專利名稱：胰島素制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人用藥特別是治療糖尿病的人用藥物領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及含有人胰島素分子的制劑，該制劑在使用時(shí)能夠更接近地模擬正常人體中所發(fā)現(xiàn)的胰島素的基礎(chǔ)水平。
在糖尿病治療中的主要治療目標(biāo)是生理控制血液葡萄糖水平。為此可利用許多不同的商品和制劑。為對(duì)付進(jìn)餐時(shí)發(fā)生的葡萄糖迅速升高，速效胰島素制品例如HumulinRegular或通常所說的單體胰島素類似物最為合適。
病人的葡萄糖負(fù)荷的另一個(gè)重要來源是肝臟低水平的基礎(chǔ)葡萄糖輸出，該輸出主要由食后代謝過程如糖原異生和糖原分解所致。在糖尿病患者中，該基礎(chǔ)葡萄糖輸出可在夜間顯著增加并形成高血糖持續(xù)期，尤其是在清晨，會(huì)產(chǎn)生所稱的黎明現(xiàn)象(dawnphenomenon)。所述高血糖期已被證明是糖蛋白(glycatedproteins)水平高的重要原因，臨床常常以糖基化血紅蛋白來進(jìn)行測(cè)定。這些衍生的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的增加和與糖尿病相關(guān)的慢性并發(fā)癥如神經(jīng)病、腎病和視網(wǎng)膜病有連帶關(guān)系。
對(duì)付所述基礎(chǔ)葡萄糖輸出的理想的胰島素制劑應(yīng)該是能導(dǎo)致將與肝臟低水平的葡萄糖輸出相一致的胰島素緩慢、恒定地注入血流中的制劑。按照該理想的基礎(chǔ)作用時(shí)間，與所述相符的最佳胃腸外用制品是市售牛超長(zhǎng)效胰島素，每天僅注射一次，它可將胰島素緩慢、恒定地釋入血流中而不會(huì)形成明顯的胰島素峰。
但是牛超長(zhǎng)效制劑的主要問題源于這樣一個(gè)事實(shí)，即牛胰島素在氨基酸順序方面與人胰島素不同。人體可將牛胰島素識(shí)別為異蛋白。糖尿素患者長(zhǎng)期注射這種致免疫物質(zhì)可以導(dǎo)致胰島素抗體形成。這可以引起胰島素作用時(shí)間和效價(jià)的改變并產(chǎn)生由于病人的激活的免疫系統(tǒng)而帶來的其它問題。由于這些原因，牛超長(zhǎng)效制劑仍不是理想的胃腸外用胰島素制劑。
1980年初，用于將豬胰島素轉(zhuǎn)化成人胰島素的DNA重組技術(shù)和新的酶技術(shù)的出現(xiàn)均使大量應(yīng)用人胰島素成為可能。為了解決上述牛超長(zhǎng)效制劑的問題，合乎邏輯的措施是將人超長(zhǎng)效胰島素晶體及其加工制劑制成胃腸外用制劑商品。人和牛超長(zhǎng)效胰島素制品的晶型、晶形、晶體大小、制備方法和制劑組成基本上相同。
但是，多年的臨床經(jīng)驗(yàn)得出了肯定的結(jié)果，即這些產(chǎn)品是不相同的。事實(shí)上，臨床報(bào)告表明，人超長(zhǎng)效制劑作用比牛超長(zhǎng)效制劑作用快，而豬超長(zhǎng)效制劑的作用時(shí)間介于這兩種制劑之間。在臨床實(shí)踐中，這使得許多內(nèi)科醫(yī)生和糖尿病研究學(xué)者建議對(duì)于人超長(zhǎng)效制劑應(yīng)每天注射2次。此外，在皮下注射后約12小時(shí)觀察到胰島素吸收入血流的明顯的峰。該現(xiàn)象不但削弱了該制品對(duì)抗肝臟的恒定基礎(chǔ)葡萄糖輸出的能力，而且也導(dǎo)致血胰島素增多，這本身可以產(chǎn)生血管擴(kuò)張(macrovascular)并發(fā)癥。
人和牛超長(zhǎng)效胰島素制品在作用時(shí)間方面不同的原因尚不完全清楚。牛胰島素抗體的存在不是所述作用時(shí)間不同的主要原因。一些研究表明，來自于人超長(zhǎng)效制劑的胰島素比牛超長(zhǎng)效制劑的在注射部位更快被吸收。在本專利說明書中進(jìn)一步描述的溶解測(cè)定對(duì)這個(gè)問題做了進(jìn)一步的探討?；谇笆鰷y(cè)定的改進(jìn)，這些溶解試驗(yàn)表明牛超長(zhǎng)效胰島素晶體在稀釋時(shí)比類似的人超長(zhǎng)效胰島素晶體的確要花費(fèi)長(zhǎng)得多的時(shí)間來溶解。牛和人胰島素之間氨基酸順序的差異可能產(chǎn)生包在該晶體中的胰島素六聚體的輕微差異，這導(dǎo)致其隨后的溶劑化速率的差異。在注射進(jìn)入皮下組織后，該牛胰島素晶體溶解的延遲可能導(dǎo)致其延長(zhǎng)的吸收和生物學(xué)作用時(shí)間(biologicaltimeaction)。
在人胰島素類似物的合成方法中作用時(shí)間的延長(zhǎng)已被仔細(xì)研究過。特別是，已經(jīng)進(jìn)行了諸如Gly(A21)Arg(B27)Thr-NH(B30)2人胰島素之類的改變(Jorgenesen等人，British Medical Journal 299，415-419(1989))和在Glu(B13)位的改變(Hansen，Biophysical Chemistry 39，107-110(1991))。然而，在所有這些情況中，引入新的氨基酸順序會(huì)將該外來分子引入人體中，因此可能同牛胰島素一樣致免疫，甚至致免疫可能更強(qiáng)。顯然，使用天然的人胰島素分子會(huì)比引入新的胰島素分子更好?？傊?，尚未見報(bào)道為將免疫學(xué)上優(yōu)選的人超長(zhǎng)效制劑的作用時(shí)間延長(zhǎng)至與藥物動(dòng)力學(xué)上優(yōu)選的牛超長(zhǎng)效制劑的生物學(xué)作用時(shí)間相同或較其更佳的高富鋅的人超長(zhǎng)效制劑，亦未見報(bào)道這樣的制劑的生產(chǎn)方法。
許多年以前人們就知道胰島素可成功地與鋅原子共結(jié)晶，獲得作用時(shí)間比水溶性、無定形、非晶的胰島素長(zhǎng)的數(shù)種類穩(wěn)定的晶體。魚蛋白質(zhì)魚精蛋白也已用作胰島素配位劑來延長(zhǎng)胰島素的作用時(shí)間，但其不均勻性和潛在的致免疫性(immunogenicity)使其對(duì)于長(zhǎng)期皮下注射使用的藥物不太具有吸引力。
在50年代早期，開發(fā)出一種牛胰島素晶體的新制劑，它在乙酸鹽緩沖液中只含有胰島素和鋅，pH為中性(Hallas-Mφller等人，Science116，394-398(1952))。該長(zhǎng)效胰島素，(Lenteinsulin)避開了磷酸根離子，所述磷酸根離子與鋅離子作用強(qiáng)，形成不溶性的磷酸鋅衍生物。僅在乙酸鹽緩沖液中含結(jié)晶性胰島素的制劑稱作超長(zhǎng)效制劑(Ultralente)。按該方式制備的晶體在本文中稱作超長(zhǎng)效胰島素晶體。
盡管在各胰島素六聚體中僅需要2個(gè)鋅原子配位以形成合適的超長(zhǎng)效晶體，但在各超長(zhǎng)效制劑中鋅確是摩爾過量的，而且發(fā)現(xiàn)每天注射一次牛超長(zhǎng)效制劑，作用時(shí)間是適當(dāng)?shù)?Schlichtkrull,InsulinCrystals，EjnarMunksgaard出版，哥本哈根(1958))。該文獻(xiàn)報(bào)道了同樣的結(jié)果(第92頁)，“在該超長(zhǎng)效制劑中用豬胰島素代替牛胰島素，作用持續(xù)時(shí)間顯然有點(diǎn)縮短。因此，為獲得時(shí)間恒定的治療用懸浮液，必須嚴(yán)格堅(jiān)持完全相同的品種或找到不同種胰島素間的固定比例?！蓖瑯樱瑩?jù)報(bào)道，糖尿病患者吸收豬超長(zhǎng)效胰島素比牛超長(zhǎng)效胰島素快(Brange，GalenicsofInsulin，第28頁，Springer-Verlag,柏林(1987))。然而，即使注意到了這些品種差異，但豬胰島素與人胰島素的結(jié)構(gòu)更接近，因而，比牛胰島素致免疫性小，為延長(zhǎng)豬超長(zhǎng)效制劑的作用時(shí)間以使其與牛超長(zhǎng)效制劑的相同或更長(zhǎng)的可能的制劑改變既未被證實(shí)，亦未被提出。事實(shí)上，早期報(bào)道(Hallas-Mφller，Diabetes5，7-12(1956))提示，鋅濃度在每100胰島素單位0.2mg以上不會(huì)有助于進(jìn)一步延長(zhǎng)任何種類的長(zhǎng)效(或超長(zhǎng)效)胰島素制劑的作用時(shí)間。
據(jù)報(bào)道，每100胰島素單位約0.09mg的鋅與不溶的牛超長(zhǎng)效胰島素晶體緊密結(jié)合(每個(gè)胰島素六聚體14個(gè)鋅原子)，而在上清液中每ml約0.05mg的較低濃度的游離鋅仍未被結(jié)合。恰恰在該胰島素制劑的濃度從40U/ml增至100U/ml時(shí)，上述兩個(gè)濃度被設(shè)計(jì)以保持恒定(Brange，GalenicsofInsulin，第37頁，Springer-Verlag，柏林(1987))。
在最近的美國(guó)專利說明書(US5070186)中有報(bào)道說，含高濃度(0.02-0.5M)的另一種二價(jià)金屬陽離子鎂的胰島素制劑結(jié)果是作用較快的胰島素制品。然而，令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，將氯化鋅或乙酸鋅固體或濃水溶液直接加至人超長(zhǎng)效制劑中使最終總的鋅濃度為每100胰島素單位約0.5-20mg，可以延遲該晶體的溶解，且可以將其生物學(xué)作用時(shí)間延長(zhǎng)至與牛超長(zhǎng)效制劑的一樣慢，或者甚至更慢。還發(fā)現(xiàn)，所述改變導(dǎo)致pH隨之由約pH7.4降至pH6.2。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)所述改變導(dǎo)致所加的鋅大部分留在上清液中并未與不溶的胰島素晶體結(jié)合。貯存一定時(shí)間后，它亦未明顯改變制劑中胰島素晶體的外觀形狀或大小或化學(xué)穩(wěn)定性。
本發(fā)明涉及包含超長(zhǎng)效胰島素晶體的懸浮液的胰島素制劑，在總制劑中，鋅濃度在每100胰島素單位約0.5-20毫克之間。在該制劑中的總鋅的50%以上留在可溶部分，而未與胰島素配合。該胰島素制劑的pH一般在約6.0-7.4之間。該鋅改變的制劑顯示出非常持久的人胰島素制品的特性。
就本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書而言，下列術(shù)語和縮寫定義如下。
制劑總鋅濃度-該制劑中鋅的全部濃度，不管所述鋅是與胰島素配合還是以可溶的形式存在。
超長(zhǎng)效胰島素-含有基本上按照Hallas-Mφller等人，Science116，394-398(1952)中所述方法在乙酸鹽緩沖液中制得的胰島素晶體的制劑。按此方法制得的晶體以后稱為超長(zhǎng)效胰島素晶體。
U-胰島素活性的標(biāo)準(zhǔn)國(guó)際單位。
Zn-鋅。
用在本公開文件中的所有的氨基酸縮寫均為美國(guó)專利商標(biāo)局所接受的在37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)中規(guī)定的縮寫。
本發(fā)明涉及包含超長(zhǎng)效晶體的懸浮液的胰島素制劑，制劑鋅總濃度在每100胰島素單位約0.5-20毫克之間。在該制劑中，總鋅的50%以上留在可溶部分，而未與胰島素配合。該胰島素制劑的pH一般在約6.0-7.4之間。此外，本發(fā)明的胰島素制劑不含象魚精蛋白之類的其它蛋白質(zhì)。該制劑可以含有防腐劑或等滲劑，并且還可以含有與鋅作用不強(qiáng)的緩沖劑。該鋅改變的制劑顯示出非常持久的人胰島素制品的特性。
本發(fā)明制劑可以通過下述方法來制備將鋅加到預(yù)先制得的超長(zhǎng)效胰島素晶體的懸浮液中，或者在實(shí)際的超長(zhǎng)效制劑制備操作的結(jié)晶步驟后另外加鋅。鋅可以固體形式來加，或者可以溶液形式來加?；蛘撸蓪⒊L(zhǎng)效晶體的懸浮液加到固體鋅或鋅溶液中。在本發(fā)明中，可以使用若干不同的鋅鹽。有代表性的鋅鹽的例子有乙酸鋅、溴化鋅、氯化鋅、氟化鋅、碘化鋅和硫酸鋅。技術(shù)人員應(yīng)該知道，還有許多其它的鋅鹽可以用于制備本發(fā)明的鋅改變的超長(zhǎng)效胰島素制劑。優(yōu)選使用乙酸鋅或氯化鋅以形成本發(fā)明鋅改變的超長(zhǎng)效胰島素制劑，因?yàn)檫@些鹽未給市售的超長(zhǎng)效制劑增添新的化學(xué)離子。
因此，本發(fā)明涉及在顯著增加人超長(zhǎng)效制劑的上清液中鋅的濃度時(shí)不明顯改變?cè)摮L(zhǎng)效晶體本身。人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，與未改變的人超長(zhǎng)效制劑相比，該富鋅超長(zhǎng)效制劑能延遲不溶的胰島素晶體的溶解速率并能延長(zhǎng)生物學(xué)作用時(shí)間。
由于若干原因，防止超長(zhǎng)效晶體被顯著改變可能是重要的。第一，超長(zhǎng)效制劑給糖尿病患者長(zhǎng)期施用40年了，而人超長(zhǎng)效制劑本身使用近10年。因此，用這些新的鋅改變的制劑可以進(jìn)行安全性的記錄，第二，顯著增加與胰島素晶體配位的鋅的濃度可能導(dǎo)致所述晶體聚集。一段時(shí)間后，這能在該制劑中成塊，使其不能使用。檢查本發(fā)明所述的鋅改變的人超長(zhǎng)效胰島素制劑顯示胰島素晶體無明顯改變或結(jié)塊。最后，鋅-胰島素晶體的改變能夠使該胰島素的結(jié)構(gòu)本身發(fā)生改變，這能夠改變其生物學(xué)性能乃至其致免疫性。
在制備這些改變的超長(zhǎng)效制劑時(shí)發(fā)生的pH隨之下降可能也是重要的。增加可溶鋅離子的濃度據(jù)認(rèn)為增加了胰島素A8(蘇氨酸)和A9(絲氨酸)殘基之間的化學(xué)裂解，即便是所述胰島素以不溶的晶體存在(Brange等人，PharmaceuticalResearch9，715-726(1992))。將胰島素制劑的pH稍微降至pH7以下能使所述裂解反應(yīng)減至最低程度，因此改善了長(zhǎng)期穩(wěn)定性。也可能是，所述pH降低可能是過量鋅與胰島素晶體最低限度相互作用的部分原因，這是因?yàn)?，蛋白質(zhì)與鋅的相互作用被認(rèn)為在較酸性的pH下會(huì)降低(Schlichtkrull，InsulinCrystals，EjnarMunksgaard出版，哥本哈根(1958))。
本發(fā)明所述新的鋅改變的人超長(zhǎng)效制劑還具有幾個(gè)特性。在初始的人超長(zhǎng)效制劑被制備以后很久產(chǎn)生了制劑方法。用該方法，根據(jù)所需的作用時(shí)間，甚至在藥房或診所就可以添加各種濃度的鋅以滿足個(gè)體病人的需要。還有，這些制劑無需新的賦形劑、配位劑、化學(xué)制品或有機(jī)溶劑，因此不用關(guān)心多年長(zhǎng)期使用新的化學(xué)個(gè)體的未知毒性。最后，終溶液的pH范圍，pH6.0-7.4，足以接近皮下組織的pH(pH7.4)，應(yīng)不產(chǎn)生刺激作用。
本發(fā)明提供適宜于經(jīng)皮下注射治療糖尿病的人超長(zhǎng)效晶體的制劑，這樣的注射能提供胰島素的緩慢吸收，如果需要，每天只需注射一次。該制劑還可以含有防腐劑例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯，等滲劑例如氯化鈉，鋅總含量為每100胰島素單位約0.5-20mg且pH在約6.0-7.4。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，許多其它的防腐劑和等滲劑適宜用于本發(fā)明中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鋅總濃度為每100胰島素單位約0.5-7mg，pH為約6.2-7.2。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是在適量的固體氯化鋅、固體乙酸鋅或這些試劑的濃水溶液被加到預(yù)配制的人超長(zhǎng)效溶液中時(shí)，結(jié)果形成所有鋅濃度的pH，即不再進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。
為比較其它文獻(xiàn)和專利文件中所述的鋅和胰島素濃度，表Ⅰ列出了在配合物中等價(jià)的鋅和胰島素，而表Ⅱ列出了溶液中等價(jià)的鋅。
表Ⅰ鋅/胰島素配合物mEq%μMμMmgμg(微克)Zn/g在無水胰島素Zn/μMZn/μMZn/100Zn/胰島素晶體中的Zn胰島素胰島素六聚體胰島素單位胰島素單位0.120.380.3320.0130.130.3110.905.40.0350.350.892.752.5115.10.112.6687.7546.50.334.4312.712.8770.556668.5192.511557.57517785.3514.2308620200表II溶液中的鋅mEqZn/l%ZnmgZn/mlmMZn/l0.3060.0010.010.1530.6120.0020.020.3061.530.0050.050.7653.060.010.11.536.120.020.23.0615.30.050.57.6530.60.1115.361.20.2230.61530.5576.5306110153612220306下列實(shí)施例用來說明本發(fā)明，但不應(yīng)誤解為是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1鋅改變的人超長(zhǎng)效制劑的制備使用濃度均為每ml100胰島素單位(U100)的Humulin超長(zhǎng)效制劑(HumulinUltralente)(Lilly，Indianapolis，IN)和超長(zhǎng)效(牛)胰島素延時(shí)胰島素鋅懸浮液USP[Ultralente(Beef)InsulinExtendedInsuinZincSuspensionUSP](NovoNordisk，Bagsvaerd，丹麥)。這些含鋅總濃度為約0.15mg/ml的制劑或者直接使用，或者用含0.05mg/ml鋅的超長(zhǎng)效胰島素(UltralenteInsulin)(Lilly)用無菌稀釋劑稀釋成胰島素濃度為U40。將預(yù)稱重的固體氯化鋅樣品(EMScience，CherryHill，NJ)直接加至超長(zhǎng)效胰島素的U100或U40溶液中，或者，將各種量的氯化鋅(100mg/ml水)或乙酸鋅(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ，200mg/ml水)的濃溶液(未調(diào)節(jié)pH)加至Humulin超長(zhǎng)效制劑的U100制劑中。鋅總濃度或者從計(jì)算的該胰島素中的鋅濃度、稀釋劑和試劑結(jié)合來估計(jì)，或者通過原子吸收光譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
實(shí)施例2鋅改變的人超長(zhǎng)效制劑的pH現(xiàn)通用的超長(zhǎng)效藥用制劑的pH為約pH7.4。鋅改變的超長(zhǎng)效制劑按實(shí)施例1中所述制備并測(cè)定其pH值。結(jié)果見下表Ⅲ。
表Ⅲα總計(jì)最終mg胰島素濃度加鋅的方法所用的鋅試劑Zn/mlmgZn/100最終樣品(U/ml)制劑U胰島素pH140無無0.090.237.38240固體氯化物0.250.637.30340固體氯化物0.591.487.03440固體氯化物1.092.736.80540固體氯化物2.406.006.75640固體氯化物7.3118.286.347100無無0.150.157.378100固體氯化物2.602.606.849100固體氯化物7.407.406.4110100固體氯化物12.2012.206.211197水溶液氯化物1.591.646.801294水溶液氯化物2.923.116.731393水溶液氯化物3.814.106.631491水溶液氯化物4.555.006.591583水溶液氯化物8.189.866.411691水溶液乙酸鹽5.606.156.751783水溶液乙酸鹽10.0912.166.51a估計(jì)值顯然，當(dāng)加入鋅試劑時(shí)，這些制劑的pH略有下降。與氯化鋅相比，用乙酸鋅制備的樣品顯示出pH下降較小。在本文所述的其它實(shí)施例中，除實(shí)施例3B外，對(duì)用該方法制備的溶液均未另外進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。
還發(fā)現(xiàn)，在加入這些鋅試劑后，將微量的氫氧化鈉溶液加到這些鋅強(qiáng)化的制劑中能夠?qū)H升高一點(diǎn)。然而通過加入大量的氫氧化鈉將該制劑調(diào)節(jié)至pH7.4會(huì)立即生成塊狀沉淀，估計(jì)可能是氫氧化鋅類的東西，這使得該制劑不能用于另外的目的。另一方面，在制備鋅強(qiáng)化的超長(zhǎng)效制劑后加入酸性溶液象鹽酸或乙酸以降低pH，不會(huì)造成任何沉淀，但對(duì)該上清液的HPLC分析表明在酸化過程中，少量、額外百分?jǐn)?shù)的超長(zhǎng)效晶體已溶解了。按實(shí)施例3B，在使胰島素的溶解降至最低或者消除時(shí)，用稀乙酸酸化處理最好。因此，由于可對(duì)這些鋅強(qiáng)化的超長(zhǎng)效懸浮劑進(jìn)行令人滿意的小幅度的pH調(diào)節(jié)，因此本發(fā)明不應(yīng)被限制在當(dāng)加入特定的鋅試劑時(shí)所形成的這個(gè)唯一的pH。
實(shí)施例3在鋅改變的人超長(zhǎng)效制劑中的鋅濃度A.按實(shí)施例2的樣品8制備3種鋅強(qiáng)化的人超長(zhǎng)效制劑。據(jù)估計(jì)，這三種懸浮劑的鋅總濃度均為每100胰島素單位0.7-2.5mg。將這三個(gè)懸浮劑的各1ml和未改變的Humulin超長(zhǎng)效胰島素制劑于25℃用手回蕩30分鐘，然后于5℃貯存20小時(shí)。然后將各懸浮液推過0.2微米Acrodisc 過濾器(Gelman Science，Ann Arbor，MI)。濾液用9ml 0.1N HCl稀釋。將留在該過濾器上的不溶的晶體用緩慢通過各過濾器的10ml 0.1N HCl再溶解。將在這些溶液中的鋅濃度用原子吸收測(cè)定并計(jì)算回到原制劑上清液或胰島素晶體中的鋅含量。由這些試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)列在表Ⅳ中。
表Ⅳmg/mlmg/ml樣品結(jié)合的鋅游離的鋅上清液中總鋅的百分?jǐn)?shù)10.120.0736.8%20.190.6376.8%30.181.3087.8%40.202.6092.9%
該試驗(yàn)表明，所加鋅多余部分的大多數(shù)留在了上清液中，且既未與胰島素晶體配合，亦未與其以共價(jià)鍵結(jié)合，B.按實(shí)施例2的樣品8制備含約2.5mg/ml鋅的制劑20ml。將該懸浮液(pH6.81)的一半留下來不調(diào)pH，而將另一半通過加入少量的稀乙酸調(diào)節(jié)pH至6.15。將該懸浮液于5℃貯存。如上所述，在不同的時(shí)間測(cè)定上清液和不溶的晶體中的鋅濃度。由這些試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)列在下表Ⅴ中。
表Ⅴmg/mlmg/ml天數(shù)(在5℃)結(jié)合的鋅游離的鋅上清液中總鋅的百分?jǐn)?shù)00.272.1889.0%20.262.7591.4%40.372.1485.3%樣品70.392.5086.5%在pH6.81100.352.5087.7%150.422.2584.3%210.362.7588.4%280.353.2590.3%00.292.1488.1%20.282.1888.6%40.252.1289.4%樣品70.402.5086.2%在pH6.15100.303.0090.9%150.332.5088.3%210.352.5087.7%280.332.7589.3%
該試驗(yàn)表明，用稀乙酸調(diào)節(jié)pH不改變鋅在上清液和不溶的胰島素晶體之間的分布。還表明，在貯存期間，鋅分布無明顯改變。在這兩個(gè)制劑中，大部分鋅均留在了上清液部分中。
實(shí)施例4鋅改變的人超長(zhǎng)效制劑的穩(wěn)定性。
A.將按實(shí)施例2所述制備的各種鋅強(qiáng)化的人超長(zhǎng)效制劑在43X放大倍數(shù)下進(jìn)行顯微鏡檢查。所有的懸浮劑均顯示出典型的在未改變的制劑中所發(fā)現(xiàn)的菱形超長(zhǎng)效晶體。在鋅改變的懸浮劑中的晶體的大小、形狀和完整性實(shí)際上與未改變的懸浮劑的不能區(qū)別。未檢測(cè)到在這些制劑中存在顯著量的外來的、不溶的非晶體顆粒。
該制劑還顯示出與未改變的超長(zhǎng)效制劑相同的回蕩形式?；厥幒螅摻Y(jié)晶性懸浮劑還顯示出在晶體達(dá)到完全沉淀的時(shí)間和晶體的近似堆積體積兩方面均與未改變的超長(zhǎng)效制劑相同的沉降特征。
B.制備含約7.5mg/ml鋅的人超長(zhǎng)效胰島素的鋅強(qiáng)化的制劑(與實(shí)施例2的樣品9類似)。用未改變的超長(zhǎng)效制劑(實(shí)施例2的樣品7)作對(duì)照。將這兩個(gè)樣品均在5℃貯存約1年。這時(shí)，將該胰島素晶體再溶于稀鹽酸并用反相高效液相層析(HPLC)系統(tǒng)評(píng)價(jià)其純度。在40℃的條件下使用含有150?？讖筋w粒的4.6×250mmZorbaxC-8柱。在含約pH2的0.225M硫酸銨的乙腈的梯度洗脫中，在流速為0.7ml/分鐘時(shí)洗脫出胰島素。
1年后，未改變的超長(zhǎng)效胰島素的純度為96.4%，有幾個(gè)未鑒定峰，各在0.2%范圍內(nèi)，A21-脫酰胺胰島素峰為約1%。含7.5mg/ml鋅的超長(zhǎng)效制劑1年后顯示出胰島素總純度為96.8%，有幾個(gè)未鑒定峰在0.1-0.2%范圍內(nèi)；A21-脫酰胺胰島素峰為約1%。一個(gè)新的在胰島素之前洗脫出的未知峰為0.3%，該峰在未改變的超長(zhǎng)效樣品中未見到。
這些試驗(yàn)表明，鋅改變的制劑在超長(zhǎng)效晶體的大小和形狀方面保持其穩(wěn)定性。還有，在5℃貯存一年后，在該超長(zhǎng)效制劑中高濃度的鋅不顯著改變胰島素分子的化學(xué)純度。
實(shí)施例5復(fù)合溶解測(cè)定這個(gè)測(cè)定法是Graham和Pomeroy較早發(fā)表在J.Pharmacol.36，427-430(1983)上的測(cè)定法的改進(jìn)方法，這里引入該文獻(xiàn)方法作參考。它利用胰島素晶體在用非結(jié)合鋅的緩沖劑顯著稀釋后的溶解速率作為預(yù)測(cè)該結(jié)晶性制劑在皮下注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后的溶解速率的方法。這是因?yàn)閷?duì)于胰島素懸浮劑而言，產(chǎn)生生物學(xué)響應(yīng)的限速步驟主要是注射后不溶的胰島素的溶解速率。因此可以預(yù)計(jì)，與人超長(zhǎng)效制劑相比在該測(cè)定中溶解更慢的胰島素制劑在生物模型中作用同樣會(huì)更慢。
按與實(shí)施例2中樣品8相類似的方法制備3種含0.35、0.7和2.5mg/ml鋅的鋅強(qiáng)化的人超長(zhǎng)效制劑。將這些懸浮液的0.5ml部分和未改變的U100人和牛超長(zhǎng)效制劑的0.5ml部分各加至在80ml玻璃杯中于25℃攪拌著的50ml 0.1M Tris(三羥甲基氨基甲烷，Mallinckrodt，巴黎，KY)pH7.5緩沖劑中。在3小時(shí)和8小時(shí)時(shí)，將攪拌的懸浮液等分試樣移出并使其通過0.2微米Acrodisc 過濾器。濾液中胰島素的量用反相HPLC定量測(cè)定。胰島素最大含量通過未過濾的酸化的等分試樣的HPLC來測(cè)定。在溶解測(cè)定的開始基本沒有溶解的胰島素。由這些試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)列在下表Ⅵ中。
表Ⅵmg/ml溶解胰島素的最大百分?jǐn)?shù)溶解胰島素的最大百分?jǐn)?shù)超長(zhǎng)效制劑種類估計(jì)的鋅濃度(3小時(shí))(8小時(shí))人0.1516.3%44.7%人0.354.5%10.7%人0.702.4%6.3%人2.501.1%3.2%牛0.153.2%6.2%該試驗(yàn)表明，未改變的人超長(zhǎng)效制劑比未改變的牛超長(zhǎng)效制劑再溶解快得多。還表明，將鋅加至人超長(zhǎng)制劑中達(dá)到每100胰島素單位0.7mg的水平時(shí)使該胰島素晶體以與未改變的牛超長(zhǎng)效制劑大約相同的速率溶解。給人超長(zhǎng)效制劑加鋅至每100胰島素單位約2.5mg的水平時(shí)，可使其得到比未改變的牛超長(zhǎng)效胰島素甚至更慢的溶解速率。
實(shí)施例6連續(xù)流動(dòng)溶解測(cè)定這個(gè)測(cè)定法是較早由Brange在GalenicsofInsulin，第46頁，Springer-Verlag，柏林(1987)和Graham和Pomeroy在J.Pharm.Pharmacol.36，427-430(1983)中所報(bào)道的流通試驗(yàn)的改進(jìn)方法，這里引入這兩篇文獻(xiàn)方法作為參考。將未改變的人和牛超長(zhǎng)效胰島素和每100胰島素單位含約0.7mg鋅的人超長(zhǎng)效制劑樣品(如實(shí)施例5所述)的2ml等分試樣各用48ml0.1MTrispH7.5緩沖劑溶解。使各自的全部50ml懸浮液立即通過0.2微米Acrodisc 過濾器并用5ml水洗滌。然后將各過濾器放置于FPLC系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，NJ)的洗脫液管線上。將新鮮的0.1M Tris pH7.5緩沖劑以每分鐘2ml的流速泵過各過濾器。在洗脫胰島素的2個(gè)多小時(shí)中，在214nm波長(zhǎng)處連續(xù)光譜監(jiān)測(cè)通過所述過濾器的洗脫液的吸收。洗脫液的各部分還用反相HPLC檢測(cè)以確定人或牛胰島素的存在。
牛超長(zhǎng)效晶體中的胰島素僅非常緩慢地溶于該新鮮的Tris緩沖劑中。牛胰島素的洗脫通過HPLC分析洗脫液部分來確定。在未改變的人超長(zhǎng)效晶體中的胰島素顯示快的溶解速率，在約35分鐘時(shí)出峰，并且在整個(gè)試驗(yàn)中保持比較強(qiáng)的溶解。含0.7mg/ml鋅的人超長(zhǎng)效制劑顯示出與未改變的人超長(zhǎng)效制劑樣品非常相似的響應(yīng)，但與該牛制劑不同。這表明，在該測(cè)定中先期的過濾步驟從該制劑中除去了所有未結(jié)合的鋅，留下的晶體的表現(xiàn)恰同未改變的人超長(zhǎng)效晶體一樣。該數(shù)據(jù)也顯著地表明了人和牛胰島素晶體的溶解速率的固有差異。由這些試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)列在下表Ⅶ中。
表Ⅶ相對(duì)吸收人超長(zhǎng)效制劑時(shí)間(分鐘)牛超長(zhǎng)效制劑人超長(zhǎng)效制劑0.7mg/mlZn00002.512.53.512.559.08.011.5108.023.019.0157.838.031.7207.952.045.0258.059.060.0307.463.072.0358.164.079.5408.061.079.0458.357.573.0507.852.068.0558.245.560.0608.540.052.2658.536.045.5708.831.539.5759.029.536.3809.726.025.0909.623.022.110010.420.222.111011.018.524.312011.216.624.013012.015.121.6
實(shí)施例7超長(zhǎng)效制劑的兔檢定將按實(shí)施例2樣品1-6中所示制備的牛超長(zhǎng)效(U40)和U40人超長(zhǎng)效制劑在普通兔模型上試驗(yàn)。用在本實(shí)施例中的兔子是新西蘭白兔(NewZealandWhites)，多為雌性，均重2.7-4kg，0.5-4歲，在給樣品前禁食16小時(shí)。將該胰島素懸浮液各以每公斤0.2單位的劑量給10只兔子在頸后皮下注射。在不同的時(shí)間從邊緣耳靜脈取100μl體積的血，將其與900μl體積的抗凝劑(氟化EDTA-鈉)混合并對(duì)葡萄糖含量進(jìn)行分析。將葡萄糖值標(biāo)準(zhǔn)化，以反映在注射樣品前測(cè)定的原血液葡萄糖的百分?jǐn)?shù)。由這些試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)列在表Ⅷ中。
表Ⅷmg/ml%原血液葡萄糖注射后小時(shí)數(shù)樣品超長(zhǎng)效制劑種類估計(jì)的鋅濃度12341人0.0960.665.289.090.42人0.2556.767.891.491.43人0.5960.458.978.185.54人1.0781.878.695.295.65人2.4092.880.980.388.66人7.3196.084.180.985.97牛0.1560.168.796.795.7在該兔模型中，作用時(shí)間曲線比在人中的短得多。該作用時(shí)間壓縮導(dǎo)致該模型無法顯示未改變的人和牛超長(zhǎng)效制劑之間的明顯差別(樣品1與樣品7)。盡管有這項(xiàng)限制，該試驗(yàn)還是顯示出在將足夠量的鋅加到人超長(zhǎng)效胰島素制劑中時(shí)，人超長(zhǎng)效胰島素的生物作用被顯著改變。如樣品4-6中所示，強(qiáng)生物響應(yīng)的開始被延遲超過1小時(shí)，最低在2-4小時(shí)之間。血液葡萄糖中的最大下降也被消除，從樣品1-3中的約40%(1小時(shí)最低點(diǎn))降到樣品4-6中的僅約20%(2-4小時(shí)最低點(diǎn))。因此，含有足夠鋅的制劑清楚地顯示出比未改變的人或牛超長(zhǎng)效制劑慢得多的延長(zhǎng)了的作用時(shí)間。
權(quán)利要求
1.人胰島素制劑，它包含超長(zhǎng)效胰島素晶體的懸浮液，在該制劑中，鋅總濃度在每100胰島素單位約0.5-20毫克之間。
2.權(quán)利要求1的胰島素制劑，其中，該制劑還包含防腐劑。
3.權(quán)利要求2的胰島素制劑，其中，該制劑還包含等滲劑。
4.權(quán)利要求3的胰島素制劑，其中，該制劑還包含緩沖劑。
5.權(quán)利要求4的胰島素制劑，其中，該制劑包括總制劑鋅濃度在每100胰島素單位約0.5-7毫克之間。
6.制備如權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項(xiàng)所述的胰島素制劑的方法，它包括將鋅與超長(zhǎng)效胰島素晶體混合。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所用的鋅是選自下列的鋅鹽乙酸鋅、溴化鋅、氯化鋅、碘化鋅、氟化鋅和硫酸鋅。
8.如權(quán)利要求1至5中任一權(quán)項(xiàng)所述的藥用制劑，它用于經(jīng)皮下注射治療病人的糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及胰島素制劑，它包含超長(zhǎng)效晶體的懸浮液且總制劑鋅濃度在每100胰島素單位約0.5—20毫克，在該制劑中的總鋅的50％以上留在可溶部分中，而不是與胰島素配合。該胰島素制劑的pH一般在pH6.0—7.4之間。此外，本發(fā)明胰島素制劑不含象魚精蛋白這類的其它蛋白質(zhì)。該鋅改變的制劑顯示出非常持久的人胰島素制品的特性。
文檔編號(hào)A61K38/28GK1109364SQ9410908
公開日1995年10月4日 申請(qǐng)日期1994年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月13日
發(fā)明者J·A·霍夫曼 申請(qǐng)人:伊萊利利公司