專利名稱：促腦康的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種神經(jīng)生長刺激肽(NTPS)，臨床應(yīng)用于腦外傷或腦類后遺癥及各種精神、神經(jīng)疾病的治療。
在本領(lǐng)域，具有刺激神經(jīng)元突起生長和支持存活作用的生物因子主要分兩大類1、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTPS)，這些因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和支持存活的作用，包括神經(jīng)生長因子(NGF)及其基因家庭成員腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營養(yǎng)素III(Neurotrophin3)以及睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)等[1]，2、神經(jīng)突起生長因子(NTPS)，它們主要能促進(jìn)神經(jīng)元的突起形成和生長上述因子中，NGF、BDNF、NT-3和CNTF的分子結(jié)構(gòu)，氨基酸序列目前均已清楚。NGF和BDNF已有基因工程產(chǎn)品上市，并已取得初步的臨床效果[2、3]，但因價(jià)格昂貴而難以臨床推廣應(yīng)用。腦活素，是奧地利依比威大藥廠從成年豬腦組織中制備的腦蛋白水解液，主要成分是一系列小分子多肽和氨基酸，對(duì)神經(jīng)元具有一定的營養(yǎng)作用，現(xiàn)已用于治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[4、5]。國內(nèi)也有與腦活素相似的同類產(chǎn)品問世。以上產(chǎn)品均從成年豬腦中來源，而從健康幼年哺乳類動(dòng)物腦中制備NTPS活性物質(zhì)，目前尚未見。
本發(fā)明的目的在于提供一種從健康幼年哺乳類動(dòng)物的腦中提取具有較高生物活性的神經(jīng)生長刺激肽(NTPS)，供臨床上用于治療腦外傷、腦炎后遺癥及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病可以是口服液和肌肉注射，或與其它藥物配伍靜脈滴入。
本發(fā)明是一種穩(wěn)定的神經(jīng)生長刺激肽(NTPS)。具有如下特征(1)在PH2-10范圍內(nèi)穩(wěn)定；(2)耐熱75-80℃，30min，活性不改變；加熱100℃，15min后活性喪失；(3)在多種蛋白水解酶，37℃，2小時(shí)條件下生物活性喪失；(4)在DNAse，RNAse，37℃，2小時(shí)條件下，生物活性喪失；(5)在加入3-8％甘露醇凍干密封條件下，室溫貯存1年，4℃貯存2年，-20℃貯存3年，生物活性不改變；(6)用HPLC分析，主要由3個(gè)組份組成。各峰面積及保留時(shí)間分別為36.274％、2.65分，12.548％、3.90分，42.316％、4.56分；(7)經(jīng)SDS-PDGE分析；顯示兩條主要色帶、分子量別為9600，8860Da；(8)經(jīng)紫外光譜掃描分析；在波長250.6±2nm和230.5±2nm處有兩個(gè)吸收峰。
附

圖1為本發(fā)明的NTPS的紫外光譜掃描分析圖譜；附圖2為本發(fā)明的NTPS的HPLC的圖譜；實(shí)例一可用下述方法表現(xiàn)本發(fā)明藥物生物活性，取SD胚胎鼠(16-20)天，無菌分離胎鼠大腦皮層，胰酶分離神經(jīng)細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基洗滌3次后，用含10％小牛血清的DME/F12培養(yǎng)基接種于Costar 96孔(3596)培養(yǎng)板內(nèi)，每孔150ul；37℃，5％CO2條件下24小時(shí)。用含5％血清的DME/F12培養(yǎng)基(內(nèi)加阿糖胞苷2×10-5M用于抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的生長)換液后，實(shí)驗(yàn)孔分別加入不同稀釋度的NTPS，使最終濃度分別為5，10，20，40ug/ml，對(duì)照孔僅加DME/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)68小時(shí)，每孔加入5ulMTT(1.5mg/ml)，DME培養(yǎng)基配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，每孔加入二甲基亞砜100ul終止反應(yīng)，置酶標(biāo)儀570nm條件下測OD值，測定結(jié)果如下。
NTPS對(duì)神經(jīng)元脫氫酶活力的影響n CD值P對(duì)照組4 0.15±0.03NTPS組(ug)5 4 0.21±0.03 ＜0.05104 0.23±0.03 ＜0.01204 0.30±0.05 ＜0.01404 0.30±0.01 ＜0.01實(shí)例二從幼年動(dòng)物制備NTPS[Y]與成年動(dòng)物同等條件下制備的NTPS[A]比較，NTPS[Y]活性較高，活性測定方法參見上例每毫克NTPS[Y]含活性單位為50iu，而每毫克NTPS[A]僅為12.5iu。
下面是本發(fā)明的NTPS的HPLC的數(shù)據(jù)SAMPLEMETHODMeoh∶Water＝10∶90 Flow0.8TYPEAREA PERCENT RUN NUMBER2INDEX1WAVELENTH254nmPEAK# AREA％ RT AREA BC1 2.277 0.87 811092 022 1.325 2.01 471730 023 *36.2742.65 12918549 0814 0.152 3.06 54295 055 0.078 3.31 27592 06 8 0.068 4.33 24220 069 *42.3164.56 15070735 08310 3.227 6.63 11491290511 0.283 7.89 100819 0612 1.452 8.74 517069 07TOTAL 100.00 35614071本發(fā)明藥物的藥理作用實(shí)現(xiàn)如下三月齡SD大鼠16只，體重300g，1％戊巴比妥鈉麻醉后固定于腦立體定位儀上，環(huán)形鉆開顱，用自制雙刃刀在右側(cè)頂皮質(zhì)切一寬2mm，深2.5mm的冠狀切口，切口坐標(biāo)是前囪后3mm，旁中線1.5mm。其中8只經(jīng)腹腔注射神經(jīng)營養(yǎng)因子0.5ml(廣州空軍醫(yī)院科研室研制)每天一次，對(duì)照組注射生理鹽水0.5ml，存活3周后經(jīng)心臟主動(dòng)脈插管，生理鹽水和4％多聚甲醛連續(xù)灌注、固定。取腦置于25％蔗糖磷酸緩沖液(0.1mol/l)中保存15-20小時(shí)。冰凍切片機(jī)作連續(xù)失狀切片，片厚40um，切片分兩套，一套作尼氏染色，一套按Hedreen薦的方法顯示AChE陽性纖維，具體步驟是(1)0.1mol/L醋酸緩沖液(pH5.8)洗2次；(2)室溫下孵育30分鐘(孵育液含碘化乙酰硫膽鹼12.5)；(3)0.1ml/L醋酸沖液(pH5.8)洗5次；(4)1％硫化銨處理1分鐘，醋酸緩沖液洗5次；(5)0.1％硝酸銀染色1分鐘，0.1％mol/L醋酸緩沖液1洗5次。裱片，晾干常規(guī)脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察和照相。用標(biāo)準(zhǔn)目鏡方格測試系統(tǒng)(10×10)在40倍物鏡下計(jì)數(shù)切口嘴側(cè)、尾側(cè)以及對(duì)照鼠相應(yīng)區(qū)域的皮質(zhì)、IV、V層內(nèi)AChE陽性纖維的密度。以AChE陽性纖維與測式線的交點(diǎn)數(shù)(N)表示纖維的密度(N/10000um2)。每只動(dòng)物取切口中1/3的5張切片進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷后三周時(shí)對(duì)照組切口兩緣基本對(duì)合，但不整齊，切口區(qū)可見明顯的疤痕組織形成，切口嘴側(cè)纖維增多，一些細(xì)的纖維向切口區(qū)靠近，切口尾側(cè)區(qū)纖維較嘴側(cè)稀少。神經(jīng)營養(yǎng)因子處理組，損傷后三周時(shí)皮質(zhì)切口已全部對(duì)合，較對(duì)照組對(duì)合整齊。切口區(qū)內(nèi)疤痕組織很少，形成一條窄細(xì)的線幾乎不能辨認(rèn)，嘴側(cè)區(qū)AChE陽性纖維大量增生，逼進(jìn)切口區(qū)形成一密集的纖維帶，并見少數(shù)纖維跨過切口區(qū)進(jìn)入尾側(cè)但這些穿過切口的纖維走行迂曲，不能做長距離的跟蹤，尾側(cè)區(qū)纖維比嘴側(cè)區(qū)稀少。纖維網(wǎng)格計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，神經(jīng)營養(yǎng)因子注射組無論是切口嘴側(cè)還是切口尾側(cè)皮質(zhì)內(nèi)的AChE陽性纖維的密度均較對(duì)照組明顯增多，見下表皮質(zhì)損傷后三周AChE陽性纖維密度對(duì)照組 NTPS組切口嘴側(cè) 第IV層 193.04±10.21 217.34±14.37**第V層 174.23±9.48195.06±11.26**切口尾側(cè) 第IV層 134.81±9.27178.26±12.74**第V層 127.05±9.43151.34±10.89*表中數(shù)據(jù)為AChE陽性纖維與測試線交點(diǎn)數(shù)(N/10000um2)×±SD，n＝8；* 表示與對(duì)照組比較差異有顯著意義；**差異有高度顯著意義。
本發(fā)明藥物選取健康幼年哺乳類動(dòng)物如乳豬、新生小牛及新生羊的腦。
本發(fā)明藥物在臨床上可用于治療腦外傷或腦炎后遺癥、老年性癡呆、腦血管意外、少兒智力發(fā)育不良、神經(jīng)衰弱以及各種精神、神經(jīng)疾病的輔助治療。
本發(fā)明藥物可在臨床單獨(dú)使用，也可與其它中西藥單方或復(fù)方合用。
本發(fā)明藥物可制成一種保健食品——神腦口服液。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥--促腦康，神經(jīng)生長刺激肽(NTPS)是從健康幼年哺乳類動(dòng)物腦中制備提取，其特征是(1)、在PH2-10范圍內(nèi)穩(wěn)定；(2)、耐熱75-80℃，30min，活性不改變；加熱100℃，15min后活性喪失；(3)、在多種蛋白水解酶，37℃，2小時(shí)條件下生物活性喪失；(4)、在DNAse，RNAse，37℃，2小時(shí)條件下，生物活性不喪失；(5)、在加入3-8％甘露醇凍干密封條件下，室溫貯存1年，4℃貯存2年，-20℃貯存3年，生物活性不改變；(6)、用HPLC分析，主要由3個(gè)組份組成。各峰面積及保留時(shí)間分別為36.274％、2.65分，12.548％、3.90分，42.316％、4.56分；(7)、經(jīng)SDS-PDGE分析顯示兩條主要色帶，分子量分別為9600，8860Da；(8)、經(jīng)紫外光譜掃描分析在波長250.6±2nM和230.5±2nM處有兩個(gè)吸收峰。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種神經(jīng)生長刺激肽(NTPs)，它是一種從健康幼年哺乳類動(dòng)物的腦中提取具有較高生物活性的神經(jīng)生長刺激肽(NTPs)，分子量小于1萬和/或5萬道爾頓，臨床應(yīng)用于腦外傷或腦類后遺癥及各種精神、神經(jīng)疾病的治療；可以是口服液和肌肉注射，或與其它藥物配伍靜脈滴入。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1120456SQ9411632
公開日1996年4月17日 申請(qǐng)日期1994年10月10日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月10日
發(fā)明者孔祥平 申請(qǐng)人:中國人民解放軍空軍廣州醫(yī)院