專利名稱：生物制菌王及其生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種防治動物細菌病和促進動物新陳代謝的生物制劑及其生產(chǎn)方法，屬于生物制品及其制造領域。
目前國內外動物細菌病的防治藥品，主要有抗生素類的化學合成藥物。此類藥物的使用，會使動物體內不斷產(chǎn)生抗藥菌株，有效藥量逐漸增大，抑制動物的正常生長，且藥物在動物體內的殘留，會殃及人體健康。因此，研制開發(fā)高效無毒的生物防治動物細菌病的方法和制品引起人們極大興趣和關注，各類生態(tài)制劑的研究正在掘起，以菌制菌的生物防治方法倍受重視。
噬菌蛭弧菌自60年代發(fā)現(xiàn)起，它對許多種動植物致病菌的“寄生”和“裂解”的獨特的生物學特性就引起了人們的高度重視。但長期以來，人們一直認為噬菌蛭弧菌的生長溫度為25—30℃，在40℃以上就不能生長繁殖，且只能在活菌上生長。而動物體(除人體)內的正常溫度一般為40℃左右，噬菌蛭弧菌對溫度特別敏感，25—30℃環(huán)境中培養(yǎng)的噬菌蛭弧菌在動物體內易失活；又在活菌上培養(yǎng)噬菌蛭弧菌的生產(chǎn)過程中，活菌易污染環(huán)境，且培養(yǎng)周期長(48—72小時)，收獲量低(＜106pfu/ml)，培養(yǎng)物殘留活菌對動物體有害。因此，人們利用噬菌蛭弧菌防治動物細菌病的開發(fā)和應用受到了極大限制。
本發(fā)明的目的在于提供一種以噬菌蛭弧菌培養(yǎng)物為主要成分，用于防治動物細菌病和促進動物新陳代謝的生物制劑——生物制菌王及其生產(chǎn)方法。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術解決方案是用常規(guī)方法制取宿主菌懸液，并用滅菌蒸餾水離心洗滌三次以上；然后，加入滅菌蒸餾水配制成含菌量在20億/ml以上的菌懸液；再在70—150℃下，加熱15分鐘以上，或者用1/5—1/10量(體積)氯仿作用1小時以上，制得失活宿主菌；然后以此失活宿主菌為宿主，用噬菌蛭弧菌常規(guī)培養(yǎng)法制取其培養(yǎng)物，再選擇于25—30℃環(huán)境中在自來水雙層瓊脂平皿上噬斑典型的噬菌蛭弧菌，挑取單噬斑浸泡于滅菌自來水中4—6小時，然后，取上清再制雙層瓊脂平皿，調高溫度3—5℃培養(yǎng)，并反復數(shù)次，直至選育出在37—43℃環(huán)境中能生長的噬菌蛭弧菌；最后將上述過程中制得的失活宿主菌和選育出的噬菌蛭弧菌按比例1∶10—1∶10萬懸浮在含有微量元素Ca(1.0—10.0mg/l)、Mg(2.0—11.0mg/l)、Zn(2.0—15.0mg/l)、Fe(0.1—1.5mg/l)的稀釋液中，在37—43℃溫度條件下培育10—24小時，校正其pH值在3.0—9.8范圍內，即得到本發(fā)明所要提供的用于防治動物細菌病和促進動物新陳代謝的生物制菌王。
本發(fā)明所提供的生物制菌王對傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌、嗜水氣單胞菌的清除率均在92.74％以上。經(jīng)南京農業(yè)大學測試，生物制菌王用于預防雛雞白痢的保護率為88.3％，對仔雞增重率為8.23—15.66％；經(jīng)天津農學院測試，其用于治療仔豬腸道細菌病的效果與抗生素基本相同。
本發(fā)明公開的生產(chǎn)生物制菌王的方法，避免了在活菌上培養(yǎng)噬菌蛭弧菌所造成的環(huán)境污染，且培養(yǎng)周期短、產(chǎn)量高；特別是使得噬菌蛭弧菌對動植物致病菌的“寄生”和“裂解”的獨特的生物學特性應用于動物細菌病的防治成為現(xiàn)實。
下面結合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明首先，用常規(guī)方法獲取對噬菌蛭弧菌敏感的、不產(chǎn)毒素的、非致病菌為宿主菌，再用加熱或氯仿致死的方法使宿主菌失活。具體做法是向菌種保藏機構索取或從環(huán)境中分離得到大腸桿菌，將其在營養(yǎng)瓊脂平皿上劃線分離，在37℃培養(yǎng)18小時，用相應的血清凝集，取凝集反應陽性的單菌落，接種到營養(yǎng)肉湯中，在37℃培養(yǎng)4—6小時，然后，轉種瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)18—20小時，用滅菌蒸餾水洗脫菌苔，并離心沉淀洗滌三次以上，去除培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，再加人滅菌蒸餾水配制成含菌量在20億/ml以上的菌懸液，然后在70—150℃溫度條件下加熱至少15分鐘滅菌，或者用1/5—1/10量(體積)氯仿作用1小時以上，即得到失活的大腸桿菌。
其次，以上述失活的大腸桿菌為宿主，用噬菌蛭弧菌常規(guī)培養(yǎng)法制取其培養(yǎng)物后，再對其進行耐37—43℃的訓化。具體做法是從菌種保藏機構索取或從環(huán)境中分離得到噬菌蛭弧菌，并將其和失活的大腸桿菌加入4ml、46℃的0.7％上層瓊脂中混合，然后倒在自來水雙層瓊脂平皿上，使其凝固一層；接著，于25—30℃環(huán)境中培養(yǎng)48—72小時，選取噬斑典型的噬菌蛭弧菌，挑取單噬斑浸泡于滅菌自來水中4—6小時；然后，取上清再制雙層瓊脂平皿，調高溫度3—5℃培養(yǎng)，并反復數(shù)次，直至選育出在37—43℃環(huán)境中能生長的噬菌蛭弧菌。
最后，將失活的大腸桿菌和噬菌蛭弧菌按比例1∶103——1∶104懸浮在含有微量元素Ca、Mg、Zn、Fe分別為3.0mg/l、3.5mg/l、3.2mg/l和0.25mg/l的稀釋液中，37—43℃培育10—24小時，校正其pH值為7.4，即得到生物制菌王。
權利要求
1.一種用于防治動物細菌病和促進動物新陳代謝的生物制劑——生物制菌王，其主要成份為噬菌蛭弧菌、宿主菌以及微量元素Ca、Mg、Zn、Fe，其中噬菌蛭弧菌與宿主菌的比例為1；10——1；10萬；微量元素含量分別為Ca＝1.0—10.0mg/l，Mg＝2.0—11.0mg/l，Zn＝2.0—15mg/l，F(xiàn)e＝0.1—1.5mg/l；pH值為3.0—9.8。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物制菌王，其特征在于噬菌蛭弧菌與宿主菌的比例為1∶103—1∶104；Ca含量為3.0mg/l，Mg含量為3.5mg/l，Zn含量為3.2mg/l，F(xiàn)e含量為0.25mg/l；pH值為7.4。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的生物制菌王，其特征在于宿主菌為對噬菌蛭弧菌敏感的、不產(chǎn)毒素的、非致病的失活菌體。
4.根據(jù)權利要求3所述的生物制菌王，其特征在于宿主菌為大腸桿菌。
5.根據(jù)權利要求3所述的生物制菌王，其特征在于噬菌蛭弧菌能在失活的宿主菌上，于37—43℃環(huán)境中生長增殖。
6.一種生產(chǎn)權利要求1的生物制菌王的方法，包括以下工藝步驟(1)用常規(guī)方法制取宿主菌懸液并用滅菌蒸餾水離心洗滌三次以上；然后，(2)加入滅菌蒸餾水配制成含菌量在20億/ml以上的菌懸液；然后，(3)在70—150℃下，加熱至少15分鐘，或者用1/5—1/10量(體積)氯仿作用1小時以上，制得失活宿主菌；(4)以步驟(1)—(3)制得的失活宿主菌為宿主，用噬菌蛭弧菌常規(guī)培養(yǎng)法制取其培養(yǎng)物；然后，(5)選擇于25—30℃環(huán)境中在自來水雙層瓊脂平皿上噬斑典型的噬菌蛭弧菌挑取單噬斑浸泡于滅菌自來水中4—6小時；然后，(6)取上清再制雙層瓊脂平皿，調高溫度3—5℃培養(yǎng)，反復數(shù)次，直至選育出在37—43℃環(huán)境中能生長的噬菌蛭弧菌；(7)將通過步驟(1)—(3)制得的失活宿主菌和通過步驟(4)—(6)制得的噬菌蛭弧菌按比例1∶10—1∶10萬懸浮在含有微量元素Ca(1.0—10.0mg/l)、Mg(2.0—11.0mg/l)、Zn(2.0—15mg/l)、Fe(0.1—1.5mg/l)的稀釋液中，37—43C培育10—24小時，校正其pH值在3.0—9.8范圍內，即得生物制菌王。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于防治動物細菌病和促進動物新陳代謝的生物制劑——生物制菌王及其生產(chǎn)方法，屬于生物制品及其制造領域。本發(fā)明采用加熱或氯仿作用的方法得失活宿主菌于37-43℃環(huán)境中培養(yǎng)噬菌蛭弧菌，并將噬菌蛭弧菌培養(yǎng)物與失活宿主菌按比例懸浮在含有微量元素Ca、Mg、Zn、Fe的稀釋液中，在37-43℃環(huán)境中培育一定時間，校正其pH值在3.0-9.8范圍內，即得到生物制菌王。
文檔編號A61P31/02GK1116932SQ94111370
公開日1996年2月21日 申請日期1994年6月28日 優(yōu)先權日1993年9月22日
發(fā)明者秦生巨 申請人:秦生巨