專利名稱：新的抗化學化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的有用化合物，其用途和制備方法。更具體地講，本發(fā)明涉及具有抗化學活性的新化合物和其制備方法，及含有它們作為活性成分的組合物。
生命機體具有排泄異生素(Xenobiotics)的功能，使其失活或降低其親脂性，轉化成親水性物質。這些功能通過各種酶的調節(jié)來進行，并根據酶的種類分為兩類I相反應(氧化、還原和水解等)和II相反應(結合)。有時，這些功能的發(fā)揮可產生不利影響，形成更易反應的化合物，對細胞中的大分子造成損害，這樣誘使癌的形成。
特別是，存在于肝細胞和其它細胞的滑面內質網中的細胞色素P—450(CYP450)為I相反應中涉及的一種氧化酶。細胞色素P—450氧化生命體內合成的甾體、脂肪酸和胺，以及代謝藥物、化學致癌物和致突變物，使其成為更親水的可排泄物質。但細胞色素P—450有時活性化異生素，它損害大分子，從而誘異癌的形成(Black，S.D.，Coon，M.J.，P—450細胞色素結構和功能，Adv.Enzymol.，6035—87(1987))。根據堿基序列的相似性，細胞色素P—450可分成不同基因系和亞系。在眾多形式的P—450中，細胞色素P—4502E1對廣譜的外源性物質具有很高的底物特異性，并通過活化它們，增加這些外源性物質的毒性。
例如，治療有效量的醋氨酚在長期酗酒者中產生肝毒性，因為細胞色素P—4502E1以高底物特異性活化醋氨酚，活化的醋氨酚攻擊大分子如蛋白質，產生肝壞死(Wrighton，S.A.，Thomas，P.E.，Molowa，D.T.，Haniu，M，Guzelian P.S.，乙醇可誘導的人肝N—亞硝基二甲胺脫甲基化酶的特征，Biochemistry，25；6731—6735(1986))。
對于引起肝壞死的四氯化碳的代謝，據報導反應性代謝物水平的提高與細胞色素P—4502E1的表達增加密切相關(Ansher，S.S；Dolan，P.，Bueding E.，兩種二巰基硫酮和丁基羥基茴香醚對四氯化碳和醋氨酚毒性的抗化學效果，Hepatoloty，3；932—935(1983))。與致癌劑前體亞硝胺的高親和力也在活化異生素中起重要作用(Peng，R.，Yang，C.S.，乙醇對高親和力微粒體亞硝基二甲胺脫甲基化酶的誘導和競爭性抑制，Carcinogenesis，3；1457—1461(1982))。
已知苯誘導leucopenia、白血病和粒細胞缺乏性貧血，已報導了苯的代射中涉及細胞色素P—450(Lewis，J.G.，Stewarl，W.，Adams，D.C.，氧自由基在苯代謝物誘導DNA損壞中的作用，Cancer Res.，484762—4765(1988))。最近報導這種酶對吸入麻醉劑三氟溴氯乙烷顯示非常高的底物特異性，因而產生肝毒性。這是因為從中間體形成的三氟乙酰游離基增加，其與肝蛋白質形成加合物，產生新抗原(Kenna，J.G.，Pohm，L.R.，在用鹵代烷處理的大鼠中，影響三氟乙?；⒘ｓw蛋白新抗原表達的因素，Drug Metab.Dispos.，18788—792(1990))。
另外，細胞色素P—4502E1與活化各種低分量的有機物質而增加肝毒性密切相關，其中低分子量有機物如異煙肼、乙醇、丙酮、對亞硝基二甲胺、亞硝胺、苯酚、吡啶、吡唑、對硝基苯酚、苯胺或乙醚。通過節(jié)食或如糖尿病的疾病也可誘導細胞色素P—4502E1。
另一方面，II相反應涉及的酶如谷脫甘肽S—轉移酶(以下稱為“GST”)和微粒體環(huán)氧化物水解酚(以下稱為“mEH”)，具有解毒外源性毒性物質的作用。這些酶以各種方式解毒外源性毒性物質，例如GST的不同同工酶將谷脫甘肽的巰基轉移到親電性受體上，mEH水解氧化物。因此，這種酶量的增加可以起到保護組織免受氧化損害和環(huán)境壓力的作用(Pickett，C.B.，Lu，A.Y.H.，谷脫甘肽S—轉移酶；基因結構，調節(jié)和生物功能，Annu.Rev.Biochem.，58；743—764(1989)和Seidegrad，J，DePierre，J.W.，微粒體環(huán)氧化物水解酶的性質，調節(jié)和功能，Biochem.Biophys.Acta.，695；251—270(1983))。
因此，可以通過調節(jié)這種機制來防止由于異生素的活化而產生的癌誘發(fā)和毒性，即，抑制I相反應以抑制活化毒性中間體的形成，并增強II相反應以提促進毒性物質的排泄。已進行了廣泛的研究以尋找具有上述機制調節(jié)活性的抗化學藥物。結果，報導了一些具有抗化學活性的化合物。
例如，食物抗氧化劑丁基羥基茴香醚通過誘導II相反應相關酶而顯示抗癌活性(Cha，Y.N.，Bueding，E.，小鼠服用2(3)—叔丁基—4—羥基茴香醚對幾種肝微粒體和胞漿酶的作用，Biochem.Pharmacol.，28；1917—1921(1979))，丁基羥基甲苯也因誘導II相反應相關酶而顯示抗癌活性(Cha，Y.N.，和Heine，H.S.，小鼠和大鼠中，飲食中施加2(3)—叔丁基—4—羥基茴香醚和3，5—二叔丁基—4—羥基甲苯，對幾種肝酶活性的對比作用，Cancer Res.，42；2609—2615(1982))。
已報導天然或合成藥物如吡嗪酰胺或oltipraz中的成分—吡嗪具有誘導細胞色素P—4502E1(I相反應相關酶)以及GST和mEH(II相反應相關酶)的活性(Novak，R.F.，Kin，S.G.，Brooks，S.C.，Primiano.T.，Slinas，F.和Novak，J.C.，噻唑、噠嗪和吡嗪誘導大鼠谷脫甘肽S—轉移酶Toxicologist，11；48(1990))。在分子中含有吡嗪的oltipraz還具有誘導II相反應酶的能力，因此可抑制肺癌和胃癌。
這些物質雖具有誘導II相反應酶的能力，但對I相反應酶未顯示任何抑制作用。
另一方面，據報導蒜油中的成分烯丙基化硫對肝癌和結腸癌具有強抑制作用，這是因其抑制活化致癌劑前體亞硝胺的細胞色素P—4502E1的表達(Brady，J.F.，Li，D，Ishzaki，H和Yang，C.S.，二烯丙基化硫對大鼠肝微粒體亞硝胺代謝和其它單氧化酶活性的影響，Cancer Res.，48；5937—5940(1988)和Hayes，M.A.，Rushmore，T.H.和Goldberg.M.T.蒜油成分二烯丙基化硫抑制對1，2—二甲基肼的致癌反應，Carcinogenesis，8；1155—1157(1987))。另外，本發(fā)明者已證明烯丙基化硫強烈抑制細胞P—4502E1的表達，并完全抑制吡嗪作用所誘導的細胞色素P—4502E1(Biochemical Pharma-cology，(送交)1993)。
但是還沒有抑制I相反應酶同時誘導II相反應酶的有效抗化學藥。
為了尋找抑制I相反應酶的表達和活性，同時誘導II相反應酶并使其不受抑制物如異煙肼的抑制的抗化學劑，本發(fā)明者進行了廣泛的研究。結果，我們完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供新的吡嗪衍生物，它能夠抑制I相反應酶以防止活化的毒性中間體的形成，同時能夠誘導II相反應以促進毒性物質的排泄。
本發(fā)明的另一目的是提供下式(I)的新化合物 其中，R1代表氫原子或C1—3烷基；和R2代表苯基或呋喃基，或式—C(Ra)＝C(Rb)(Rc)代表的基團，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，為氫原子或甲基或苯基。
本發(fā)明的另一目的提供化合物(I)的制備方法，包括式(II)化合物 與式(III)化合物反應 其中X代表鹵原子或羥基；和R1和R2如上所定義。
本發(fā)明的另一目的是提供含有化合物(I)作為活性成分的保護肝不受可損害肝的化學物損害的藥物組合物。
通過本發(fā)明的下列詳細描述，本領域技術人員將明顯看出本發(fā)明的其它目的和應用。


圖1為來自用玉米油、吡嗪和本發(fā)明化合物處理的大鼠的肝微粒體與抗P—4502E1抗體的免疫吸印分析(試驗實施例1(1))。
圖2表示用吡嗪和本發(fā)明化合物處理后對硝基苯酚羥化酶活性隨時間的變化(試驗實施例1(2—1))。
圖3表示用吡嗪和本發(fā)明化合物處理后苯胺羥化酶活性隨時間的變化(試驗實施例1(2—2))。
圖4表示用吡嗪和本發(fā)明化合物處理后N—亞硝基二甲胺脫甲基化酶的活性隨時間的變化(試驗實施例1(2—3))。
圖5為從用玉米油、INAH、INAH加本發(fā)明化合物處理的大鼠中分離的微粒體與抗P—4502E1抗體的免疫吸印分析(試驗實施例2)。
圖6為從用玉米油、吡嗪和本發(fā)明化合物處理過的大鼠中分離的肝微粒體與抗mEH抗體的免疫吸印分析(試驗實施例3)。
圖7表示用玉米油和本發(fā)明化合物處理后，谷脫甘肽S—轉移酶活性隨時間的變化(試驗實施例3(2))。
圖8表示用吡嗪和本發(fā)明化合物處理后，谷脫甘肽S—轉移酶活性隨時間的變化(試驗實施例3(2))。
圖9表示用玉米油、吡嗪、本發(fā)明化合物和吡嗪加本發(fā)明化合物處理后，谷脫甘肽S—轉移酶的活性(試驗實施例3(2))。
圖10為從用玉米油和本發(fā)明化合物處理過的大鼠中分離的微粒體與抗mEH抗體的免疫吸印分析(試驗實施例4)。
本文所用述語“抗化學劑”指能夠抑制I相反應以防止活化的毒性中間體代謝物的形成，同時提高II相反應以促進毒性物的排泄的化合物。本發(fā)明化合物在I相反應誘導劑或II相反應抑制劑存在下有效，因而可有效地防止肝受到各種化學物的損害。
根據本發(fā)明，提供下式(I)的新吡嗪衍生物 其中，R1代表氫原子或C1—3烷基；和R2代表苯基或呋喃基，或式—C(Ra)＝C(Rb)(Rc)代表的基團的式(I)化合物，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，為氫原子或甲基或苯基。
其中，優(yōu)選其中R1為氫原子或甲基，R2為式—C(Ra)＝C(Rb)(Rc)所代表的基團，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，為氫原子或甲基的化合物(I)。
最優(yōu)選列于下表1中的顯示高抗化學活性的化合物(I)。
表1
本發(fā)明提供式(I)化合物的制備方法。該方法包括化合物(II)
與化合物(III)反應
其中，X代表鹵原子或羥基；及R1和R2如上所定義。
當其中X為鹵原子的化合物(III)與化合物(II)反應時，該反應可在堿存在下在惰性溶劑如N，N—二甲基甲酰胺或N，N—二甲基乙酰胺中進行。本發(fā)明中所用堿可包括(但不限于)如三乙胺、三甲胺、N，N—二甲基苯胺或二氮雜雙環(huán)十一碳烯。反應溫度可在0℃到100℃，優(yōu)選30℃到80℃間變化。反應時間在1—5小時范圍內。
當使用其中X為羥基的化合物(III)時，化合物(III)用有機膦如三苯膦在惰性溶劑如N，N—二甲基甲酰胺、二氯甲烷、氯仿或四氫呋喃中處理，形成中間體，后者與化合物(II)反應。為此，借助于有機堿如三乙胺、三甲胺或N，N—二甲基苯胺將化合物(II)溶解在惰性溶劑如N，N—二甲基乙酰胺中。
本發(fā)明還提供含有式(I)化合物作為活性成分的藥物組合物。該組合物可含有藥學上可接受的常規(guī)載體或賦形劑。可用普通技術將此組合物配制成固體、液體或粉末形式。本發(fā)明不限定配制技術和添加劑，它們是藥學領域中通用的，本領域技術人員可容易地選擇。
可將化合物(I)通過非限定的途徑給藥于人或動物。雖然化合物(I)的量可根據給藥途徑、年齡和癥狀，或目的而變化，但可在50—500mg/kg內，優(yōu)選在100—300mg/kg范圍內選擇。
下列實施例將更詳細地描述本發(fā)明，但不對本發(fā)明構成任何限制。參考例1制備2—巰基吡嗪將5.0g 2—氯吡嗪溶解在40ml二甲基甲酰胺中，向其中加入5.0g NaSH，xH2O。將混合物在60℃加熱2小時，冷卻至5℃。過濾出生成的沉淀，向濾液中加入400ml乙醚。沉淀用乙醚洗，干燥，得到3.0g黃色固體。IR(KBr)1650，1570，1562，1425cm-1NMR(DMSO-d6)ppm7.60(d，1H)，7.80(d，1H)，8.55(s，1H)，14.35(bs，1H)實施例1—1制備2—(2—丙烯基硫基)吡嗪將6.57g參考例1制備的2—巰基吡嗪溶解在80ml二甲基甲酰胺中，加入8.6ml三乙胺。向此溶液中，加入6.84ml烯丙基溴，在50℃下攪拌該混合物2小時。向此反應溶液中加入500ml冰水，用乙醚萃取所形成的混合物，濃縮。減壓蒸餾殘余物，得到7.85g(85％)油狀淺黃色液體。
沸點0.5托/68—69℃。
IR(石蠟油)1700、1633、1559、1506、cm-1NMR(DMSO-d6)ppm3.77(d，2H)，5.10(d，1H)，5.30(d，1H)，5.81-6.02(m，1H)，8.33(s，1H)，8.48(s，1H)，8.60(s，1H)實施例1—2制備2—(2—丙烯硫基)吡嗪用烯丙基氯代替烯丙基溴，進行實施例1—1的相同步驟，得到標題化合物。
bp0.5托/68—69℃IR(石蠟油)1700，1633，1559，1506cm-1NMR(DMSO-d6)ppm3.77(d，2H)，5.10(d，1H)，5.30(d，1H)，5.81-6.02(m，1H)，8.33(s，1H)，8.48(s，1H)，8.60(s.1H)實施例1—3制備2—(2—丙烯硫基)吡嗪將0.58g烯丙醇溶解在50ml二氯甲烷中，向其中加入2.89g三苯膦和1.96g N—溴琥珀酰亞胺。室溫下攪拌此混合物30分鐘，向此溶液中加入溶有1.0g 2—巰基吡嗪和1ml三乙胺的5ml二甲基甲酰胺溶液。形成的混合物在室溫下攪拌1小時，傾入100ml水中。分出有機層，濃縮至干。殘余物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1，得到0.6g標題化合物。
bp0.5托/68—69℃IR(石蠟油)1700，1633，1559，1506cm-1，NMR.(DMSO-d6)ppm3.77(d，2H)，5.10(d，1H)，5.30(d，1H)，5.81-6.02(m，1H)，8.33(s，1H)，8.48(s，1H)，8.60(s.1H)實施例2制備2—(芐基硫基)吡嗪用芐基溴代替烯丙基溴，進行實施例1—1的相同步驟，用乙酸乙酯∶正己烷＝1∶5作為洗脫劑進行硅膠柱層析純化，得到了標題化合物。
m.p.65—67℃(白色固體)IR(KBr)1500，1445，1380cm-1NMR(DMSO-d6)ppm4.45(s，2H)，7.2-7.35(m，5H)，8.2-8.35(m，3H)實施例3制備2—(3—甲基—2—丁烯硫基)吡嗪用異戊烯醇代替烯丙醇，進行實施例1—3的相同步驟，得到油狀液體標題化合物。
IR(石蠟油)1501，1375cm-1NMR(CDCl3)ppm1.74(s，6H)，3.81(d，2H)，5.35(m，1H)，8.2，8.35，8.4(m，3H)實施例4制備2—(肉桂基硫基)吡嗪用肉桂醇代替烯丙醇，進行實施例1—3中的相同步驟，得到白色固體標題化合物。
IR(石蠟油)1490，1440，1380cm-1NMR(CDCl3)ppm4.04(d，2H)，6.35(u，1H)，6.6(d，1H)，7.2-7.4(m，5H)，8.2，8.4，8.47(m，3H)實施例5制備2—(糠基硫基)吡嗪用糠醇代替烯丙醇，進行實施例1—3的相同步驟，得到油狀液體標題化合物。
IR(石蠟油)14501，1456，1382cm-1NMR(CDCl3)ppm4.46(s，2H)，6.26(m，2H)，7.34(d，1H)，8.2，8.4，8.45(m，3H)實施例6制備2—(3—甲基—3—丁烯硫基)吡嗪用3—甲基—3—丁烯—1—醇代替烯丙醇，進行實施例1—3的相同步驟，得到油狀液體標題化合物。
IR(石蠟油)1550，1450，1370cm-1NMR(CDCl3)ppm1.80(s，3H)，2.42(t，2H)，3.3(t，2H)，4.8(d，2H)，8.2，8.4，8.45(m，3H)實施例7制備2—(2—丁烯硫基)吡嗪用2—丁烯—1—醇代替烯丙醇，進行實施例1—3中相同步驟，得到油狀液體標題化合物。
IR(石蠟油)1502，1455，1381cm-1NMR(CDCl3)ppm1.7(d，3H)，3.8(d，2H)，5.6(m，2H)，8.2，8.4，8.45(m，3H)實施例8制備2—(3—丁烯硫基)吡嗪用3—丁烯—2—醇代替烯丙醇，進行實施例1—3中的相同步驟，得到油狀液體標題化合物。
IR(石蠟油)1502，1475，1380cm-1NME(CDCl3)ppm1.4(d，3H).4.4(m，1H)，5.0(d，1H)，5.2(d，1H)，5.9(m.1H)，8.14，8.3，8.35(m，3H)試驗實施例1I相反應的抑制(1)(1)Western吸印分析為了檢驗本發(fā)明化合物對I相反應相關酶的表達的作用，進行了如下的Western吸印分析將28只重190±30g的雄性Spragne—Dawley大鼠分成7組。對作為對照組的第一組，腹膜內給予0.1ml玉米油/200g體重。第2—4組腹膜內分別給予用玉米油稀釋的吡嗪1，2或3天，劑量均為200mg/kg體重。第5—7組腹膜內分別給予用玉米油稀釋的實施例1—1制備的化合物第1，2或3天，劑量均為200mg/kg體重。在上午11時左右給予試驗化合物。
給予試驗化合物后，將大鼠禁食18小時，第2天7—8am左右割頸處死動物。處死后，馬上從肝門靜脈輸入生理鹽水，以從肝組織中除去血液。取出肝，切細。加入4倍體積的0.1M TrisHCl緩沖液(PH7.4)，均化此肝組織。所有步驟在4℃恒溫下進行。均化的組織以12,000g離心20分鐘，上清液于105,000g超速離心1小時，以將胞液(上清液)和微粒體(沉淀)分離。將如此得到的微粒體分散在0.1M Tris.KCl緩沖液中，于105,000g超速離心1小時澄清，得到純的肝微粒體。
按照Laemmli的方法(Laemmli，U.K.細菌噬菌體T4的頭部組裝中結構蛋白的裂解，Nature，227680—685，1970)，所得微粒體在十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行免疫吸印分析。
使用了BioRad Mini ProteinII，凝膠制備如下這樣制備分離凝膠將4.9ml重蒸水、2.5ml 1.5M Tris緩沖液(PH8.8)、50μl 20％十二烷基硫酸鈉(SDS)和2.5ml 30％丙烯酰胺和0.8％二丙烯酰胺的混合物混合，真空脫氣，加入50μl 10％過硫酸銨和5μl N，N，N’，N’—四甲基乙二胺，讓形成的混合物在兩玻璃板之間靜置1小時，得到凝膠。
這樣制備積層凝膠將7.35ml雙蒸水、1.25ml 1.5M Tris緩沖液(PH6.8)，50μl 20％SDS和1.3ml 30％丙烯酰胺的和0.8％二丙烯酰胺混合物混合，真空脫氣，加入50μl10％過硫酸銨和10μl N，N，N’，N’—四甲基乙二胺，讓形成的混合物在兩玻璃板之間靜置1小時，得到凝膠。
來自第一、第二和三組的微粒體用樣品緩沖液(1M Tris(pH6.8)2.5ml，80％甘油5ml，20％SDS 5ml，1％溴酚藍0.2ml，β—巰基乙醇2ml和重蒸水5.3ml)稀釋，并在100℃加熱5分鐘。確定稀釋比，使每一樣品含有20μg的細胞色素P—4502E1/7μl。
將樣品點在凝膠上，用電泳緩沖液(每升含3.04g Tris，14.42g甘氨酸和5ml 20％ADS)進行電泳。施加的電流為積層凝膠12.5mA，電泳膠20mA。
電泳結束后，按Davis的方法(Davis，L.G.，Dibner，Elsevier，311—314(1986))，將凝膠進行Western吸印分析。用BioRad MiniTrans—blot于70伏2小時，將凝膠轉移到硝基纖維素紙上。將3.04gTris，14.42g甘氨酸和200ml甲醇溶解在1升蒸餾水中制備轉移緩沖液。轉移完成后，硝基纖維素紙用水洗，浸泡在4℃的3％脫脂奶液中過夜。然后用生理鹽水洗，如下進行免疫化學分析將14μl羊抗兔P—4502E1 IgG與15ml PBS混合，放入含上述處理過的硝酸纖維紙的袋中，振搖2小時。向用PBS洗過的硝基纖維紙上加入15ml PBS中的15μl生物素化的驢抗羊IgG，反應2小時。反應混合物用PBS洗，加入15ml PBS中的1μl親和鏈霉素—辣根過氧化物酶。反應1小時后，向反應混合物中加入4—氯—1—萘酚(1mg/kg甲醇)和15μl過氧化氫酶。約30秒種后，當觀察到變色時，用去離子水洗滌混合物以終止反應。
結果示于圖1中。施用吡嗪的組，即第2到4組顯示P—4502E1的表達與服用時間成比例地顯著提高。但接受實施例1—1的化合物的第5—7組，P—4502E1的表達與服用時間成比例地顯著降低。特別是，分別服用了2天和3天的第6組和第7組顯示蛋白表達降低的顯著效應，表達低于對照組。(2)酶活性為了檢驗本發(fā)明化合物對I相反應相關酶活性的作用，進行了如下試驗(2—1)對硝基苯酚羥化酶給予重190±30g的6組Sprague—Dawley大鼠200mg/kg劑量的吡嗪(1—3組)或實施例1—1制備的化合物(4—6組)1、2或3天。按以上(1)中相同步驟分離出肝微粒體后，按Koop的方法測定對硝基苯酚羥化酶的活性(Dennis R.Koop，免的乙醇可誘導細胞色素P—450同工酶3a對對硝基苯酚的羥化，Molecular Pharmacol.29，399—404(1986))。
將1mg微粒體和1mM對硝基苯酚加到0.6ml 0.1M磷酸鉀緩沖液(PH6.8)中，使總體積達0.9ml。形成的混合物在37℃孵箱中預反應2分鐘，加入1mM NADPH(0.1ml)開始反應。3分鐘后，加入0.5ml 0.6N高氯酸顯色，馬上測定546nm處的吸光度。酶活性用反應1分鐘生成的4—硝基兒茶酚的摩爾濃度表示。
結果示于圖2中。在圖2中，“★”表示每個個體的顯著差別，“★”、“★★”和“★★★”分別表示P＜0.05，P＜0.01和P＜0.001。在所有圖中均如此。從圖2可以看出，第4—6組(接受本發(fā)明化合物)與第1—3組相比，給藥1、2和3天后的對硝基苯酚羥化酶活性分別降低64％、73％和82％。(2—2)苯胺羥化酶為測定苯胺羥化酶的活性進行以上(2—1)中的相同步驟。根據Mieyal的方法測定苯胺羥化酶的活性(John J.Mieyal，苯胺加速人氧血紅蛋白的自動氧化及其與血紅蛋白催化的苯胺羥化的關系，J.Biol.Chem.251，3442—3446(1976))。
將1mg微粒體和5mM苯胺加到0.6ml 0.1M磷酸鉀緩沖液(PH6.8)中，使總體積為0.9ml。加入1mM NADPH使總體積為1.0ml，混合物在37℃反應。10分鐘后，加入20％三氯乙酸終止反應，離心反應混合物。向1ml上清液中加入0.1ml 5％苯酚和0.1ml 2.5N碳酸鈉，溶解在0.1N NaOH中。讓此混合物靜置30分鐘顯色，馬上測定630nm處的吸光度。酶活性用反應1分鐘生成的4—氨基苯酚的摩爾濃度表示。
結果示于圖3中。從圖3可以看出，與第1—3組(接受吡嗪)相比，第4—6組(接受本發(fā)明化合物)給藥1、2和3天后，苯胺羥化酶的活性分別下降57％、80％和88％。(2—3)N—亞硝基二甲胺脫甲基化酶進行以上(2—1)的相同步驟，以測定N—亞硝基二甲胺脫甲基化酶的活性。按Kaul和Novak的方法測定N—亞硝基二甲胺脫甲基化酶的活性(Kaul，L.L和Novak，R，F.，咪唑誘導兔肝微粒體細胞色素P—450；提高代謝活性及改變底物特異性，Arch.Biochem.Biophys.，235，470—481(1984))。
向1mg微粒體中加入10mM N—亞硝基二甲胺和0.6ml 0.1M磷酸鉀緩沖液(PH7.4)，并加入1mM NADPH使總體積達1ml。此混合物在37℃反應30分鐘后，加入20％三氯乙酸終止反應，離心反應混合物。向0.75ml上清液中加入Nash試劑(100ml蒸餾水中含乙酸銨15.416g，乙酰乙酸鹽0.206ml和乙酸0.289ml)。讓混合物于37℃放置45分鐘顯色，測定412nm處的吸光度。酶活性用反應1分鐘產生的甲醛的摩爾濃度表示。
結果示于圖4中。從圖4可以看出，與第1—3組(接受吡嗪)相比，第4—6組的N—亞硝基二甲胺脫甲基化酶的活性與給藥時間成比例，降低49—73％。試驗實施例2I相反應的抑制(2)(1)免疫吸印分析為了檢驗本發(fā)明化合物與異煙肼(INAH，I相反應相關酶系統(tǒng)的誘導劑)一起給藥時，對I相反應相關酶的表達的作用，進行了如下免疫吸印分析將36只重190±30g的雄性Sprague—Dawley大鼠分成9個組。第1組作為對照組，腹膜內給以0.1ml/200g體重的玉米油。第2組腹膜內給以200mg/kg體重劑量的PBS稀釋的INAH。第3—9組腹膜內給予200mg/kg體重劑量的PBS稀釋的1NAH，再腹膜內分別給予實施例2—8的化合物，后者用玉米油稀釋，劑量為200mg/kg體重。按照上述試驗實施例1(1)中的相同步驟，分離了肝微粒體并在SDS—PAGE上進行Western吸印分析。
結果示于圖5中，從圖5可在看出，接受INAH加本發(fā)明化合物的第3—9組(3—9道)顯示弱帶，表示本發(fā)明化合物抑制了由INAH誘導的酶表達。接受實施例8的化合物的第9組顯示最強的抑制。
(2)酶活性為了檢測本發(fā)明化合物與INAH聯合給藥時，對I相反應相關酶活性的作用，進行如下試驗8組重190±30g的Sprague—Dawley大鼠，腹膜內給以INAH(第1組)，或INAH加實施例2—8的化合物(第2—8組)，劑量均為200mg/kg。本發(fā)明化合物和INAH分別用玉米油和PBS稀釋，給予INAH后馬上給以試驗化合物。
用試驗實施例1(2—1)和(2—2)中的相同步驟，測定了對硝基苯酚羥化酶和苯胺羥化酶的活性變化。將僅給INAH時的酶活性作為100％，確定酶活性。結果示于表2中。
表2 Ex—實施例從表2可以看出，本發(fā)明化合物抑制由INAH誘導的對硝基苯酚羥化酶和苯胺羥化酶的表達。特別是實施例7和8的化合物顯示優(yōu)異的抑制作用。試驗實施例3II相反應的誘導(1)(1)Western吸印分析為了檢查本發(fā)明化合物對II相反應相關酶表達的作用，進行了如下Western吸印分析將28只重190±30g的Sprague—Dawley大鼠分成7組。第1組作為對照組，腹膜內給以0.1ml玉米油/200g體重。第2—4組分別腹膜內給予1、2和3天玉米油稀釋的比嗪，劑量為200mg/kg體重。第3—7組分別腹膜內給予1、2和3天用玉米油稀釋的實施例1—1制備的化合物，劑量為200mg/kg。
按以上試驗實施例1(1)中的相同步驟，分離肝微粒體，進行SDS—聚丙烯酰膠凝膠電泳。然后進行如下的微粒體環(huán)氧化物水解酶(mEH)Western吸印分析。
將5μl兔抗大鼠環(huán)氧化物水解酶IgG與15ml PBS混合，放入含電泳后的硝基纖維素紙的袋中，振搖2小時。向此硝基纖維素紙上加入15ml PBS中的15μl生物素化的驢抗羊IgG(第二抗體)反應2小時。向反應混合物中加入親和鏈霉素—辣根過氧化物酶和4—氯—1—萘酚顯色。
結果示于圖6中。與第一組(對照)或第2—4組(接受比嗪)相比，接受本發(fā)明化合物的第5—7顯示mEH的表達明顯提高。特別是第6和第7組的mEH表達與給藥時間成比列提高了4倍和5倍，這兩組分別施用了本發(fā)明化合物2天和3天。(2)酶活性為了檢查發(fā)明化合物對II相反應相關酶谷脫甘肽S—轉移酶(GST)活性的作用，進行了下列試驗給予重190±30g的9組Sprague—Dawley大鼠玉米油(1—3組)、吡嗪(4—6組)或實施例1—1中制備的化合物(7—9組)1、2或3天，劑量為200mg/kg。第10組給予200mg/kg劑量的吡嗪加實施例1—1中制得的化合物，共計3天。按試驗實施例1(1)中的相同步驟分離了肝微粒體，按Habig的方法測定GST的胞液活性(Habig，W.H.，J.Biol.Chem.249，7130—7139(1974))。
向25μg(0.1ml)胞液蛋白中加入0.1mM 1—氯—2，4—硝基苯和1.0mM谷脫甘肽作為底物，加入0.1M磷酸鉀使總體積達1.0ml(PH6.4)。形成的混合物在室溫靜置2分鐘，在1分鐘內每隔15秒測定340nm處的吸光度。作為參考，使用了加熱變性的胞液蛋白。通過測定1分鐘內的吸光度變化并使用消光系數9.6mM-1cm-1來計算GST的活性。
結果示于圖7—9中。圖7為比較對照組與接受本發(fā)明化合物組別結果的棒圖。圖8為比較接受吡嗪的組和接受本發(fā)明化合物的組別的結果的棒圖。圖9為比較對照組與服用3天吡嗪、烯丙基化硫、和吡嗪加本發(fā)明化合物的組別結果的棒圖。
從圖7—9可以看出。與對照組相比，接受本發(fā)明化合物1、2和3天的組，其GST活性根據不同時間分別提高135％、178％和200％，遠高于接受吡嗪和吡嗪加本發(fā)明化合物計3天的組提高130％和140％。因此，本發(fā)明化合物有效地誘導II相反相關酶。試驗實施例4II相反應的誘導(2)(1)免疫吸印分析為了檢查本發(fā)明化合物對II相反相關酶的表達的作用，進行了如下免疫吸印分析將重190±30g的32只Sprague—Dawley大鼠分成8組。向第一組(對照組)腹膜內給予0.1ml玉米油/200g體重。第2—8組腹膜內給予用玉米油稀釋的200mg/kg體重劑量的實施例2—8的化合物。
按照上述試驗實施例1(1)中的相同步驟，分離肝微粒體，在SDS—PAGE上進行免疫吸印分析。結果示于圖10中。從圖10可以看出，接受本發(fā)明化合物的第2—8組(2—8道)顯示強帶，說明本發(fā)明化合物誘導該酶表達。(2)酶活性為了檢查本發(fā)明化合物單獨給藥或與INAH聯合給藥時對II相反應相關酶活性的作用，進行了如下試驗腹膜內給予16組重190±30g的SD大鼠玉米油(第1組)、實施例2—8的化合物(2—8組)、INAH(第9組)，或INAH加實施例2—8的化合物(10—16組)，劑量均為200mg/kg。本發(fā)明化合物和INAH用玉米油稀釋，給予INAH后馬上給予試驗化合物。
用試驗實施例3(2)中的相同步驟測定GST活性的變化。以僅給予玉米油或INAH時的酶活性為100％，確定酶活性。結果示于表3中。
表3 Ex—實施例從表3中可以看出，本發(fā)明化合物誘導谷脫甘肽S—轉移酶的表達，特別是實施例5，7和8的化合物提高酶表達70％或更高。另外，表3.中的結果顯示，甚至在施用該酶的表達抑制劑INAH時，實施例3，5和8的化合物對酶表達有強誘導作用。
綜上所述，本發(fā)明化合物可有效地抑制I相反應相關酶的表達，而活化II相反應相關酶的表達，從而可有利地用于保護肝不受各種化學品的損害。
權利要求
1.下式(I)的化合物 其中R1代表氫原子或C1—3烷基；和R2代表苯基或呋喃基，或式—C(Ra)＝C(Rb)(Rc)代表的基團，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，為氫原子或甲基或苯基。
2.權利要求1的化合物，其中R2為氫原子或甲基，R2為式—C(Ra)＝C(Rb)(Rc)代表的基團，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，為氫原子或甲基。
3.權利要求1的化合物，其為選自2—(2—丙烯硫基)吡嗪、2—(芐硫基)吡嗪、2—(3—甲基—2—丁烯硫基)吡嗪、2—(肉桂基硫基)吡嗪、2—(糠基硫基)吡嗪、2—(3—甲基—3—丁烯基硫基)吡嗪、2—(2—丁烯基硫基)吡嗪和2—(3—丁烯基硫基)吡嗪中的一種。
4.制各式(I)化合物的方法 其中R1代表氫原子或C1—3烷基；和R2代表苯基或呋喃基，或式—C(Ra)＝C(Rb)(Rc)代表的基團，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，為氫原子或甲基或苯基，該方法包括式(II)化合物 與式(III)化合物反應 其中X代表鹵原子或羥基；和R1和R2如上所定義。
5.一種含作為活性成分的式(I)化合物和藥學上可接受的載體的抗化學組合物 其中，R1代表氫原子或C1—3烷基；和R2代表苯基或呋喃基，或式—C(Ra)＝C(Rb)(Rc)代表的基團，其中Ra、Rb和Rc相同或不同，為氫原子或甲基或苯基。
全文摘要
茲公開了式(I)化合物，其中基團定義見說明書。本發(fā)明還提供式(I)化合物的制備方法和含式(I)化合物作為活性成分的組合物。式(I)化合物可以有效地抑制I相反應相關酶的表達，同時活化II相反應相關酶的表達，從而可有利地用于保護肝不受各種化學品的損害。
文檔編號A61P1/16GK1115981SQ94190810
公開日1996年1月31日 申請日期1994年10月21日 優(yōu)先權日1993年10月21日
發(fā)明者金洛斗, 李鐘郁, 金相建, 崔榮魯 申請人:鄭源根