式-(CH2)n-R5′的基團(tuán)，其中n為2或3，和R5′是取代或未取代的氨基、芳環(huán)基或O-糖基;R6表示通式-(CH2)n-R6′的基團(tuán)，其中n為2或3和R6′為取代或未取代的氨基;R7表示D-氨基酸殘基或氮雜甘氨酰殘基;和Q表示氫或低級烷基或其鹽和在一種溶劑中具有末端羧基的生物可降解聚合物。該溶劑與水基本上不溶混，然后除去所述溶劑。
20.按權(quán)利要求19所述的方法，其中生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和通式為
羥基羧酸的共聚物和(B)聚乳酸的混合物，所述通式中R表示2-8個碳原子的烷基。
21.按權(quán)利要求19所述的方法，其中X是乙?；?，和生物可降解聚合物是(A)乙醇酸和通式為
羥基羧酸的共聚物和(B)聚乳酸的混合物，所述通式中R表示2-8個碳原子的烷基。
22.按權(quán)利要求19所述方法，其中所述生物可降解聚合物是乳酸和乙醇酸的共聚物。
23.按權(quán)利要求19的一種方法，該法包括溶解生物可降解聚合物和生理活性肽於一種溶劑中，該溶劑與水基本上不溶混，并將所得溶液加到含水介質(zhì)中以形成o/w乳狀液。
24.一種生產(chǎn)持續(xù)釋放制劑的方法，該法包括溶解生物可降解聚合物和基本上水不溶性生理活性肽或其鹽于一種與水基本上水不溶混的溶劑中，然后除去所述溶劑，上述聚合物包含(A)乙醇酸和通式為
羥基羧酸的共聚物和(B)聚乳酸的混合物，所述通式中R表示2-8個碳原子的烷基。
25.一種按權(quán)利要求24的方法，該法還包括在溶解生物可降解聚合物和基本上水不溶性肽或其鹽於所述溶劑后，將所得溶液加到含水介質(zhì)中以形成o/w乳狀液。
全文摘要
一種持續(xù)釋放制劑，該制劑包含下列通式的生理活性肽。該持續(xù)釋放制劑能在長時間內(nèi)恒定釋放肽而無初始急劇增強(qiáng)。
文檔編號A61K38/04GK1096221SQ93121140
公開日1994年12月14日 申請日期1993年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月7日
發(fā)明者亀井茂, 豬狩康孝, 小川泰亮 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社