專利名稱：抗人類b淋巴細(xì)胞限制分化抗原的嵌合及放射標(biāo)記抗體的制作方法
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本發(fā)明針對(duì)使用抗B細(xì)胞表面抗原Bp35(CD20)的嵌合及放射標(biāo)記抗體治療B細(xì)胞淋巴瘤。
脊椎動(dòng)物(例如靈長目，包括人、猿、猴等)的免疫系統(tǒng)由許多器官和細(xì)胞類型組成，這些器官及細(xì)胞類型進(jìn)化出以下功能準(zhǔn)確和特異性地識(shí)別侵入脊椎動(dòng)物宿主的外來微生物(抗原);特異性地與這些外來微生物結(jié)合;并且清除/破壞這些外來微生物。在其它一些類型中，淋巴細(xì)胞對(duì)于免疫系統(tǒng)來說是關(guān)鍵性的。淋巴細(xì)胞在胸腺，脾臟及骨髓(成年的)中產(chǎn)生，并相當(dāng)于人(成年人)循環(huán)系統(tǒng)中存在的總白血細(xì)胞的30%。有二種主要的淋巴細(xì)胞的亞群體T細(xì)胞和B細(xì)胞。T細(xì)胞在細(xì)胞介導(dǎo)免疫中起作用，而B細(xì)胞在抗體產(chǎn)生(體液免疫)中起作用。然而T細(xì)胞和B細(xì)胞被認(rèn)為在典型免疫反應(yīng)中是相互依賴的，當(dāng)T細(xì)胞受體結(jié)合于抗原片段(該片段結(jié)合于抗原呈遞細(xì)胞表面上的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)糖蛋白上)上時(shí)T細(xì)胞被激活;此種激活作用引起生物學(xué)介體(白細(xì)胞介素)釋放，該介體實(shí)質(zhì)上能刺激B細(xì)胞分化并產(chǎn)生抗該抗原的抗體(免疫球蛋白)。
在宿主中每種B細(xì)胞在其表面表達(dá)不同的抗體，因此，一種B細(xì)胞將表達(dá)以一種抗原特異性的抗體，而另一方面B細(xì)胞將表達(dá)對(duì)不同的抗原特異性的抗體。由此，B細(xì)胞是十分多樣性的，此種多樣性對(duì)免疫系統(tǒng)來說是至關(guān)重要的。在人體中，每種B細(xì)胞可產(chǎn)生巨大數(shù)量的抗體分子(即約107至108)。當(dāng)外來抗原被中和時(shí)，一般停止這種抗體產(chǎn)生(或者大大降低)。然而偶然地特定B細(xì)胞的繁殖也傳統(tǒng)繼續(xù)不斷進(jìn)行；這種繁殖可產(chǎn)生稱為“B 細(xì)胞瘤”的癌。
T細(xì)胞和B細(xì)胞二者均含表面蛋白，這些表面蛋白可被用作分化及鑒定的“標(biāo)記”。一種這樣的人B細(xì)胞標(biāo)記是人B淋巴細(xì)胞限制分化抗原Bp35，稱為“CD20”，“CD20”在B細(xì)胞發(fā)育前期的早期表達(dá)，并保持直至漿細(xì)胞分化。特別是該CD20分子可以調(diào)節(jié)激活過程中的步驟(該步驟為細(xì)胞周期啟動(dòng)及分化所要求的)，并且通常在腫瘤B細(xì)胞中高水平表達(dá)。由定義可知CD20即存在于“正常”B細(xì)胞上，也存在于“惡性”B細(xì)胞上(即這些B細(xì)胞不停地繁殖可導(dǎo)致B細(xì)胞淋巴瘤)。因此，CD20表面抗原有可能作為對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤“定靶”的候選物。
實(shí)質(zhì)上，這樣的定靶過程可歸納如下將對(duì)CD20B細(xì)胞表面抗原特異性的抗體(例如)注射入患者體內(nèi)，這些抗-CD20抗體便特異性結(jié)合到(明顯地)正常及惡性B細(xì)胞二者的CD20細(xì)胞表面抗原上;結(jié)合于CD20表面抗原的抗-CD20抗體可引起腫瘤B細(xì)胞破壞并消耗掉。此外能破壞腫瘤的化學(xué)試劑或放射性標(biāo)記也可與該抗-CD20抗體相連，以便該試劑能特異地輸送到(例如)腫瘤B細(xì)胞處。不管采用什么方法，基本目的是破壞腫瘤，具體方法可由所使用的具體抗-CD20抗體來決定，因此定靶CD20抗原的可使用的方法是十分不同的。
例如已有多種定靶CD20表面抗原的嘗試被報(bào)道過。鼠(小鼠)單克隆抗體1F5(一種抗-CD20抗體)已報(bào)道過以連續(xù)靜脈輸注到B細(xì)胞淋巴瘤患者的方式給藥。據(jù)報(bào)道要耗盡循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，要求極高的1F5水平(＞2g)，而其結(jié)果據(jù)說是“暫時(shí)的”(Press等人“MonoclonalAntibody1F5(Anti-CD20)SerotherapyofHumanB-CellLymphomas”Blood69/2584-591(1987))。該方法的潛在問題是非人單克隆抗體(例如鼠單克隆抗體)一般缺乏人效應(yīng)物功能，即它們不能介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性溶解或通過抗體依賴性細(xì)胞毒性或Fc-受體介導(dǎo)的吞噬作用來溶解人靶細(xì)胞。而且非人單克隆抗體可由人宿主識(shí)別為外來蛋白，因此，反復(fù)注射此類外來抗體可產(chǎn)生導(dǎo)致有害過敏反應(yīng)的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)作用。有關(guān)基于鼠的單克隆抗體，通常稱為人抗-鼠抗體反應(yīng)，或“HAMA”反應(yīng)。此外，這些外來抗體可能受到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，其結(jié)果使得它們?cè)诘竭_(dá)靶位之前被中和掉。
淋巴細(xì)胞和淋巴瘤對(duì)放射療法的固有敏感性有如下幾個(gè)原因放射性標(biāo)記抗體的離子化射線的局部發(fā)射，可以殺死帶或不帶與結(jié)合抗原的抗體靠得很近的靶抗原(例如CD20)的細(xì)胞;穿透的射線可以消除在巨大的或不良的血管化腫瘤中有限地接近抗體的問題;而且所需的抗體總數(shù)可減少。放射性核素發(fā)射放射性粒子，該粒子可損害細(xì)胞DNA到細(xì)胞修復(fù)機(jī)制不能使細(xì)胞繼續(xù)存活的程度;因此，假如靶細(xì)胞是腫瘤，放射性標(biāo)記物可有利地殺死腫瘤細(xì)胞。根據(jù)定義，放射性標(biāo)記抗體包括使用放射性物質(zhì)，患者(即可能的骨髓移植)以及保健醫(yī)生(即在帶有放射性的條件下工作時(shí)需高度警惕)可能都需要采取預(yù)防措施。
因此，一種改進(jìn)鼠單克隆抗體使之在治療B細(xì)胞紊亂中有效的方法是將放射性標(biāo)記或毒素連接到抗體上，以使標(biāo)記或毒素位于腫瘤部位。例如，上面提到的IF5抗體已以磺-131(131I)做標(biāo)記，并據(jù)報(bào)道在兩個(gè)患者中進(jìn)行過生物學(xué)分布評(píng)價(jià)，見Eary，J.F.等人“Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma”J.Nuc.Med.31/81257-1268(1990);也參見Press，O.W.等人，“Treatment of Refractory Non-Hodgkin′s Lymphoma With Radiolabled MB-1(Anti-CD37)Antibody”J.Clin.Onc.7/81027-1038(1989)(表明一個(gè)經(jīng)131I標(biāo)記過的IF5治療的患者達(dá)到部分反應(yīng));Goldenberg，D.M.等人，“Targeting，Dosimetry and Radioimmuno therapy of B-Cell Lymphomas With Iodine-131-Labeied LL2 Monoclonal antibody”J.Clin.Onc.9/4548-564(1991)(接受多次注射的8個(gè)病人中的三個(gè)據(jù)報(bào)道產(chǎn)生了HAMA反應(yīng));Appelbaum，F(xiàn).R.“Radiolabled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin′s Lymphoma”Hem./Onc.Clinics of N.A.5/51013-1025(1991)(文獻(xiàn)綜述)，Press，O.W.等人“Radiolabled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma With Autologous Bone Marrow Support”New England Journal of Medicine 329/171219-12223(1993)(碘-131標(biāo)記抗-CD20抗體IF5和B1);以及Kaminski，M.G.等人，“Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma With[131I]Anti-B1(Anti-CD20)Antibody”NEJM 329/7(1993)(碘-131標(biāo)記抗-CD20抗體B1;本文下面稱之為“Kaminski”)。
也已將毒素(即羥柔毛霉素或絲裂霉素C之類的化療劑)連接于抗體，參見例如PCT公開申請(qǐng)WO92/07466(1992年5月14日公開)。
“嵌合”抗體，即含有來自兩種或多種不同物種(例如鼠和人)的各部分的抗體，已被開發(fā)為另一種連接抗體。例如Liu，A.Y.等人“ProductionofaMouse-HumanChimericMonoclonalAntibodytoCD20WithPotentFc-DependentBiologicActivity”J.Immun.139/103521-3526(1987)，介紹了一種抗CD20抗原的鼠一個(gè)嵌合抗體。也參見PCT公開申請(qǐng)WO88/04936。然而在這篇參考文獻(xiàn)中沒有資料提供有關(guān)使用這類嵌合抗體治療B細(xì)胞紊亂的能力、效力或?qū)嵱眯缘膬?nèi)容。應(yīng)注意，體外的功能性檢測(cè)(例如補(bǔ)體依賴性溶胞(CDC);抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)等)不可能當(dāng)然地予料嵌合抗體破壞或消耗表達(dá)特異抗原的靶細(xì)胞的體內(nèi)能力。參見例如Robinson，R.D.等人“Chimericmouse-humananti-carcinomaantibodiesthatmediatedifferentanti-tumorcellbiologicalactivities?！盚um.Antibod.Hybridomas284-93(1991)(檢測(cè)不出ADCC活性的嵌合鼠-人抗體)。因此只有通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)才可真正評(píng)價(jià)嵌合抗體的可能的治療效力。
本技術(shù)領(lǐng)域所需的，可成為重大進(jìn)展的工作是定靶CD20抗原以治療靈長類包括(但不限于)人的B細(xì)胞淋巴瘤的治療方法。
本文所公開的是為治療B細(xì)胞紊亂，特別是B細(xì)胞淋巴瘤所設(shè)計(jì)的治療方法。這些方法是基于施用免疫學(xué)活性的嵌合抗-CD20抗體用以消耗掉外周血B細(xì)胞，包括與淋巴瘤相關(guān)的B細(xì)胞;施用放射性標(biāo)記抗-CD20抗體，用以定靶與局部和外周B細(xì)胞相關(guān)的腫瘤;以及用合作治療策略，施用嵌合抗-CD20抗體和放射標(biāo)記抗-CD20抗體。
對(duì)附圖的簡要說明圖1是適用于生產(chǎn)免疫活性嵌合抗-CD抗體(TCAE8)的串聯(lián)嵌合抗體表達(dá)載體的圖示。
圖2A至2E是圖1載體的核酸序列;
圖3A至3F是圖1載體的核酸序列，該序列進(jìn)一步含鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)(TCAE8中的抗-CD20);
圖4是來自鼠抗-CD20單克隆抗體2B8的鼠可變區(qū)輕鏈的核酸及氨基酸序列(包括CDR和構(gòu)架區(qū));
圖5是來自鼠抗-CD20單克隆抗體2B8的鼠可變區(qū)重鏈的核酸和氨基酸序列(包括CDR和構(gòu)架區(qū));
圖6是證明螢光標(biāo)記人C1q與嵌合抗-CD20抗體結(jié)合的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，包括作為對(duì)照的標(biāo)記C1q，標(biāo)記C1q與鼠抗-CD20單克隆抗體2B8，以及標(biāo)記C1q與人IgG1，k;
圖7表示嵌合抗-CD20抗體和鼠抗-CD20單克隆抗體2B8相比較的補(bǔ)體相關(guān)的溶胞結(jié)果。
圖8表示嵌合抗-CD20抗體和2B8相比對(duì)體內(nèi)人效應(yīng)細(xì)胞的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性結(jié)果;
圖9A，9B和9C給出分別輸注免疫活性嵌合抗-CD20抗體0.4mg/kg(A)，1.6mg/kg(B)，及6.4mg/kg(C)之后，非人靈長類外周血B淋巴細(xì)胞消耗的結(jié)果。
圖10給出輸注0.01mg/kg免疫活性嵌合抗-CD20抗體后，非人靈長類外周血B淋巴細(xì)胞消耗的特別結(jié)果;
圖11給出在使用B細(xì)胞成淋巴腫瘤的小鼠體異物物記錄模式中Y2B8產(chǎn)生的殺腫瘤結(jié)果;
圖12給出在使用B細(xì)胞成淋巴腫瘤的小鼠體異物記錄模式中，C2B2產(chǎn)生的殺腫瘤結(jié)果;
圖13給出在使用B細(xì)胞成淋巴腫瘤的鼠體異物記錄模式中，Y2B8和C2B8相結(jié)合所產(chǎn)生的殺腫瘤結(jié)果;
圖14A和14B給出得自C2B8的Ⅰ/Ⅱ期臨床分析的結(jié)果，表明患者B細(xì)胞群體隨時(shí)間的消耗，證明病患部分緩解(14A)及病患輕度緩解(14B)。
一般來說，抗體由兩輕鏈和兩重鏈分子組成，這些鏈形成一個(gè)普通的Y型，輕鏈和重鏈共同構(gòu)成Y的兩臂，重鏈構(gòu)成Y的下部。輕鏈和重鏈被分成結(jié)構(gòu)和功能同源區(qū)。輕鏈(VL)和重鏈(VH)二者的可變區(qū)決定了識(shí)別能力和特異性。輕鏈(CL)和重鏈(CH)的不變區(qū)賦于其重要的生物學(xué)性質(zhì)，例如抗體鏈結(jié)合，分泌，經(jīng)胎盤的流動(dòng)性、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合等等。導(dǎo)致免疫球蛋白基因在產(chǎn)抗體細(xì)胞中表達(dá)的一系列活動(dòng)是十分復(fù)雜的。可變區(qū)域基因序列位于不同種系基因片段(稱之為“VH”、“D”和“JH”或“VL”和“JL”。這些基因片段由DNA重排被連接形成在重鏈和輕鏈分別表達(dá)的完全V區(qū)域。該經(jīng)重排連接的V片段(VL-JL和VH-D-JH)然后編碼完全可變區(qū)或者分別編碼輕鏈和重鏈的抗原結(jié)合區(qū)域。
使用抗-CD20鼠單克隆抗體(IF5)進(jìn)行的人B細(xì)胞淋巴瘤的血清免疫療法已由Press等人介紹過(69Blood584，1987，見上面)，但遺憾的是據(jù)載其治療反應(yīng)只是暫時(shí)的。此外，據(jù)報(bào)道有25%的經(jīng)試驗(yàn)的患者顯示出對(duì)血清療法的人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。Press等人指出，這些抗體與毒素或放射性同位素結(jié)合，比起未結(jié)合的抗體來說，可產(chǎn)生更持久的臨床效果。
由于B細(xì)胞淋巴瘤的效果衰減效應(yīng)，并確實(shí)需要對(duì)付該疾病的可行治療方法，我們已著手研究帶有一種特殊抗體2B8(作為各方法之間的共同紐帶)的不同的方法。一個(gè)這樣的方法有益地利用了哺乳動(dòng)物體系容易和有效地恢復(fù)外周血B細(xì)胞的能力;使用該方法，我們?cè)噲D實(shí)際上消除或消耗外周血和淋巴組織中的B細(xì)胞，以作為除去B細(xì)胞淋巴瘤的手段。我們利用特殊的免疫活性嵌合抗-CD20抗體達(dá)到了這一目的。在另一個(gè)方法中，我們探索以放射性標(biāo)記定靶腫瘤細(xì)胞使之破壞。
本文所使用術(shù)語“抗-CD20抗體”是特異性識(shí)別35000道爾頓的細(xì)胞表面非糖基化磷酸蛋白的抗體，該蛋白一般叫作人B淋巴細(xì)胞限制分化抗原Bp35，通常稱之為CD20。本文所用術(shù)語“嵌合”，當(dāng)針對(duì)抗-CD20抗體使用時(shí)，包括最優(yōu)選的利用重組脫氧核糖核酸技術(shù)得到，并含人(包括免疫學(xué)相關(guān)物種例如黑猩猩)和非人成份的抗體;嵌合抗體的不變區(qū)最優(yōu)選地基本上等同于天然人抗體的不變區(qū);該嵌合抗體的可變區(qū)最優(yōu)選地來源于非人源，且具有所需的對(duì)CD20細(xì)胞表面抗原的致免疫性和特異性。非人來源可以是任何可用于產(chǎn)生抗人CD20細(xì)胞表面抗原的抗體的任何脊椎動(dòng)物源，或含有人CD20細(xì)胞表面抗原的材料。此類非人來源包括(但不限于)嚙齒動(dòng)物(例如兔、大鼠、小鼠等等)和非人靈長類動(dòng)物(例如OldWorld猴、猿等)。最優(yōu)選的非人成分(可變區(qū))來源于鼠類。當(dāng)針對(duì)嵌合抗-CD20抗體時(shí)本文所用短語“免疫學(xué)活性”意指結(jié)合人C1q，介導(dǎo)人B淋巴樣細(xì)胞系補(bǔ)體依賴性溶解(CDC)，并且通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)溶解人靶細(xì)胞的嵌合抗體。本文中所用短語“間接標(biāo)記”和“間接標(biāo)記法”意指螯合劑共價(jià)連接到抗體上，并且至少有一個(gè)放射性核素插入該螯合劑中。優(yōu)選的螯合劑和放射性核素列舉在SrivagtavaS.C.和Mease，S.C.的“ProgressinResearchonLigands，NuclidesandTechniquesforLalelingMonoclonalAntibodies”Nucl.Med.Bio.18/6589-603(1991)(Srivagtava)一文中，該文引入本文作為參考。一種特別優(yōu)選的螯合劑是1-異硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二(1，2-亞乙基)三胺五乙酸(MX－DTPA);間接標(biāo)記所用特別優(yōu)選的放射性核素包括銦[111]和釔[90]。本文中所用短語“直接標(biāo)記”和“直接標(biāo)記法”意指放射性核素共價(jià)直接連接到抗體上(一般借助氨基酸殘基)。優(yōu)選的放射性核素在Srivagtava中提供;一種特別優(yōu)選的用于直接標(biāo)記的放射性核素是碘[131]，借助酪氨酸殘基共價(jià)連接。間接標(biāo)記法特別優(yōu)選。
本文所公開的治療方法是基于靈長類動(dòng)物免疫系統(tǒng)很快恢復(fù)或復(fù)原外周血B細(xì)胞的能力。此外，因?yàn)殪`長類動(dòng)物的基本免疫反應(yīng)是由T細(xì)胞引起的，所以當(dāng)免疫系統(tǒng)有外周血B細(xì)胞缺損時(shí)，不一定需要額外的預(yù)防措施(即隔離病人等)。由于靈長類動(dòng)物免疫系統(tǒng)的以上這些及其它細(xì)微差別，我們的治療B細(xì)胞紊亂的方法允許使用免疫活性嵌合抗-CD20抗體清除外周血B細(xì)胞。
根據(jù)定義，因?yàn)橥庵苎狟細(xì)胞紊亂可表明需要進(jìn)入(access)血的治療，所以免疫活性嵌合抗-CD20抗體和放射標(biāo)記抗-CD20抗體的給藥途徑優(yōu)選非腸道進(jìn)行;本文使用的術(shù)語“非腸道”包括靜脈、肌內(nèi)、皮下、直腸、陰道或腹膜給藥。這些給藥方式中，最優(yōu)選靜脈給藥。
免疫活性嵌合抗-CD20抗體及放射標(biāo)記抗-CD20抗體一般由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提供，將其加入藥用可接受的緩沖劑，例如無菌鹽水、無菌緩沖水、丙二醇，或上述緩沖液的混合物中給藥。制備非腸道給藥藥劑的方法見PharmaceuticalCarriers&Formulations，MartinRemington′sPharmaceuticalSciences，15thEd.(MackPub.Co.，Easton，PA1975)(引入本文作為參考)。
用于在任何給定患者中產(chǎn)生獨(dú)特治療效果的免疫學(xué)活性嵌合抗-CD20抗體的特定治療有效量，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定。
有效劑量(即治療有效量)免疫活性嵌合抗-CD20抗體是約0.001-約30mg/kg體重，更優(yōu)選約0.01-約25mg/kg體重，而最優(yōu)選約0.4-約20.0mg/kg體重。其它劑量也可用;影響劑量的因素包括(但不限于)患病嚴(yán)重程度，以前用過的治療方法，患者的總的健康狀況，是否存在其它疾病等等。技術(shù)人員通過評(píng)估具體病人很容易確定落入上述范圍內(nèi)的適當(dāng)劑量，假如需要，也可在該范圍之外。
按這些劑量引入免疫活性嵌合抗-CD20抗體，可以以一次治療完成，也可以以多次治療完成。對(duì)于嵌合抗體來說，優(yōu)選分多次治療引入;優(yōu)選方法由與該病相關(guān)的治療方法來預(yù)測(cè)。雖然不希望受任何具體理論所束縛，但因?yàn)槊庖呋钚郧逗峡?CD20抗體既具有免疫活性，又能與CD20結(jié)合，一旦開始引入該免疫活性嵌合抗-CD20抗體到個(gè)體中，則外周血B細(xì)胞消耗便開始了;我們觀察到在治療輸注后24小時(shí)內(nèi)幾乎完全消耗掉。由此，該免疫活性嵌合抗-CD20抗體(或放射性標(biāo)記抗-CD20抗體)隨后引入(一次或多次)患者體內(nèi)時(shí)，則可推定a)消除保留的外周血B細(xì)胞;b)開始從淋巴節(jié)消耗B細(xì)胞;c)開始從其它組織源，例如骨髓、腫瘤等等消耗B細(xì)胞。當(dāng)反復(fù)引入免疫活性嵌合抗-CD20抗體時(shí)再次表明，出現(xiàn)一系列現(xiàn)象，每種現(xiàn)象我們都認(rèn)為對(duì)有效治療疾病是很重要的。第一現(xiàn)象可以看作原則上針對(duì)基本上消耗患者的外周血B細(xì)胞;隨后的各現(xiàn)象可認(rèn)為是原則上針對(duì)同時(shí)或者分步從系統(tǒng)中清除剩余的B細(xì)胞，清除淋巴節(jié)B細(xì)胞，或清除其它組織B細(xì)胞。
實(shí)際上，雖然單劑量也提供效益，并能有效利用于病患治療/控制，但優(yōu)選的治療過程可分幾步進(jìn)行;最優(yōu)選將免疫活性嵌合抗-CD20抗體以約0.4-約20mg/kg體重，每周給患者施用一次，持續(xù)2-10個(gè)星期(最優(yōu)選持續(xù)4星期左右)。
對(duì)于放射性標(biāo)記抗-CD20抗體的使用來說，優(yōu)選抗體是非嵌合的，該優(yōu)選是根據(jù)與鼠抗體相比，嵌合抗體的循環(huán)半衰期明顯要長些來預(yù)測(cè)出的(即由于循環(huán)半衰期較長時(shí)，放射性核素在患者體內(nèi)存在時(shí)間增長)。但是，如果相對(duì)于鼠抗體來說，與嵌合抗體相結(jié)合使用時(shí)，采用較低毫居里(mCi)劑量，則放射性標(biāo)記抗體可以有益地施用。該情況使得在保持治療效益的同時(shí)，骨髓毒性可降至能接受的水平。
不同的放射性核素都可用于本發(fā)明，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地決定哪種放射性核素在不同情況下是最為適合的。例如，碘[131]是已知用于定靶免疫治療的放射性核素，但由于下述原因碘[131]的臨床應(yīng)用可能受到限制8天的物理半衰期;在血液中和腫瘤部位碘化抗體都發(fā)生脫鹵素作用;以及發(fā)射特性(例如大量γ成分)，它可使腫瘤中的局部劑量積累處于次優(yōu)化狀況。
隨著優(yōu)良螯合劑的出現(xiàn)，將金屬螯合基團(tuán)連于蛋白上的可能性，提高了使用其它放射性核素(例如銦[111]和釔[90])的機(jī)會(huì)。釔[90]用于放射性免疫治療有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)它的64小時(shí)的半衰期足以使得抗體沉積于腫瘤周圍，并且不像碘[131]之類，釔[90]是高能量的純?chǔ)掳l(fā)射源，其衰變時(shí)無γ射線相隨，在組織中，它的作用范圍為100-1000細(xì)胞直徑。而且，它的射線穿透量極小，使得門診病人可以施用釔[90]標(biāo)記抗體。再有，標(biāo)記抗體的內(nèi)化對(duì)于殺死細(xì)胞來說并不需要，而離子化射線的局部發(fā)射對(duì)于無靶抗原的相鄰腫瘤細(xì)胞來說應(yīng)是致命的。
釔[90]的一種非治療性限制是因?yàn)樗狈γ黠@的γ射線，使得以此造影很困難，為避免這一問題，在以釔[90]標(biāo)記抗-CD20治療給藥之前，將診斷“造影”放射性核素(例如銦[111])用來測(cè)定腫瘤的位置和相對(duì)尺寸。銦[111]用作特別優(yōu)選的診斷放射性核素，因?yàn)樵诩s1-約10mCi之間可安全給藥無明顯毒性;并且從其影像資料一般可預(yù)知隨后的釔[90]標(biāo)記抗體的分布。大部份造影研究采用5mCi銦[111]標(biāo)記抗體，因?yàn)樵搫┝考劝踩直绕疠^低劑量來說提高了造影效果，在施用抗體之后3-6天出現(xiàn)最優(yōu)影像。參見例如Murray，J.L.，26J.Nuc.Med.3328(1985)andCarraguillo，J.A.等人26J.Nuc.Med.67(1985)。
釔[90]標(biāo)記抗-CD20的有效單治療劑量(即治療學(xué)上有效量)在約5-約75mCi之間，更優(yōu)選約10-約40mCi之間。碘[131]標(biāo)記抗-CD20抗體的有效單治療非骨髓剝離劑量在約5-約70mCi之間，更優(yōu)選約5-約40mCi之間。碘[131]標(biāo)記抗-CD20抗體的有效單治療剝離劑量(即可以要求自體骨髓移植)在約30-約600mCi之間，更優(yōu)選約5-小于500mCi。在與嵌合抗-CD20抗體相結(jié)合時(shí)，由于比鼠抗體有較長的循環(huán)半衰期，碘[131]標(biāo)記嵌合抗-CD20抗體的有效單治療非骨髓剝離劑量在約5-約40mCi之間，更優(yōu)選小于約30mCi。成像標(biāo)準(zhǔn)(例如對(duì)銦[111]標(biāo)記物來說)一般小于約5mCi。
對(duì)于放射性標(biāo)記抗-CD20抗體，其治療可采用單次治療法或多次治療法。因?yàn)槭褂梅派湫院怂爻煞郑虼藘?yōu)選治療之前，收集經(jīng)受由放射性引起的潛在的致命骨髓毒性的病人的外周干細(xì)胞(PSC)或骨髓(BM)，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)收集BM和/或PSC，為能夠再輸注將其凈化和冷凍。此外，最優(yōu)選治療之前對(duì)病人進(jìn)行使用診斷標(biāo)記抗體(例如用銦[111]的診斷劑量測(cè)量法研究，其目的在于保證在任何正常器官或組織中，治療標(biāo)記抗體(例如使用釔[90])將不致于變得不必要的“過濃”。
已介紹過嵌合鼠-人抗體，例如見Morrison，S.L.etal.，PNAS116851-6854(1984年11月);歐洲專利公開No.173494;Boulianne，G.L.atal.，Nature312643(1984年12月);Neuleiger，M.S.etal.，Nature314268(1985年3月);歐洲專利公開No.125023;Tanatal.，J.Immunol.1358564(1985年11月);Sun，L.K.atal.，Hybridoma5/1517(1986);Sahaganetal.，J.Immunol.1371066-1074(1986)?？偟膮⒁奙uron，Nature312597(1984年12月);Dickson，GeneticEngineeringNews5/3(1985年3月);Marx，Science229455(1985年8月);以及MorrisonScience2291202-1209(1985年9月)。Robinsonetal.在PCT公開號(hào)WO88/04936中介紹了一種帶有人不變區(qū)及鼠可變區(qū)的嵌合抗體，對(duì)CD20的一個(gè)抗原決定基有特異性。Robinson參考文獻(xiàn)的嵌合抗體的鼠部分來源于2H7小鼠單克隆抗體(gamma2b，kappa)。雖然該文獻(xiàn)指出所述嵌合抗體是治療B細(xì)胞紊亂的“首選候選物”，但可以認(rèn)為該論點(diǎn)只不過是一種建議，對(duì)本領(lǐng)域研究人員來說要確定該建議是否對(duì)該特定抗體來說是正確的，特別因?yàn)樵撐墨I(xiàn)缺乏任何支持治療效果的數(shù)據(jù)，更重要的是缺乏使用高等哺乳動(dòng)物例如靈長目或人所得到的數(shù)據(jù)。
產(chǎn)生嵌合抗體的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，在不同的質(zhì)粒中使用免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈，其輕鏈和重鏈可以分開表達(dá)。然后可以將其提純并于體外組裝成完全的抗體。完成此種組裝的方法已有人介紹過，見例如Scharff，M.，Harvey Lectures 69125(1974)。從還原分離的輕鏈和重鏈形成IgG抗體的體外反應(yīng)參數(shù)也已有人介紹過，例如見Beychok，S.Cells of Immunoglobulin Synthesis，Academic Press，New Yorik，p.69，1979。將重鏈和輕鏈在同樣細(xì)胞中區(qū)表達(dá)使達(dá)到細(xì)胞內(nèi)協(xié)同并將重鏈和輕鏈連接成完全的H2L2IgG抗體也是可能的。該共表達(dá)在相同宿主細(xì)胞中使用相同質(zhì)粒，或者使用不同質(zhì)粒均可行。
另一方法，即我們?yōu)樾纬汕逗戏侨?人抗-CD20抗體的最優(yōu)選方法是基于使用包括(從頭開始)來自人源的編碼重鏈和輕鏈不變區(qū)的D-NA的表達(dá)載體。該載體能插入編碼非人可變區(qū)的DNA，以產(chǎn)生各種非人抗-CD20抗體，篩選并分析各種特性(例如結(jié)合特異性種類，抗原決定基結(jié)合區(qū)等等)。此后可將來自優(yōu)選的或所需的抗-CD20抗體的編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA摻入載體中。我們稱這些類型的載體為串聯(lián)嵌合抗體表達(dá)(TCAE)載體。一種最為優(yōu)選的，被用于產(chǎn)生治療淋巴瘤的免疫活性嵌合抗-CD20抗體的TCAE載體是TCAE8。TCAE8是本專利文件受讓人所擁有的稱作TCAE5.2的載體的衍生物，其區(qū)別在于TCAE5.2中顯性可選擇標(biāo)志(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶“NEO”)的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)是一個(gè)一致Kozak序列，而TCAE8中，該區(qū)域是一個(gè)部分損傷的一致Kozak序列。有關(guān)TCAE載體(也稱為ANEX載體)的顯性可選擇標(biāo)志的起始位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響的詳細(xì)內(nèi)容已詳細(xì)公開在本申請(qǐng)的共同未決申請(qǐng)中。
TCAE8包含四個(gè)(4)轉(zhuǎn)錄盒，這些按序串聯(lián)，即無可變區(qū)的人免疫球蛋白輕鏈;無可變區(qū)的人免疫球蛋白重鏈;DHFR;以及NEO。每一轉(zhuǎn)錄盒包含其本身的真核生物啟動(dòng)子及多聚腺苷化區(qū)(參考圖1，該圖以圖形表示TCAE8載體)，特別是1)免疫球蛋白重鏈前面的CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子是輕鏈前面的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，從-350位的NheI位點(diǎn)到-16位的SstI位點(diǎn)的截短部分(見41Cell521，1985);
2)通過PCR反應(yīng)由cDNA擴(kuò)增衍生出人免疫球蛋白輕鏈不變區(qū)。在TCAE8中，這是人免疫球蛋白輕鏈K不變區(qū)(Kabat編號(hào)，氨基酸108-214，異型Km8(見Kabat，E.A."Sequences of proteins of immunological interest"NIH Publication，F(xiàn)ifth Ed.No.91-3242，1991))，和人免疫球蛋白重鏈γ1不變區(qū)(Kabat編號(hào)氨基酸114-478，異型Gmla、Gmlz)。該輕鏈從正常人血中分離(IDEC Pharmaceuticals Corporation，La Jolla，CA);其RNA被用于合成cDNA，然后用PCR技術(shù)將其擴(kuò)增(引物來自Kabat一致序列)。重鏈從以RNA制備的cDNA分離出(使用PCR技術(shù))，所述RNA則從以人IgG1載體(見，3 Prot.Eng.531，1990;vector pNr162)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞衍生的。在該分離人IgGl中有二個(gè)氨基酸被改變使之與來自Kabat的一致氨基酸序列相匹配，即氨基酸225由纈氨酸變?yōu)楸彼?GTT到GCA)，而氨基酸287由蛋氨酸變?yōu)橘嚢彼?ATG到AAG);
3)該人免疫球蛋白輕鏈和重鏈盒含有分泌免疫球蛋白鏈的合成信號(hào)序列;
4)該人免疫球蛋白輕鏈和重鏈盒含特異性DNA限制位點(diǎn)，該位點(diǎn)允許插入維持轉(zhuǎn)換讀碼，并且不改變免疫球蛋白鏈中發(fā)現(xiàn)的正常氨基酸的輕鏈和重鏈免疫球蛋白可變區(qū);
5)該DHFR盒包含其本身的真核生物啟動(dòng)子(小鼠β球蛋白主啟動(dòng)子，“BETA”)及多聚腺苷化區(qū)域(牛生長激素多聚腺苷化區(qū)，“BGH”);以及6)該NEO盒含其本身的真核生物啟動(dòng)子及多聚腺苷化區(qū)域(SV40早期多聚腺苷化區(qū)“SV”)。
就TCAE8載體和NEO盒來說，該Kozak區(qū)是部份損傷的一致Kozak序列(它包括一上游ClaI位點(diǎn))ClaI-3+1GGGAGCTTGGATCGATccTctATGGtt(在TCAE5.2載體中，該變化是在ClaI和ATG區(qū)之間，即ccAcc.)TCAE8的完全序列表(包括四個(gè)轉(zhuǎn)錄盒的特異成分)列于圖2中(SEQ.IDNO.1)。
正如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的，TCAE載體在生產(chǎn)免疫活性嵌合抗-CD20抗體時(shí)有益于大大縮短時(shí)間。生產(chǎn)和分離非人輕鏈和重鏈可變區(qū)，接著將其摻入人輕鏈不變轉(zhuǎn)錄盒及人重鏈不變轉(zhuǎn)錄盒中，使其生產(chǎn)出免疫活性嵌合抗-CD20抗體。
使用鼠源及雜交瘤技術(shù)，我們衍生出最優(yōu)選的，對(duì)CD20抗原具特異性的非人可變區(qū)。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，該鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)被直接克隆進(jìn)TCAE8載體-這是將非人可變區(qū)摻進(jìn)TCAE載體的最優(yōu)選途徑。該優(yōu)選方法主要是根據(jù)PCR反應(yīng)的效力及插入的精確性來預(yù)測(cè)出的。但是其它完成該目的的等同方法也是可采用的。例如使用TCAE8(或等同載體)可獲得非人抗-CD20抗體的可變區(qū)序列，接著合成序列各部分的寡核苷酸，如果適合合成整個(gè)序列，然后，將整個(gè)合成序列的各部分插入載體的適當(dāng)位置。相信本領(lǐng)域技術(shù)人員能完成該工作。
我們的最優(yōu)選免疫活性嵌合抗-CD20抗體，從使用包括來自單克隆抗-CD20抗體的鼠可變區(qū)的TCAE8載體衍生而來;該抗體(下面將詳細(xì)討論)稱為“2B8”。在TCAE8從2B8(TCAE8中的抗-CD20)所獲得的可變區(qū)完全序列列在圖3中(SEQ.ID.NO.2)。
用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞系最優(yōu)選哺乳動(dòng)物源;相信本領(lǐng)域的技術(shù)人員有能力優(yōu)選決定最適合于表達(dá)本文所需基因產(chǎn)物的具體宿主細(xì)胞系。典型的宿主細(xì)胞系包括(但不限于)DG44和DUXB11(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系，DHFR-)，HELA(人宮頸癌)，CVI(猴腎細(xì)胞系)，COS(帶有SV40T抗原的CVI衍生物)，R1610(中國倉鼠成纖維細(xì)胞)，BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)，HAK(倉鼠腎細(xì)胞系)，SP2/0(小鼠骨髓瘤)，P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-lclBPT(牛內(nèi)皮細(xì)胞)，RAJI(人淋巴細(xì)胞)以及293(人腎)。宿主細(xì)胞系一般可從市場(chǎng)購得，從美國組織培養(yǎng)收藏中心或從公開的文獻(xiàn)索取。
優(yōu)選的宿主細(xì)胞系是DG44(CHO)或SP2/0，分別參見Urland，G.etal.，"Effectofgammaraysandthedihydrofolatereductaselocusdeletionsandinversions"Som.Cell&Mol.Gen.12/6555-566(1986)和Shulman，M.etal.，"Abettercelllineformakinghybridomassecretingspecificantibodies."Nature276269(1978)。最優(yōu)選的細(xì)胞系是DG44?？衫帽绢I(lǐng)域任何現(xiàn)有技術(shù)來將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞。這些方法包括(但不限于)轉(zhuǎn)染(包括電泳及電穿孔)、與包膜DNA細(xì)胞融合、微注射及以完整病毒感染。參見Ridgway，A.A.G."MammalianExpressionvectors"Chapter24.2，pp.470-472Vectors，RodriguezandDenhardt，Eds.(Butterworths，Boston，MA1988)。最優(yōu)選的質(zhì)粒引入宿主中的方法是借助電穿孔。
實(shí)施例下述實(shí)施例不試圖(也不構(gòu)成)對(duì)本發(fā)明的限制。這些實(shí)施例試圖說明使用放射性標(biāo)記抗-CD20抗體(I2B8)劑量造影;放射性標(biāo)記抗-CD20抗體(Y2B8);及利用特定載體(TCAE8)和來自鼠抗-CD20單克隆抗體(2B8)的可變區(qū)衍生的免疫活性嵌合抗-CD20抗體(C2B8)。
Ⅰ.放射性標(biāo)記抗-CD20抗體2B8A.抗-CD20單克隆抗體(鼠)的生產(chǎn)(2B8)用人成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系SB給BALB/C小鼠反復(fù)接種(見Adams，R.A.etal.，“Directimplantationandserialtransplantationofhumanacutelymphoblasticleukemiainhamsters，SB-2”Can.Res.281121-1125(1968);該細(xì)胞系可取自美國組織培養(yǎng)物收藏中心，Rockville，MD.其保藏號(hào)為ATCCCCL120)，于3-4個(gè)月內(nèi)每周注射一次。正如由已知CD20-特異性抗體的抑制作用所測(cè)定的(所用抗-CD20抗體是Leu16，BecktonDickinson，SanJose，CA，Cat.NO.7670;和B1CoulterCorp.，Hialeah.FL.Cat.NO.6602201)，鑒定出表現(xiàn)出高抗-CD20抗體血清效價(jià)的小鼠。然后移除該鼠脾臟。按照Einfeld，D.A.etal(1988EMBO7711)所述方法，將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0相融合(SP2/0在ATCC的保藏號(hào)為ATCCCRL8006)。
用放射免疫測(cè)試法測(cè)試CD20的特異性，簡要說來，使用Valentine，M.A.等人(1989)在J.Biol.Chem.26411282所述的碘珠法以Ⅰ125放射標(biāo)記經(jīng)提純的抗-CD20 B1(Ⅰ125碘化鈉ICN.Irvine，CA.Cat No.28665H)。通過來自各融合孔的0.05ml培養(yǎng)基與1% BSA，PBS(pH7.4)中的0.05ml Ⅰ125標(biāo)記抗-CD20 B1(10ng)和含100，000SB細(xì)胞的0.5ml相同緩沖液一起共保溫來篩選雜交瘤。室溫下保溫1小時(shí)之后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔滴定平板上(V & P Scientific，San Diego，CA)來收集細(xì)胞并徹底洗滌。含未標(biāo)記抗-CD20 B1的平行孔和不含抑制抗體的孔分別作為陽性和陰性對(duì)照。將含大于50%抑制作用的孔放大并克隆。表現(xiàn)出最高抑制作用的抗體來自本文稱作“2B8”的克隆細(xì)胞系。
B.2B8-MX-DTPA結(jié)合物的制備ⅰ.MX-DTPA碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰酸根合苯甲基-3-甲基二(1，2-亞乙基)三胺五乙酸(碳-14標(biāo)記MX-DTPA)用作將放射性標(biāo)記連接到2B8上的螯合劑。操作MX-DTPA要保持在無金屬條件下進(jìn)行，即要采用無金屬試劑，若可能，同時(shí)采用Alconox洗滌，并用Milli-Q水漂洗的聚丙烯塑料容器(燒瓶、燒杯、量筒、移液管)。從Dr.OttoGansow處獲得干燥固態(tài)MX-DTPA(NationalInstituteofHealth，Bethesda，MD)并于4℃干燥貯存(避光)，按2-5mM濃度在Milli-Q水中配制原液，于-70℃貯存。也從CoulterImmunology(HialeahFlorida)獲得MX-DTPA的二鈉鹽水溶液并于-70℃貯存。
ⅱ.制備2B8采用以CENTRICON 30TM旋轉(zhuǎn)過濾器(30000D，MWCO;Amicon)反復(fù)緩沖交換的方法，將抗體轉(zhuǎn)移到無金屬的含150mM NaCl的50mM二羥乙基甘氨酸-NaOff(pH8.6)中來制備供與MX-DTPA連接用的純化2B8。一般是將50-200μl蛋白質(zhì)(10mg/nl)加入到過濾元件中，接著加入2ml二羥乙基甘氨酸緩沖液。于4℃，在Sorval SS-34轉(zhuǎn)子中上(6000 rpm，45min)將過濾器離心處理，保留液體積約50-100μl。使用同樣過濾器將該過程重復(fù)二次，將保留液轉(zhuǎn)移到聚丙烯1.5ml螺絲帽試管中檢測(cè)蛋白質(zhì)，稀釋至10.0mg/ml并于4℃貯存直到使用。將蛋白質(zhì)同樣使用前述方法轉(zhuǎn)移到含150mM NaCl和0.05%疊氮鈉的50mM檸檬酸鈉(pH5.5)中。
ⅲ.2B8與MX-DTPA的連接于室溫下在聚丙烯試管中將2B8與MX-DTPA連接。冷凍的MX-DTPA原液臨使用前再解凍。按MX-DTPA對(duì)2B8的摩爾比為4∶1的比例，將10mg/ml的蛋白質(zhì)50-200ml與MX-DTPA反應(yīng)。加入MX-DTPA原液并慢慢攪拌混合物，反應(yīng)便開始，該連接過程于室溫下過夜進(jìn)行(14-20小時(shí))。通過滲析或反復(fù)超濾將未反應(yīng)的MX-DTPA從連接物中移至(如實(shí)施例I.B.ⅱ所述)無金屬含0.05%疊氮鈉的生理鹽水(0.9%w/v)中。將蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)到10mg/ml并在聚丙烯試管中于4℃貯存直至放射標(biāo)記。
ⅳ.測(cè)定MX-DTPA摻入量用閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定MX-DTPA摻入量，將從純化連接物所得結(jié)果與碳[14]標(biāo)記的MX-DTPA的比活進(jìn)行比較。對(duì)于某些使用非放射性MX-DTPA(CoulterImmunology)的研究，則將連接物與已知濃度和比活的過量釔[90]放射性載體溶液一起培養(yǎng)來測(cè)定MX-DTPA的摻入量。
已知濃度的氯化釔原液以加入無載體釔[90](氯化物鹽)的無金屬0.05NHCl來配制。將該溶液的等分樣以閃爍計(jì)數(shù)分析測(cè)定該試劑的精確比活性。將相當(dāng)于預(yù)期將連接到抗體上的螯合物摩爾數(shù)的三倍量的氯化釔試劑(一般為2mcl/mcl抗體)加入到聚丙烯試管中，并用2M乙酸鈉調(diào)節(jié)pH到4.0-4.5。然后將連接抗體加入并于室溫下保溫15-30分鐘。加入20mMEDTA至終濃度為1mM來使反應(yīng)驟冷，并將溶液pH值用2M乙酸鈉調(diào)節(jié)到約6。
保溫5分鐘后，將整個(gè)內(nèi)容物用高效排阻色譜(見下文)進(jìn)行純化，將洗脫出的含蛋白質(zhì)級(jí)分合并，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并以等分樣測(cè)定放射性。用氯化釔[90]制劑的比活性及蛋白質(zhì)濃度來計(jì)算出螯合物的摻入量。
ⅴ.2B8-MX-DTPA的免疫活性使用整細(xì)胞ELISA測(cè)定連接2B8的免疫活性。通過離心收集培養(yǎng)物中的對(duì)數(shù)中期的SB細(xì)胞，并用1X HBSS洗滌二次。將細(xì)胞在HBSS中稀釋至1-2×106個(gè)細(xì)胞/ml，并按50，000-100，000個(gè)細(xì)胞/孔將其等分進(jìn)96孔聚苯乙烯微滴平板上。將該板真空干燥2小時(shí)(40-50℃，使細(xì)胞固定于塑料上，這些板于-20℃貯存干燥直至使用，檢測(cè)時(shí)，臨使用才將板加熱至室溫，然后用含1% BSA pH7.2-7.4的1X PBS封閉(2小時(shí))。將檢測(cè)樣品在1X PBS/1% BSA中稀釋，施于板上并以同樣緩沖液連續(xù)稀釋(1∶2)。于室溫下將板保溫1小時(shí)。用1X PBS洗板三次。將第二抗體(山羊抗小鼠IgGl-特異性HRP結(jié)合物50μl)加入各孔中(在1X PBS/1% BSA中按1∶1500稀釋)并于室溫下保溫1小時(shí)。用1X BPS洗板4次，接著加入ABTS底物溶液(50mM檸檬酸鈉，含0.01% ATBS及0.001% H2O2，pH4.5)。保溫15-30分鐘后在405nm波長處測(cè)定該板，在檢測(cè)試驗(yàn)中包括抗原陰性HSB細(xì)胞以檢測(cè)非特異性結(jié)合。將吸收率值分別對(duì)稀釋倍數(shù)作圖，并將其與在同樣板上使用天然抗體試驗(yàn)所獲值(代表100%免疫活性)相比較計(jì)算出連接物的免疫活性，在滴定圖的線性部分上取幾個(gè)值進(jìn)行比較并測(cè)出平均值(數(shù)據(jù)未顯示出)。
ⅵ.制備銦[111]標(biāo)記的2B8-MX-DTPA(I2B8)將連接物用無載體銦[111]放射標(biāo)記。將0.05MHCl中的同位素(0.1-2mCi/mg抗體)等分樣移進(jìn)聚丙烯管中并加入約十分之一體積的無金屬2MHCl。保溫5分鐘后，加入無金屬2M乙酸鈉調(diào)節(jié)pH到4.0-4.4。加入從在生理鹽水或含0.05%疊氮鈉的50mM檸檬酸鈉/150mMNaCl中的10.0mg/mlDTPA的原液來源的約0.5mg2B8-MX-DTPA，立即將混合物輕輕攪拌。用pH試檢查溶液的pH值，證實(shí)該值在4.0-4.5之間，并將混合物于室溫保溫15-30分鐘。然后加入20mMEDTA至終濃度為1mM而使反應(yīng)停止，再用2M乙酸鈉將反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)到約為pH6.0。
保溫5-10分鐘后，將未結(jié)合的放射同位素用排阻色譜除去。HPLC單元由WatersModel6000或TosoHaasModelTSK-6110溶劑傳輸體系分別配以WatersU6K或Rheodyne700注射閥組成。使用凝膠滲透柱(BioRadSEC-250;7.5×300mm或相近的TosoHaas柱)和SEC-250防護(hù)柱(7.5×100mm)來進(jìn)行色譜分離。該體系并裝有級(jí)分收集器(PharmaciaFrac200)及配有280nm濾光器的UV檢測(cè)器(PharmaciaModelUV-1)。將樣品上樣，并以1.0ml/min的流動(dòng)速度，用1×PBS(pH7.4)勻速洗脫。收集半毫升各級(jí)分在玻璃試管中，并將這些等分樣在γ計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。將低窗及高窗分別定于100和500KeV。
將相應(yīng)于洗脫出的蛋白峰的放射活性物加，用從柱中洗脫出的總放射性來除該數(shù)，來計(jì)算出放射性摻入量，該值表達(dá)為百分?jǐn)?shù)(未列出數(shù)據(jù))。在某些情況下，可用瞬息薄層色譜(ITLC)來測(cè)定放射性摻入量。將放射性標(biāo)記的連接物用1XPBS或1XPBS/1mMDTPA以1∶10或1∶20比例加以稀釋，然后將其1μl點(diǎn)在距1×5cmITLCSG紙條的一端1.5cm處，使用10%乙酸銨甲醇液∶水(1∶1v/v)進(jìn)行上行色譜使紙展開。將該紙條干燥，從中部橫切開，用γ計(jì)數(shù)法測(cè)定相應(yīng)各部分的放射活性。將與紙條下半部相對(duì)應(yīng)的放射活性(與蛋白質(zhì)結(jié)合放射活性)以總的放射性的百分?jǐn)?shù)表示，該總放射活性系將上下兩半的值相加而得(數(shù)據(jù)未列出)。
通過測(cè)量放射性標(biāo)記連接物的適當(dāng)?shù)确謽拥姆派湫詠頊y(cè)定比活性，該值對(duì)計(jì)數(shù)器效率(一般75%)進(jìn)行校正，并與前面利用280nm波長處的吸收率所測(cè)的連接物蛋白質(zhì)濃度相關(guān)，該結(jié)果值表達(dá)為mCi/mg蛋白。
在某些實(shí)驗(yàn)中，采用相似于上面所述方法但不用HPLC提純來用銦[111]放射性標(biāo)記2B8-MX-DTPA，該方法稱之為“混合速標(biāo)”法(mix-and-shoot)。
ⅶ.制備釔[90]標(biāo)記的2B8-MX-DTPA(Y2B8)遵循已介紹過的制備I2B8相同的方法用以制備釔[90]標(biāo)記的2B8-MX-DTPA(Y2B8)連接物，不同的是未采用2ngHCl;如上所述，所用釔標(biāo)記連接物制劑均用排阻色譜提純。
C.非人動(dòng)物研究Ⅰ.放射性標(biāo)記2B8-MX-DTPA的生物學(xué)分布以6-8周齡的BALB/C小鼠進(jìn)行I2B8的組織生物學(xué)分布評(píng)定。按照上述“混合速標(biāo)”法，使用臨床級(jí)2B8-MX-DTPA制備放射性標(biāo)記連接物。該連接物的比活是2.3mCi/mg，并將該連接物在含50mg/mlHSA的PBS(pH7.4)中配制。用100μlI2B8(約21μCi)給小鼠靜脈注射，將三只一組的各組小鼠于0、24、48及72小時(shí)以頸離位的方式殺死。殺死之后將尾、心臟、肺、肝、腎、脾、肌肉及大腿取下，洗滌并稱重;并將血液樣品取出用于分析。由γ計(jì)數(shù)法測(cè)定相應(yīng)各樣品的放射性，并且隨后測(cè)定出每克組織所注射劑量的百分比。未扣除各器官所帶的血液所代表的活性量。
另一個(gè)不同的方法是，分別將于4℃和30℃保溫10星期的2B8-MX-DTPA等分樣用銦[111]標(biāo)記，使二制劑中比活為2.1mCi/mg。然后按上述方法研究這些連接物在小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布。
對(duì)于劑量測(cè)定法測(cè)定來說，是用銦[111]標(biāo)記2B8-MX-DTPA，使其比活達(dá)2.3mCi/mg，以約1.1μCi量注射入20只BALB/C小鼠的各鼠體內(nèi)。然后分別于1、24、48及72小時(shí)將5只一組的各組鼠殺死，將其器官取出準(zhǔn)備用于分析。此外，也將皮膚，肌肉和骨各部分取出并處理以進(jìn)行分析;也于24-72小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)收集尿和糞便加以分析。
使用相似方法，用釔[90]放射標(biāo)記2B8-MX-DTPA，并在BALB/C小鼠體內(nèi)評(píng)估72小時(shí)期間其生物學(xué)分布。用HPLC排阻色譜提純之后，用約1μCi的臨床配制連接物(比活為12.2mCi/mg)，給五只一組的四組鼠分別進(jìn)行靜脈注射。然后于1、24、48及72小時(shí)將各組分別殺死，按上面所述分析其器官及組織。通過用γ閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量其軔致放射能量，從而測(cè)量相應(yīng)各組織樣品的放射活性，然后將活性值表達(dá)為每克組織注射劑量的百分?jǐn)?shù)或每器官注射劑量的百分?jǐn)?shù)。因?yàn)楦髌鞴偌捌渌M織經(jīng)反復(fù)漂洗除去了表面血液，這樣各器官不充盈血液，因此各器官活性值未減去內(nèi)部所帶的血液所代表的活性分布。
ⅱ.I2B8的腫瘤定位在患Ramos B細(xì)胞腫瘤的無胸腺小鼠體內(nèi)測(cè)定放射標(biāo)記2B8-MX-DTPA的定位作用。用含有1.2×107Ramos腫瘤細(xì)胞的0.1ml RPMI-1640，經(jīng)皮下注射(左后脅)給予6-8周齡的無胸腺小鼠，所說腫瘤細(xì)胞事先適應(yīng)在無胸腺小鼠體內(nèi)生長。兩星期中腫瘤長出，其重從0.07至1.1g。然后用100μl銦[111]標(biāo)記2B8-MX-DTPA(16.7μCi)給鼠靜脈注射，并將三只一組的各組鼠分別于0、24、48及72小時(shí)以斷頸方式殺死。殺死之后，取出尾、心、肺、肝、腎、脾、肌肉、大腿及腫瘤，洗滌并稱重，也取出血液樣品用于分析。用γ計(jì)數(shù)法測(cè)定相應(yīng)各樣品的放射活性，并算出每克組織所注射劑量的百分?jǐn)?shù)。
ⅲ.用放射性標(biāo)記2B8-MX-DTPA進(jìn)行生物學(xué)分布和腫瘤定位研究遵循上述(實(shí)施例I.B.Vⅲ.a)初步生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn)，用銦[111]放射標(biāo)記連接物2B8，使其比活性達(dá)2.3mCi/mg，將約1.1μCi注射入20只BALB/C小鼠的各只，測(cè)定放射性標(biāo)記物的生物學(xué)分布。隨后于1、24、48及72小時(shí)分別殺死五只一組的各組鼠，然后將其各器官及部分皮膚、肌內(nèi)及骨取出并處理以進(jìn)行分析。此外，在24-72小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)也收集尿及糞便加以分析。血中的放射性水平從1小時(shí)時(shí)所占每克注射劑量的40.3%降至72小時(shí)時(shí)的18.9%(未列出數(shù)據(jù))。而整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，心、腎、肌肉和脾各值則保持在0.7-9.8%的范圍內(nèi)。肺中的放射性水平發(fā)現(xiàn)從1小時(shí)時(shí)的14.2%降至72小時(shí)時(shí)的7.6%。而相似的肝每克注射劑量值分別為10.3%和9.9%。這些數(shù)據(jù)如下述用于測(cè)定放射吸收劑量估算I2B8。
在BALB/C小鼠體內(nèi)評(píng)估比活為12.2mCi/mg抗體的釔[90]標(biāo)記連接物的生物學(xué)分布。放射性摻入達(dá)＞90%，并用HPLC提純?cè)摲派湫詷?biāo)記的抗體。72小時(shí)內(nèi)評(píng)估主要器官及皮膚、肌肉、骨、以及尿和糞便中的放射性的組織積沉，并表達(dá)為注射劑量/g組織的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果(未列出)表明，相應(yīng)于血液的放射性水平從1小時(shí)時(shí)的每克注射劑量的約39.2%降至72小時(shí)時(shí)的約15.4%，而相應(yīng)于尾、心、腎、肌肉及脾的放射性水平，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中卻大致保持10.2%不變或稍小。重要的是相應(yīng)于骨的放射性是在1小時(shí)時(shí)的每克注射劑量的4.4%至72小時(shí)時(shí)的3.2%范圍內(nèi)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明該連接物中很少有游離釔與之共存，在研究過程中很少有游離放射性金屬釋放出。這些數(shù)據(jù)將如下述用于測(cè)定放射吸收劑量估算Y2B8。
制備2B8-MX-DTPA并用銦[111]標(biāo)記，使其比活達(dá)2.7mCi/mg，用于腫瘤定位研究。然后給12只患RamosB細(xì)胞腫瘤的無胸腺小鼠每只注射100μl標(biāo)記的連接物(約24μCi)。腫瘤重量為0.1-1.0g范圍。注射后的第0、24、48及72小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)，通過后眼窩穿刺抽取50μl血，斷頸殺死鼠，將尾、心、肺、肝、腎、脾、大腿及腫瘤取出，將組織處理并稱重，使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定相應(yīng)于各組織樣品的放射性，將其值表達(dá)為每克所注射劑量的百分?jǐn)?shù)。
結(jié)果(未列出)證明銦[111]2B8-MX-DTPA在腫瘤中的濃度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中穩(wěn)定增加。72小時(shí)之后注射劑量的13%沉積在腫瘤中。相反的在血液中的水平，在實(shí)驗(yàn)過程中由零小時(shí)時(shí)的超過30%降至72小時(shí)時(shí)的13%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有其它組織(除肌肉外)含每克組織的注射劑量的1.3%至6.0%之間;肌肉組織含有每克的注射劑量的約13%。
D.人類研究ⅰ.2B8和2B8-MX-DTPA用人組織作免疫組織學(xué)研究使用一組用丙酮固定的32種不同人組織來評(píng)價(jià)鼠單克隆抗體2B8的組織反應(yīng)活性。抗體2B8與具高度限制性組織分布形式的抗-CD20抗原反應(yīng)，該組織分布形式僅在淋巴樣組織(包括造血源的組織)中的細(xì)胞亞群中觀察到。
在淋巴節(jié)中，免疫活性在成熟外皮B-淋巴細(xì)胞群體以及胚層中心繁殖細(xì)胞中觀察到。陽性反應(yīng)也在外周血，扁桃體B細(xì)胞面、脾的白髓以及胸腺中發(fā)現(xiàn)的40-70%髓質(zhì)淋巴細(xì)胞中觀察到。陽性反應(yīng)也在大腸的固有層的濾泡(Peyer氏斑)中看到。最后，聚集或散布于各種器官的基質(zhì)中(這些器官包括膀胱、乳房、宮頸、食管、肺、肋腺、前列腺、小腸及胃)的淋巴樣細(xì)胞與抗體2B8反應(yīng)也是陽性的(數(shù)據(jù)未列出)。
發(fā)現(xiàn)所有簡單的上皮細(xì)胞、以及分層的上皮及不同器官的上皮都不與之反應(yīng)。同樣，與神經(jīng)外胚層細(xì)胞(包括腦，脊椎及外周神經(jīng)的外胚層細(xì)胞)也不反應(yīng)。間質(zhì)元件，例如骨胳和平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及多形態(tài)核炎性細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)是陰性的(未列出數(shù)據(jù))。
使用用丙酮固定的一組16種不同人組織來評(píng)價(jià)2B8-MX-DTPA連接物組織反應(yīng)活性。正如前面用天然抗體所證明的(未列出數(shù)據(jù))，該2B8-MX-DTPA連接物也識(shí)別表現(xiàn)出高度限制性分布形式的CD20抗原，該分布形式僅在淋巴樣來源細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)。在淋巴節(jié)中，免疫活性在B細(xì)胞群體中觀察到。在脾的白髓及胸腺髓質(zhì)淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)很強(qiáng)反應(yīng)活性。在膀胱、心臟、大腸、肝、肺及子宮中散布的淋巴細(xì)胞中也觀察到免疫活性，這歸結(jié)于這些組織中存在炎性細(xì)胞所致。正如與天然抗體一樣，神經(jīng)外胚層細(xì)胞或間質(zhì)元件也未發(fā)現(xiàn)反應(yīng)活性(未列出數(shù)據(jù))。
ⅱ.I2B8(造影)及Y2B8(治療)的臨床分析a.Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)單劑量治療研究現(xiàn)進(jìn)行Ⅰ/Ⅱ期I2B8(造影)臨床分析，接著進(jìn)行Y2B8單劑量治療臨床分析。對(duì)單劑量研究，采用下述方案1.收集外周干細(xì)胞(PSC)或骨髓(BM)并凈化;
2.I2B8造影;
3.Y2B8治療(三種劑量水平);及4.PSC或自體BM移植(假如必要，則根據(jù)連續(xù)3天絕對(duì)中性白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于500/mm3或血小板低于20000/mm3，同時(shí)骨髓檢查時(shí)無骨髓復(fù)原跡象來決定)。
Y2B8的劑量水平如下劑量水平劑量(mCi)120230340每個(gè)劑量水平用來治療3個(gè)患者，以確定最大耐受劑量(MTD)。
造影(劑量測(cè)量法)研究進(jìn)行如下使用I2B8對(duì)每個(gè)患者進(jìn)行二次體內(nèi)生物學(xué)分布研究。第一次實(shí)驗(yàn)中，以1小時(shí)內(nèi)靜脈輸注(ⅰ.ⅴ.)給藥2mgI2B8(5mCi);一星期后由靜脈給藥2B8(即非連接抗體)，其輸入速率不超過250mg/hr，緊接著在1小時(shí)期間靜脈給藥2mgI2B8(5mCi)。在上述兩次實(shí)驗(yàn)中I2B8輸注之后立即給每個(gè)患者造影，在時(shí)間t＝14-18小時(shí)(假如指明)、t＝24小時(shí)、t＝72小時(shí)及t＝96小時(shí)(假如指明)重復(fù)造影。測(cè)定整個(gè)身體銦[111]標(biāo)記的平均保留時(shí)間;也對(duì)可識(shí)別器官或腫瘤患部(有意義區(qū)域)作此種測(cè)定。
將這些有意義區(qū)域與整個(gè)身體的標(biāo)記物濃度進(jìn)行比較。根據(jù)該比較結(jié)果，使用標(biāo)準(zhǔn)方法可測(cè)定Y2B8的估計(jì)位置及濃度。假如Y2B8的估計(jì)累積劑量比估計(jì)的整個(gè)身體的劑量大8倍、或假如肝中的估計(jì)累積劑量超過1500cGy，那么不應(yīng)以Y2B8來處理。
假如該造影研究可以接受，那么先按0.0或1.0mg/kg患者體重的2B8量，由靜脈輸注給藥，其輸入速率不超過250mg/小時(shí)。然后以20mCi/小時(shí)的速度靜脈輸注Y2B8(10、20或40mCi)給藥。
b.Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)多劑量治療研究現(xiàn)進(jìn)行Y2B8的Ⅰ/Ⅱ期臨床分析，對(duì)于多劑量研究，按下述方案1.收集PSC或BM;
2.I2B8造影;
3.Y2B8治療(三種劑量水平)采用4次劑量或者總累積劑量為80mCi;及4.PSC或自體BM移植(根據(jù)醫(yī)生的決定)Y2B8的劑量水平如下劑量水平劑量(mCi)110215320每個(gè)劑量水平治療三個(gè)患者確定其MTD。
造影(劑量測(cè)量法)研究按如下進(jìn)行用頭二個(gè)患者測(cè)定未標(biāo)記抗體(即2B8)的優(yōu)選造影劑量。四小時(shí)期間，這頭兩個(gè)患者將接受250CC生理鹽水中的未標(biāo)記2B8100mg，接著給予0.5mCiI2B8。于時(shí)間t＝0，t＝10min，t＝120min，t＝24hr，t＝48hr收集血樣供生物學(xué)分布測(cè)定用。分別在t＝2hr，t＝24hr及t＝48hr用多區(qū)域γ照相機(jī)攝取影象。在第48小時(shí)攝影后，給病人如上述輸入250mg2B8，接著給予4.5mCiI2B8，然后按上面所述取血及攝影。假如100mg2B8產(chǎn)生優(yōu)良影象，那么隨后兩個(gè)病人按上面所述給予50mg2B8，接著給予0.5mCiI2B8，48小時(shí)后再給與100mg2B8，然后再給4.5mCiI2B8。假如250mg2B8產(chǎn)生優(yōu)良影像，然后下兩個(gè)病人將按上述給予250mg2B8，接著給予0.5mCiI2B8，48小時(shí)之后再給予500mg2B8并給予4.5mCiI2B8。后面的病人將以提供最優(yōu)造影的最低量2B8處理。最優(yōu)造影定義如下(1)使抗體消失最慢的最有效造影;(2)在單一器官中分隔最小的最好分布狀況;(3)患處的最佳主觀分辨度(腫瘤/背景對(duì)比)。
對(duì)于前4個(gè)病人，Y2B8的第一次治療劑量將在I2B8最后劑量后的第14天開始，而后面的病人Y2B8第一次治療劑量將在I2B8后的2-7天開始。
用Y2B8治療之前，除了前面的4個(gè)病人外其余的病人按上面所述給與2B8，接著靜脈輸注Y2B8(在5-10分鐘期間輸完)。在t＝0分鐘，t＝10分鐘，t＝120分鐘，t＝24小時(shí)，t＝48小時(shí)分別取血樣用于生物學(xué)分布。約每6-8星期患者將收到重復(fù)Y2B8劑量(與第一次劑量相同的劑量給藥)最多共4次，或總累計(jì)劑量80mCi。最優(yōu)選患者的WBC大于或等于3000，且AGC大于或等于100，000之后再接受隨后的Y2B8劑量。
三種劑量水平研究完成之后，將確定MTD值，然后其它的患者再進(jìn)入研究，這些患者將接受MTD。
Ⅱ.嵌合抗-CD20抗體的生產(chǎn)(C2B8)A.嵌合抗-CD20免疫球蛋白DNA表達(dá)載體的構(gòu)建從2B8小鼠雜交瘤細(xì)胞分離出RNA(如Chomczynki，P.等人在“SinglestepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction.”Anal.Biochem.162156-159(1987)中所述)，并由此制備cDNA。通過聚合酶鏈反應(yīng)，使用與小鼠輕鏈信號(hào)序列5′端和小鼠輕鏈J區(qū)3′端同源的一套DNA引物，從cDNA中分離小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)DNA。引物序列如下1.VL有意義(SEQ.ID.NO.3)5′ATCACAGATCTCTCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGCTTC3′(下面劃線的部分是BglⅡ位點(diǎn);上面劃線的部分是起始密碼子)2.VL反義(SEQ.ID.NO.4)5′TGCAGCATCCGTACGTTTGATTTCCAGCTT3′(下面劃線部分是BsiWI位點(diǎn))TCAE8中的相應(yīng)BglⅡ和BsiWI位點(diǎn)見圖1和2，TCAE8中抗-CD20中的相應(yīng)位點(diǎn)見圖3。
將這些得到的DNA片段直接克隆進(jìn)TCAE8載體中人kappa輕鏈不變區(qū)的前面并測(cè)序。所測(cè)定的鼠可變區(qū)輕鏈的DNA序列繪于圖4中(SEQ.ID.NO.5)，也見圖3核苷酸978至1362。圖4也提供來自該鼠可變區(qū)的氨基酸序列以及CDR和構(gòu)架區(qū)。來自2B8的小鼠輕鏈可變區(qū)是小鼠kappaⅥ家族，見前面所述Kabat的文獻(xiàn)。
按相似方法分離出小鼠重鏈可變區(qū)并克隆到人IgGl不變區(qū)之前。
引物如下1.VL有意義(SEQ.ID.NO.6)5′GCGGCTCCCACGCGTGTCCTGTCCCAG3′(底下劃線的部分是MluI位點(diǎn))2.VL反義(SEQ.ID.NO.7)5′GG(G/C)TGTTGTGCTAGCTG(A/C)(A/G)GAGAC(G/A)GTGA3′(下面劃線的部分是NheI位點(diǎn))TCAE8中的相應(yīng)MluI和NheI位點(diǎn)見圖1及圖2，TCAE8中抗-CD20中的相應(yīng)位點(diǎn)見圖3。
該小鼠重鏈的序列繪于圖5(SEQ.ID.NO.8)，也參見圖3，核苷酸2401至2820。圖5也提供來自該鼠可變區(qū)的氨基酸序列以及CDR和構(gòu)架區(qū)。來自2B8的小鼠重鏈可變區(qū)是小鼠VH2B家族，見前面所述Kabat的文獻(xiàn)。
B.創(chuàng)建產(chǎn)生嵌合抗-CD20的CHO和SP2/0轉(zhuǎn)染瘤將中國倉鼠卵(CHO)細(xì)胞DG44于減次黃嘌呤和胸苷的SSFMⅡ培養(yǎng)基(Gibco，GrandIsland，NY，F(xiàn)ormNo.910456PK)中培養(yǎng);而將SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞在Dulbecco氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(IrvineScientific，SantaAna，Ca.，Cat.No.9024)并加有5%胎牛血清及20ml/l谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用BTX600電穿孔體系(BTX.SanDiego.CA)在0.4ml一次性電穿孔池中，以由NotⅠ所限制過的25μgCHO或50μgSP2/0質(zhì)粒DNA將4百萬細(xì)胞電穿孔，條件是CHO用210伏，SP2/0用180伏，400微法，13歐姆。各電穿孔物鋪于6個(gè)96孔的平皿(約7000個(gè)細(xì)胞/孔)上。各平皿加以含G418(GENETICIN，Gibco，Cat.No.860-1811)的培養(yǎng)基，其加入方式是對(duì)于CHO來說，以400μg/ml活性化合物比例(培養(yǎng)基中還包括50μM次黃嘌呤和8μM胸苷)加入，或?qū)P2/0來說按800μg/ml加入，于電穿孔后兩天加入，此后2或3天加一次直至菌落產(chǎn)生為止。將菌落的上清液用對(duì)人抗體特異性的ELISA來檢測(cè)其嵌合免疫球蛋白的存在。將產(chǎn)生最高量免疫球蛋白的菌落展開，并鋪于含加氨甲蝶呤(25nM為SP2/0，5nM為CHO)的培養(yǎng)基的96孔平板上，2-3天添加一次。按上面所述檢測(cè)上清液并檢查產(chǎn)生最大量免疫球蛋白的菌落。使用蛋白A親和色譜將嵌合抗-CD20抗體從上清液中提純。
采用聚丙烯酰胺電泳法分析提純的嵌合抗-CD20，并估計(jì)純度超過95%。根據(jù)2B8確定嵌合抗體的親和性及特異性。以直接和競(jìng)爭結(jié)合測(cè)試法試驗(yàn)嵌合抗-CD20抗體，與鼠抗-CD20單克隆抗體2B8相比，證明對(duì)許多CD20陽性B細(xì)胞系有差不多的親合性及特異性(數(shù)據(jù)未列出)。通過I125放射標(biāo)記嵌合抗-CD20直接結(jié)合來測(cè)定嵌合抗體的表觀親和常數(shù)(Kap)并且以Scatchard作圖法來與放射性標(biāo)記2B8相比較。估測(cè)出的CHO產(chǎn)生的嵌合抗-CD20的Kap是5.2×10-9M，而SP2/0產(chǎn)生的抗體為7.4×10-9M，2B8估測(cè)的Kap是3.5×10-9M。放射免疫測(cè)試的直接競(jìng)爭用來通過比較其與2B8有效競(jìng)爭的能力確認(rèn)嵌合抗體的免疫活性的特異性及保留程度。產(chǎn)生對(duì)B細(xì)胞上CD20抗原結(jié)合作用50%抑制作用所需的嵌合抗-CD20和2B8抗體的量基本相等(數(shù)據(jù)未列出)，即設(shè)想由于嵌合作用所引起的抗-CD20抗體的抑制活性損失極小。
實(shí)施例Ⅱ.B的結(jié)果特別表明，使用TCAE8載體從CHO和SP2/0轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生嵌合抗-CD20抗體，該嵌合抗體基本上與鼠抗-CD20單克隆抗體2B8有相同的特異性和結(jié)合能力。
C.嵌合抗-CD20抗體的免疫活性測(cè)試ⅰ.人Clq分析以流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)試法，使用螢光素標(biāo)記Clq(Clq從Quidel，Mira Mesa，CA.Prod.No.A400獲得，而FITC標(biāo)記從Sigma，St.Louis MO，Prod.No.F-7250獲得，按照Selected Methods In Cellular Immunology，Michell & Shiigi，Ed.(W.H.Freeman & Co.San Francisco，CA，1980，p.292)一書所述方法進(jìn)行Clq的FITC標(biāo)記)來評(píng)價(jià)由CHO和SP2/0細(xì)胞系產(chǎn)生的嵌合抗-CD20抗體對(duì)人Clq的結(jié)合作用。使用Becton Dickinson FACScanTM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(在515-545nm范圍內(nèi)測(cè)量螢光素)來得到分析結(jié)果。相等量的嵌合抗-CD20抗體，人IgGl，K骨髓瘤蛋白(Binding site，San Diego，Ca，Prod.No.BP078)和2B8與相當(dāng)數(shù)量的CD20-陽性SB細(xì)胞共培養(yǎng)，接著用FACS緩沖液(.2% BSA于PSA中，pH7.4，.02%疊氮鈉)洗滌，除去未連接的抗體，接著與FITC標(biāo)記的Clq一起培養(yǎng)，保溫30-60分鐘之后，再次洗滌細(xì)胞。用FACScanTM，遵循廠商的說明對(duì)三種條件(包括FITC標(biāo)記Clq作為對(duì)照)進(jìn)行分析。結(jié)果繪于圖6中。
正如圖6所顯示的，僅僅對(duì)于嵌合抗-CD20抗體條件才觀察到顯著的螢光增強(qiáng)，即僅僅與嵌合抗-CD20抗體結(jié)合的SB細(xì)胞才呈Clq陽性，而其它條件則得到與對(duì)照物相同的圖形。
ⅱ.補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解在人血清存在下(補(bǔ)體源)分析嵌合抗-CD20抗體溶解淋巴瘤細(xì)胞系的能力。于37℃，將100μCi51Cr與1×106SB細(xì)胞混合1小時(shí)，由此以51Cr標(biāo)記CD20陽性SB細(xì)胞。然后在相等量的人補(bǔ)體及相當(dāng)量的(0-50μg/ml)嵌合抗-CD20抗體或2B8存在下，于37℃，將標(biāo)記SB細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)(見Brunner，K.T.et al.，"Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on51Cr-labeled allogeneic target cells in vitro"Immunology 14181-189(1968))，結(jié)果繪于圖7。
圖7的結(jié)果特別表明，在這些條件下，嵌合抗-CD20抗體產(chǎn)生顯著溶胞作用(49%)。
ⅲ.抗體依賴性細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞檢測(cè)利用CD20陽性細(xì)胞(SB)和CD20陰性細(xì)胞(T細(xì)胞白血病系HSB，見Adams，Richard，"Formal Disussion"Can.Res.272479-2482(1967);ATCC保藏號(hào)ATCC CCL 120.1)進(jìn)行該項(xiàng)研究，該兩細(xì)胞用51Cr標(biāo)記。分析按照Brunner，K.T.et al.，"Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on51Cr-labeled allogeneic target cells in vitro;inhibition by isoantibody and drugs."Immunology 14181-189(1968)所述方法進(jìn)行。于37℃保溫4小時(shí)后，觀察到CD20陽性SB靶細(xì)胞(51Cr-標(biāo)記)的嵌合抗-CD20抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的顯著的溶胞作用，并且該效果也由CHO和SP2/0產(chǎn)生的抗體所觀察到(效應(yīng)細(xì)胞是人外周淋巴細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞靶的比例是100∶1)。靶細(xì)胞的有效溶解于3.9μg/ml獲得。相反的，在同樣情況下，鼠抗-CD20單克隆抗體2B8從統(tǒng)計(jì)學(xué)上看無明顯效果，而CD20陰性HSB細(xì)胞則不溶解。結(jié)果示于圖8中。
實(shí)施例Ⅱ的結(jié)果特別表明，實(shí)施例Ⅰ的嵌合抗-CD20抗體具免疫學(xué)活性。
Ⅲ.使用嵌合抗-CD20抗體體內(nèi)消耗B細(xì)胞A.非人靈長類動(dòng)物研究分別進(jìn)行三個(gè)非人靈長類動(dòng)物研究。為方便起見，這三個(gè)研究分別稱之為“嵌合抗-CD20CHO&SP2/0”，“嵌合抗-CD20CHO”及“高劑量嵌合抗-CD20”，其條件如下嵌合抗-CD20CHO&SP2/0將6只體重在4.5到7公斤范圍內(nèi)的獼猴(WhiteSandsResearchCenter，Alamogordo，NM)按2只一組分成三組。每組中的兩個(gè)動(dòng)物均給予相同劑量的免疫活性嵌合抗-CD20抗體，而每組一個(gè)動(dòng)物給予CHO轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生的純化抗體，另一個(gè)給予SP2/0轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生的抗體。三個(gè)組接受的抗體劑量相應(yīng)為每天0.1mg/kg，0.4mg/kg及1.6mg/kg持續(xù)連續(xù)4天。該嵌合免疫活性抗-CD20抗體與無菌鹽水混合，通過靜脈輸注給藥，每次輸注前取血樣。另外在最后一次注射后開始的24小時(shí)(T＝0)及此后的第1、3、7、14和28天均抽取血樣，并且此后按二星期的間隔再抽血樣直至第90天研究完成為止。
于2000RPM將約5ml來自各動(dòng)物的全血離心5分鐘。取出血漿用于檢測(cè)可溶的嵌合抗-CD20抗體水平。其沉淀(含外周血白細(xì)胞和紅血細(xì)胞)再懸浮于胎牛血清中用于螢光標(biāo)記抗體分析(見“FluorescentAntibodyLabelingofLymphoidCellPopulation”如后面所述)。
嵌合抗-CD20CHO將6只體重4-6公斤的獼猴(WhiteSands)按2只一組分成三組，所有的動(dòng)物均給注射從CHO轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生的免疫活性嵌合抗-CD20抗體(于無菌鹽水中)。該三組再按下法分開第一組每日靜脈注射0.01mg/kg抗體持續(xù)4天;第二組每日靜脈注射0.4mg/kg抗體持續(xù)4天;第三組單次靜脈注射6.4mg/kg抗體。三個(gè)組均在治療開始前抽取血樣，此后于最后注射之后的T＝0、1、3、7、14和28天如上所述分別抽血樣，這些血樣均都加工用于螢光標(biāo)記抗體分析(見后面“FluorescentAntibodyLabeling”)。除進(jìn)行外周血B細(xì)胞定量分析外，還在最后一次注射之后的第7、14及28天取淋巴節(jié)活檢，并且為用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行淋巴細(xì)胞總數(shù)定量分析而作單細(xì)胞制劑染色。
高劑量嵌合抗-CD20給2只獼猴(WhiteSands)每周輸注16.8mg/kg從CHO轉(zhuǎn)染瘤得到的免疫活性嵌合抗-CD20抗體(于無菌鹽水中)持續(xù)連續(xù)4周。治療結(jié)束時(shí)，將兩動(dòng)物麻醉取出骨髓，并取淋巴節(jié)活檢。用Leu16將兩份組織染色用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定B淋巴細(xì)胞的存在，此測(cè)定遵從Ling，N.R.等人的“B-cellandplasmacellantigens”LeucocyteTypingⅢWhiteCellDifferentiationsAntigens，A.J.McMichael，Ed.(OxfordUniversityPress，OxfordUK1987)p.302所述方法進(jìn)行。
淋巴樣細(xì)胞總體的螢光抗體標(biāo)記除去血漿之后，用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗白細(xì)胞二次，并再懸浮于與血漿等體積的胎牛血清(56℃熱失活30分鐘)中。將該細(xì)胞制劑0.1ml體積分配于6支15ml圓錐形離心管的每支中。將對(duì)人淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志CD2(AMAC，Westbrook，ME)，CD20(Becton Dickinson)及人IgM(Binding Site，San Diego，CA)具特異性的螢光素標(biāo)記單克隆抗體加入到這些管的3支中，用以鑒定T和B淋巴細(xì)胞總數(shù)。所有的試劑預(yù)先試驗(yàn)過對(duì)相應(yīng)的猴淋巴細(xì)胞抗原呈陽性。嵌合抗-CD20抗體與猴B細(xì)胞表面CD20的結(jié)合作用，在第4個(gè)管中使用與藻紅素偶聯(lián)的多克隆山羊抗-人IgG(AMAC)來測(cè)量。該試劑被預(yù)先吸附在猴Ig-瓊脂糖柱上以阻斥對(duì)猴Ig的交叉反應(yīng)活性，由此可進(jìn)行連接于細(xì)胞的嵌合抗-CD20抗體的特異性檢測(cè)并定量分析。第5支管既包含抗-IgM又包含抗-人IgG試劑用于B細(xì)胞群雙染色。第6支管中的樣品未加試劑用于測(cè)定自體螢光。將細(xì)胞與螢光抗體保溫30分鐘，用0.5ml固定緩沖液(0.15M NaCl，1%多聚甲醛 pH7.4)洗滌和固定，并在Beton Dickinson FACScanTM儀上分析。淋巴細(xì)胞總數(shù)一開始由前右夾角光散射在點(diǎn)繪圖上與未標(biāo)記的白細(xì)胞一起鑒定出。然后排除所有其它的作用，分離出總淋巴細(xì)胞總數(shù)，隨后的螢光測(cè)量值僅反映剩下的淋巴細(xì)胞特異性作用。
外周血B淋巴細(xì)胞的消耗雖然用CHO轉(zhuǎn)染瘤衍生的嵌合抗-CD20抗體，以1.6mg/kg及6.4mg/kg的劑量水平給猴注射后7天，而用SP2/0產(chǎn)生的抗體以0.4mg/kg劑量水平給猴注射后7天，B細(xì)胞恢復(fù)開始稍增，但CHO及SP2/0產(chǎn)生的抗體之間在效力上沒有看出有明顯差別。圖9A、B及C提供源于嵌合抗-CD20CHO及SP2/0研究的結(jié)果，其中圖9A針對(duì)0.4mg/kg劑量水平，圖9B針對(duì)1.6mg/kg劑量水平，而圖9C針對(duì)6.4mg/kg劑量水平。
正如圖9所證明的，在所有試驗(yàn)過的劑量范圍內(nèi)，治療處理之后，外周血B細(xì)胞水平出現(xiàn)急劇下降(＞95%)，并且這些水平保持到輸注后7天，經(jīng)過這一期間后，B細(xì)胞開始恢復(fù)，而開始恢復(fù)的時(shí)間與劑量水平無關(guān)。
在嵌合抗-CD20CHO研究中，每日4次注射(共0.04mg/kg)期間，采用10倍較低抗體劑量濃度(0.01mg/kg)。圖10給出這一研究結(jié)果，該劑量消耗外周血B細(xì)胞總數(shù)至正常水平的約50%(以抗-表面IgM或Leu16抗體估測(cè))。該結(jié)果也表明，對(duì)非人靈長類動(dòng)物來說，以免疫活性嵌合抗-CD20抗體在該劑量濃度，在該時(shí)間內(nèi)，便使得CD20抗原在B淋巴細(xì)胞群體上達(dá)到飽和的情況不會(huì)出現(xiàn)，治療處理之后最初3天內(nèi)，在血樣中檢出抗體包被的B淋巴細(xì)胞，然而在第7天時(shí)，便檢不出抗體包被細(xì)胞了。
表Ⅰ歸納了單劑量或多劑量免疫活性嵌合抗-CD20抗體對(duì)外周血細(xì)胞總數(shù)影響的結(jié)果，單劑量條件是6.4mg/kg，多劑量條件是0.4mg/kg連續(xù)4天(這些結(jié)果來源于上面所述對(duì)猴的研究)。
表ⅠC2B8靈長類動(dòng)物研究得出的外周血總數(shù)猴劑量天數(shù)CD2抗-HuIgGA0.4mg/kg預(yù)先抽血81.5-(4劑)086.50.2785.50.02193.3-2885.5-B0.4mg/kg預(yù)先抽血81.7-(4劑)094.60.1792.20.12184.9-2884.1-C6.4mg/kg預(yù)先抽血77.70.0(1劑)785.70.12186.7-2876.7-D6.4mg/kg預(yù)先抽血85.70.1(1劑)794.70.12185.2-2885.9-
抗-HuIgG+猴抗-Hu IgM*Leu-16 %B細(xì)胞消耗A-9.400.30.0970.11.299-2.178-4.166B-14.800.20.1990.10.199-6.953-8.741C0.217.000.10.099-14.715-8.162D0.114.400.20.099-9.246-6.753＊雙染色總數(shù)，它表明嵌合抗-CD20包被B細(xì)胞的程度。
歸納于表Ⅰ中的數(shù)據(jù)表明，不管單劑量或多劑量水平，在抗體過剩的情況下外周血中B細(xì)胞的消耗都很快且效果很好。此外，至少最后一次注射后7天都能觀察到消耗作用，到21天時(shí)觀察到部分B細(xì)胞恢復(fù)。
表Ⅱ歸納采用表Ⅰ的治療制式(0.4mg/kg4次日劑量或6.4mg/kg1次)時(shí)，免疫活性嵌合抗-CD20對(duì)淋巴結(jié)中細(xì)胞總數(shù)的影響，也提供正常淋巴結(jié)(對(duì)照猴、腋下和腹股溝的)和正常骨髓(二只猴)的比較值。
表Ⅱ淋巴節(jié)的細(xì)胞總數(shù)分析猴劑量天數(shù)CD2抗-HuIgMA0.4mg/kg766.9-(4劑)1476.919.62861.619.7B0.4mg/kg759.4-(4劑)1483.29.92884.115.7C6.4mg/kg775.5-(1劑)1474.117.92866.923.1D6.4mg/kg783.8-(1劑)1474.117.92884.112.8
表II(續(xù))抗-HuIgG+猴抗-Hu IgM*Leu-16 %B淋巴細(xì)胞消耗A7.440.110.822.644-26.036B29.952.200.714.564-14.664C22.335.2131.123.941-21.447D12.519.7510.28.778-12.968
表II(續(xù))抗-HuIgG+%B淋巴細(xì)胞CD2抗-HuIgM抗-HuIgMLeu16消耗正常淋巴節(jié)對(duì)照1腋下55.425.0-41.4NA腹溝股52.131.2-39.5NA正常骨髓對(duì)照265.319.0-11.4NA對(duì)照329.828.0-16.6NA表Ⅱ的結(jié)果表明，兩種治療制式均有效地消耗掉B淋巴細(xì)胞。表Ⅱ還表明，對(duì)于非人靈長類動(dòng)物來說，使用免疫活性嵌合抗-CD20抗體，則B細(xì)胞在淋巴組織中的完全飽和狀態(tài)不會(huì)達(dá)到。此外在治療后第7天觀察到抗體包被細(xì)胞，接著在第14天明顯地觀察到消耗掉淋巴結(jié)B細(xì)胞。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，進(jìn)行上述單次高劑量嵌合抗-CD20研究，主要是測(cè)定藥理學(xué)/毒理學(xué)。該研究用以評(píng)價(jià)隨著嵌合抗體的給藥所引起的毒性，以及B細(xì)胞從外周血淋巴結(jié)和骨髓中消耗的效力。此外，因?yàn)楸恝驍?shù)據(jù)表明，在那些實(shí)驗(yàn)中淋巴結(jié)B細(xì)胞大部分在治療后的7-14天消耗掉，因此可以證明采用周劑量制式會(huì)獲更佳效果。表Ⅲ歸納出高劑量嵌合抗-CD20研究的結(jié)果。
表Ⅲ淋巴結(jié)和骨髓的細(xì)胞總數(shù)分析淋巴細(xì)胞總數(shù)(%)猴 CD2 CD20amIgM+抗-C2B8bC2B8c天數(shù)d腹溝股淋巴節(jié)E90.05.34.86.522F91.06.35.66.322G89.95.03.75.836H85.412.31.71.836骨髓E46.74.32.62.822F41.83.02.12.222G35.30.81.41.436H25.64.44.34.436a表示以Leu16染色的總數(shù)。
b表示雙染色總數(shù)，對(duì)表面IgM細(xì)胞和嵌合抗體包被的細(xì)胞均為陽性。
c表示對(duì)嵌合抗體[包括雙染色表面IgM陽性細(xì)胞及單染色(表面IgM陰性)細(xì)胞]染色的總計(jì)數(shù)量。
d最后一次16.8mg/kg劑量注射后的天數(shù)。
被評(píng)價(jià)的兩動(dòng)物在治療停止后第22天含有的B細(xì)胞少于5%，而對(duì)照的淋巴結(jié)中為40%(見上表Ⅱ)。同樣，在以嵌合抗-CD20抗體治療的動(dòng)物骨髓中，CD20陽性細(xì)胞水平小于3%，而正常動(dòng)物為11-15%(見上表Ⅱ)。被評(píng)價(jià)的動(dòng)物在治療停止后第36天，其中1只(H)在淋巴結(jié)中有約12%B細(xì)胞，在骨髓中有4.4%B細(xì)胞，而另外1只(G)的淋巴結(jié)中有約5%細(xì)胞，骨髓中有0.8%，該數(shù)據(jù)表明了顯著的B細(xì)胞消耗作用。
實(shí)施例ⅢA.的結(jié)果特別證明了低劑量免疫活性嵌合抗-CD20可產(chǎn)生長效靈長類動(dòng)物體內(nèi)的外周血B細(xì)胞消耗。這些數(shù)據(jù)也證明，當(dāng)反復(fù)高劑量抗體給藥時(shí)，在外周淋巴結(jié)和骨髓中也能引起B(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的顯著消耗。繼續(xù)跟蹤試驗(yàn)動(dòng)物表明，即使在治療的第一星期產(chǎn)生如此嚴(yán)重的外周B淋巴細(xì)胞消耗，也未觀察到不利的健康影響。而且，還觀察到B細(xì)胞總數(shù)的恢復(fù)，由此得出結(jié)論，通過治療，這些靈長類動(dòng)物的多能干細(xì)胞不會(huì)受到不利影響。
B.C2B8的臨床分析ⅰ.C2B8的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)單劑量治療研究將組織學(xué)記載復(fù)發(fā)B細(xì)胞瘤的15個(gè)病人，在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中以C2B8治療。以劑量逐步升級(jí)實(shí)驗(yàn)方式給每個(gè)病人以單劑量C2B8，即以10mg/m2，50mg/m2，100mg/m2，250mg/m2及500mg/m2量，每種劑量分別給予3個(gè)病人，通過0.22微米孔襯里濾器經(jīng)靜脈輸注進(jìn)行治療，輸注用生理鹽水稀釋至最終體積250cc或最大濃度1mg/ml的C2B8。第1小時(shí)內(nèi)初始輸入速度為50cc/hr，若未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)，則劑量輸入速度可逐漸加大直至最大值200cc/hr。
毒性(由臨床醫(yī)生指明的)分級(jí)為從“無”，到“發(fā)熱”，到“中度”(兩個(gè)病人)直至“嚴(yán)重”(一個(gè)病人)，所有病人均完成了此治療處理過程。分析外周血淋巴細(xì)胞，特別測(cè)定C2B8對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞的影響。所有的病人得到一致結(jié)果，用C2B8輸注之后消耗外周血B淋巴細(xì)胞，此種消耗維持兩星期以上。
本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是由于具有四角為圓弧角的接線盒，符合施工所需的外形，提高施工速度，降低其成本。


圖1是本實(shí)用新型的俯視立體圖；圖2是本實(shí)用新型的仰視立體圖；圖3是圖1的立體分解圖；圖4是圖1的剖視圖；圖5是上述現(xiàn)有技術(shù)的壁式開關(guān)(或插座接線盒與圖6是本實(shí)用新型的壁式開關(guān)(或插座)接線盒的對(duì)照立體圖；圖7，7a、7b是上述現(xiàn)有技術(shù)的壁式開關(guān)(或插座)接線盒與圖8，8a、8b本實(shí)用新型的壁式開關(guān)(或插座)接線盒的沖壓端側(cè)壁長橢圓孔的優(yōu)點(diǎn)對(duì)照示意圖；圖9，10是現(xiàn)有技術(shù)的接線盒沖兩個(gè)四分孔示意圖；圖11a－11i是本實(shí)用新型連續(xù)模連續(xù)沖壓接線盒示意圖；圖12是市面上常用的接線盒側(cè)壁尺寸及設(shè)置兩個(gè)四分塑膠管孔的示意圖。
請(qǐng)參閱圖1、2所示，

形體(1)及一底板(2)構(gòu)成本實(shí)用鼠，雌性，約10周齡)中使用B細(xì)胞成淋巴瘤(Ramos腫瘤細(xì)胞)進(jìn)行研究。為進(jìn)行比較，其它小鼠也用C2B8和Y2B8治療。
在37℃和5% CO2條件下將Ramos腫瘤細(xì)胞(ATCC，CRL 1596)維持在使用補(bǔ)充有10%胎牛血清及谷氨酰胺的RPMI-1640的培養(yǎng)物中。給9只約7-10周齡的雌性裸鼠，使用裝有25號(hào)針頭的1cc注射器，經(jīng)皮下注射1.7×106Ramos細(xì)胞(體積為0.10ml，HBSS)，使其引發(fā)腫瘤。所有動(dòng)物控制在層流通風(fēng)廚中，并且所有的籠子，墊子，食物及水都經(jīng)高壓滅菌處理。通過割切腫瘤使腫瘤細(xì)能過篩，并將其通過40目篩，用IX HBSS(50ml)通過離心處理(1300 RPM)將細(xì)胞洗二次，再懸浮于IX HBSS至10×106細(xì)胞/ml，于-70℃冷凍直至使用。
為滿足不同實(shí)驗(yàn)條件，將細(xì)胞分幾批將其解凍，用離心法(1300 RPM)將其沉淀并用IX HBSS洗二次。然后再將細(xì)胞懸浮至約2.0×106細(xì)胞/ml。使用裝有25號(hào)針頭的1cc注射器給約9-12只小鼠皮下注射0.10ml細(xì)胞懸浮液，注射在動(dòng)物的左邊，接近中部區(qū)。在約兩周后腫瘤擴(kuò)展。將腫瘤切下并按上面所述處理，所試動(dòng)物按前述注射1.67×106細(xì)胞的0.10ml HBSS懸浮液。
根據(jù)初步的劑量實(shí)驗(yàn)，確定采用200mg C2B8和100μCi Y2B8用于此項(xiàng)研究。給90只雌性nu/nu小鼠(約10周齡)注射腫瘤細(xì)胞。約10天后，將24只鼠分成四個(gè)實(shí)驗(yàn)組(六只一組)同時(shí)努力在各組中維持差不多的腫瘤大小分布(平均腫瘤大小，以腫瘤的長×寬之積表示，約為80mm2)。使用裝有25號(hào)針頭的100μl Hamilton注射器，按下述劑量，通過尾靜脈注射法對(duì)下列各組進(jìn)行處理
A.生理鹽水B.Y2B8(100μCi)C.C2B8(200μg)及D.Y2B8(100μCi)+C2B8(200μg)初次注射后，以C2B8治療的組給予第二次C2B8注射(200μg/鼠)，用測(cè)徑器每2天或3天測(cè)量腫瘤一次。
按如下方法制備治療材料A.制備Y2B8將氯化釔[90](6mCi)移入聚丙烯試管，并用無金屬2M乙酸鈉調(diào)節(jié)pH值4.1-4.4。加入2B8-MX-DTPA(于生理鹽水中0.3mg，見上面2B8-MX-DTPA的制備)，并以渦旋方式輕輕混合。保溫15分鐘之后，加入0.05×體積20mMEDTA及0.05×體積2M乙酸鈉使反應(yīng)驟冷。將5.0μl該反應(yīng)混合物在含75mg/mlHSA及1mMDTPA的2.5ml1×PBS(配制緩沖液)中稀釋，測(cè)定其放射活性濃度，通過加入10.0μl到20mlEcolumeTM閃爍混合液中進(jìn)行計(jì)數(shù)。將剩余的反應(yīng)混合物加到3.0ml配制緩沖液中，無菌過濾并于2-8℃貯存直至使用。比活性(注射時(shí)為14mCi/mg)根據(jù)加到反應(yīng)混合物中的抗體量使用放射性濃度和計(jì)算出的蛋白質(zhì)濃度來計(jì)算。使用瞬息薄層色譜來測(cè)定蛋白相關(guān)放射性。放射性摻入為95%。使用之前將Y2B8在配制緩沖液中稀釋，并無菌過濾(最后的放射性濃度是1.0mCi/ml)。
B.制備C2B8按上述方法制備C2B8。C2B8在生理鹽水中以5.0mg/ml濃度作為無菌試劑提供。注射之前，該C2B8在生理鹽水中稀釋至2.0mg/ml并無菌過濾。
C.結(jié)果治療之后，腫瘤大小表達(dá)為長寬之積。按圖11(Y2B8與鹽水相比)，圖12(C2B8與鹽水相比)，圖13(Y2B8+C2B8與鹽水相比)所示日期測(cè)量，也測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)誤差。
正如圖13所示，Y2B8和C2B8結(jié)合使用表現(xiàn)出與單獨(dú)使用Y2B8或者C2B8所獲差不多的殺腫瘤效果。
Ⅴ.其它治療方案以前述實(shí)施例的觀點(diǎn)來找出其它治療方案是顯而易見的，一個(gè)這類方案是在約一星期內(nèi)使用C2B8所用的治療劑量，以2B8和放射性標(biāo)記2B8(例如Y2B8)結(jié)合給藥，或以2B8、C2B8及例如Y2B8一起給藥，或者以C2B8和例如Y2B8一起給藥。另一個(gè)方案是利用放射性標(biāo)記的C2B8-該方案使得采用C2B8的免疫活性部分的優(yōu)點(diǎn)加上了相應(yīng)的放射性標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的放射性標(biāo)記物包括釔[90]，它可給出與C2B8與鼠抗體2B8相比較大的循環(huán)半衰期。由于C2B8消耗B細(xì)胞的能力及可從放射標(biāo)記物得到的優(yōu)點(diǎn)，因此一個(gè)優(yōu)選的替代方案是用C2B8(以單劑量或多劑量)治療病人，使得大部份(假如不是全部)外周B細(xì)胞消耗掉，然后再用放射性標(biāo)記2B8，因?yàn)橥庵蹷細(xì)胞已消耗掉，那么放射性標(biāo)記2B8便增加了定靶腫瘤細(xì)胞的機(jī)會(huì)。由于已在文獻(xiàn)中報(bào)道過以碘[131]標(biāo)記的各種結(jié)果(見Kaminski的文獻(xiàn))，故優(yōu)選碘[131]標(biāo)記的2B8。一個(gè)其它優(yōu)選方案是首先使用放射性標(biāo)記2B8(或C2B8)，努力增加腫瘤的通透性，接著以單劑量或多劑量C2B8治療。該方案的意圖是增加C2B8達(dá)到腫瘤塊的外邊和里邊的機(jī)會(huì)。一個(gè)進(jìn)一步的方案是包括使用化療劑與C2B8結(jié)合使用。該方案包括所謂“交錯(cuò)”治療法，即用化療劑治療，接著用C2B8治療，然后再重復(fù)此法。此外，開始用單劑或多劑量C2B8治療，此后用化療治療也是可行的。優(yōu)選的化療劑包括(但不限于)環(huán)磷酰胺，阿霉素，長春新堿，及強(qiáng)的松(見Armitage，J.O.etal.，Cancer501695(1982)列入本文作為參考)。
前面列舉的替代治療方案并不作為一種限制范圍，而應(yīng)看作是有代表性的實(shí)例。
Ⅵ.有關(guān)保藏情況抗-CD20于TCAE8中(為保藏起見在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland，20852)，該保藏是遵從國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏，布達(dá)佩斯條約(簡稱布達(dá)佩斯條約)的規(guī)定而履行的。該微生物由ATCC于1992年11月9日進(jìn)行過試驗(yàn)證明其該日期仍存活。ATCC指定該微生物的ATCC保藏號(hào)為ATCC69119(抗-CD20于TCAE8中)。按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，雜交瘤2B8于1993年6月22日[保藏于ATCC。該培養(yǎng)物的存活力于1993年6月25日測(cè)定過，ATCC指定該雜交瘤的ATCC保藏號(hào)為HB11388。
序列目錄(1)總的情況(ⅰ)申請(qǐng)人DarrellAnderson，NabilHanna，JohnLeonard，RolandNewman，及MitchellReff和WilliamH.Rastetter(ⅱ)發(fā)明題目抗人類B淋巴細(xì)胞限制分化抗原的嵌合及放射標(biāo)記抗體在治療B細(xì)胞淋巴瘤中的應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)8(ⅳ)通訊地址(A)收信人IDEC藥物公司(B)街道11011TorreyanaRoad(C)城市SanDiego(D)州California(E)國家U.S.A(F)郵編92121(Ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀類型(A)媒介類型Diskette，3.5inch，1.44Mb(B)計(jì)算機(jī)Macintosh(C)操作系統(tǒng)MS.DOS(D)軟件MicrosoftWord5.0(ⅵ)現(xiàn)申請(qǐng)情況(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類
(ⅶ)代理人/代理機(jī)構(gòu)情報(bào)(A)姓名Burgoon，RichardP.Jr.
(B)登記號(hào)34，787(C)案卷號(hào)(ⅷ)電訊情報(bào)(A)電話號(hào)碼(619)550-8300(B)傳真(619)550-8750(2)SEQIDNO1情報(bào)(ⅰ)序列特征(A)長度8540堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意否(ⅸ)序列描述SEQIDNO1





(3)SEQIDNO2情報(bào)(ⅰ)序列特征(A)長度9209堿基(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意否(ⅸ)序列描述SEQIDNO2






(4)SEQIDNO3情報(bào)(ⅰ)序列特征(A)長度54堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意否(ⅸ)序列描述SEQIDNO25′ATCACAGATCTCTCACCATGGATTTTCAGGTBCAGATTATCAGCTTC3′(5)SEQIDNO4情報(bào)(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)
(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意否(ⅸ)序列描述SEQIDNO45′TGCAGCATCCGTACGTTTGATTTCCAGCTT3′(6)SEQIDNO5情報(bào)(ⅰ)序列特征(A)長度384堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意否(ⅸ)序列描述SEQIDNO5

(7)SEQIDNO6情報(bào)(ⅰ)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意否(ⅸ)序列描述SEQIDNO65′GCGGCTCCCACGCGTGTCCTGTCCCAG3′(8)SEQIDNO7情報(bào)(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意是(ⅸ)序列描述SEQIDNO75′GGSTGTTGTGCTAGCTGMRGAGACRGTGA3′(9)SEQIDNO8情報(bào)(ⅰ)序列特征
(A)長度420堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型DNA(基因組的)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅳ)反意否(ⅸ)序列描述SEQIDNO8

權(quán)利要求
1.治療B細(xì)胞淋巴瘤的方法，包括給人施用治療有效量的至少一種免疫活性嵌合抗-CD20抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中施用于所說人的所說抗體量是所說人的每公斤體重約0.001至約30mg抗體之間(mg/kg)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說抗體衍生自TCAE8中含抗-CD20的轉(zhuǎn)染瘤，該TCAE8中的抗-CD20貯存于美國典型培養(yǎng)物中心，是ATCC貯存號(hào)69119的微生物的一部分。
4.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步還包括施用第二種治療學(xué)上有效量的至少一種免疫活性嵌合抗-CD20抗體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說的抗體附加給藥于所說人，是在所說抗體對(duì)所說人的所說第一次給藥之后的約7天內(nèi)進(jìn)行。
6.治療B細(xì)胞淋巴瘤的方法，包括下述步驟1)在第一次給藥期間，第一次給人治療有效量的免疫活性嵌合抗-CD20抗體;2)在第二次隨后給藥期間，給與第二次治療有效量的所說抗體;3)在第三次隨后給藥期間，給與第三次治療有效量的所說抗體;
7.權(quán)利要求6的方法，其中所說的第1、第2和第3次所說抗體治療有效量為約0.001mg/kg至約30mg/kg之間。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所說第二次給藥期是在所說第一次給藥期的約7天內(nèi)。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所說第三次給藥期是在所說第一次給藥期的約14天內(nèi)。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所說的抗體衍生自TCAE8中含抗-CD20的轉(zhuǎn)染瘤(ATCC貯存號(hào)69119)。
11.免疫活性嵌合抗-CD20，它從含有TCAE8中的抗-CD20(ATCC保藏號(hào)69119)的轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生。
12.分泌抗-CD20抗體的雜交瘤，所說雜交瘤是美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)為HB11388的微生物。
13.從權(quán)利要求12的雜交瘤分泌的單克隆抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的放射性標(biāo)記抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的放射性標(biāo)記抗體，其中的放射性標(biāo)記物選自釔[90]，銦[111]及碘[131]所組成的一組之中。
16.治療B細(xì)胞淋巴瘤的方法，包括給人施用治療有效量的權(quán)利要求14的抗體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所說抗體的放射性標(biāo)記物是釔[90]。
18.治療B細(xì)胞淋巴瘤的方法，包括下述步驟1)在第一次給藥期，給人施用免疫活性嵌合抗-CD20抗體;及2)在第二次給藥期，給人施用放射性標(biāo)記抗-CD20抗體;
19.權(quán)利要求18的方法，其中嵌合抗-CD20，衍生自TCAE8中的抗-CD20的轉(zhuǎn)染瘤，該抗-CD20貯存于美國典型培養(yǎng)物收藏中心，是ATCC貯存號(hào)69119的微生物的一部分。
20.權(quán)利要求8的方法，其中所說放射性標(biāo)記抗體含由雜交瘤分泌的單克隆抗體，該雜交瘤是美國典型培養(yǎng)物收藏中心貯存號(hào)為HB11388的微生物的等同物。
全文摘要
本文公開了為治療B細(xì)胞淋巴瘤設(shè)計(jì)的治療學(xué)處理方法。這些方法基于包括使用免疫活性鼠/人嵌合抗-CD20抗體、放射性標(biāo)記抗-CD20抗體給藥的治療策略，以及包括使用嵌合抗-CD20抗體及放射標(biāo)記抗-CD20抗體的協(xié)作策略。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1094965SQ9312142
公開日1994年11月16日 申請(qǐng)日期1993年11月12日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月13日
發(fā)明者D·R·安德遜, N·漢納, J·E·里安納, R·A·紐曼, M·E·列夫, W·M·拉斯泰特 申請(qǐng)人:艾德藥品公司