專利名稱：用作抗腫瘤藥劑的?；幌╊愃莆锏闹谱鞣椒?br> 本課題得到國家衛(wèi)生研究院科研補助金CA-37641的部分支持。美國政府擁有發(fā)明權(quán)。
發(fā)明的
背景技術(shù)：
多種藥物的化學(xué)治療法對某些血液癌和早期的迅速增生的固體腫瘤有治療作用。有療效的化學(xué)治療法得益于發(fā)現(xiàn)了新的，相對非交叉抗藥的藥物和更有效地使用現(xiàn)有的藥物。增加常規(guī)藥物的效能的手段包括更有效的多種藥物的給藥方式、最少的藥物毒性和增加使用輔藥、外科手術(shù)或放射治療。
盡管近年有了改善，但許多類型癌癥的患者仍存在著很大的復(fù)發(fā)和死亡的危險。在復(fù)發(fā)后，某些患者可通過原先的治療方法而獲得緩解。然而，通常需要高于原先化學(xué)治療藥物的劑量或使用附加的藥物，這表明至少部分地產(chǎn)生了抗藥性。近年來證據(jù)表明抗藥性可同時擴展至若干藥物，包括患者并未使用過的藥物。多種藥物抗藥性(mdr)腫瘤的形成也許是腫瘤物質(zhì)的機能，并成為治療失敗的主要原因。為克服這種抗藥性，采用高劑量的化學(xué)治療，同時采用或不用放射治療和同種異基因的或自體固有的骨髓移植。高劑量的化學(xué)治療可使用原來的藥物或包括附加的藥物。這種方法的可行性已被證明用于造血的或固體的腫瘤。需要開發(fā)有mdr表型非交叉抗藥性的新藥物以促進(jìn)現(xiàn)有方法的治療作用及促進(jìn)先有治療過的患者的治療手段。
近年來，Kelner M.等人在Cancer Res.473186(1987)(列為本文參考文獻(xiàn))中研究了稱之為隱杯傘素的新一類天然產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性。隱杯傘素S和M是已知存在的兩種隱杯傘素。隱杯傘素具有完全不同于其他化學(xué)治療藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。首先提純隱杯傘素化合物，將其提交National Cancer Ins titute Division of CancerTreatment(NCT DCT)進(jìn)行體內(nèi)藥物篩選評價，根據(jù)NCI的研究，其對其他試驗的腫瘤系統(tǒng)有低的治療指數(shù)。隱杯傘素的過高毒性妨礙了它在人體腫瘤治療中的任何應(yīng)用。
因此，需要化學(xué)治療藥物，其對腫瘤，尤其是mdr腫瘤是毒性的，并對體內(nèi)治療有足夠有效的治療指數(shù)。本發(fā)明滿足了這種需要并具有相關(guān)的優(yōu)點。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種抑制受治療者腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包括使用治療量的有如下結(jié)構(gòu)的隱杯傘素S或隱杯傘素M類似物與腫瘤接觸 或 其中類似物能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，而對受治療者沒有過高毒性，并且其中R1是烷基或氫；R2是烷基；和R3是醇或酯。
附圖的簡要說明附

圖1表示與其他腫瘤相比乳腺癌和骨髓白血病細(xì)胞對隱杯傘素S的敏感性。
附圖2表示隱杯傘素S的活性部位。
附圖3表示NMR譜，其說明在酸中存在短時作用的中間體。信號A來自五元環(huán)(隱杯傘素M)中雙健上的氫，信號B來自由環(huán)丙烷環(huán)打開(但在雙鍵反應(yīng)之前)產(chǎn)生的短時存在的中間體上的氫，C標(biāo)記的幾個信號來自雙鍵反應(yīng)后產(chǎn)生的產(chǎn)物。此時，來自隱杯傘素M的信號峰消失，和位置C的峰是主要的信號。信號B與信號A同時消失表明它是由隱杯傘素M產(chǎn)生的短時間存在的中間體。
附圖4表示隱杯傘素S對無胸腺小鼠(Balb/C)的Molt-4腫瘤生長的作用。
附圖5表示脫氫隱杯傘素M對腫瘤生長的作用。
附圖6表示HL60/MRI異種移植對脫氫隱杯傘素M的應(yīng)答。
附圖7表示使用相對敏感的HL60細(xì)胞和抗藥性B細(xì)胞的隱杯傘素S的攝入。
附圖8表示被HL60細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)快速累積的隱杯傘素S在高濃度下飽和。
附圖9表示在各種濃度下對被HL60細(xì)胞最初攝入的隱杯傘素S的分析符合Michaelis-Menton飽和常數(shù)。
附圖10表示6-羥基甲基?；幌┖推渌Ｒ?guī)抗癌藥劑對人體肺腺癌MV522的作用。
附圖11表示不同劑量的6-羥基甲基?；幌θ梭w肺腺癌MV522的作用。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了一種抑制受治療者的腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包括使用治療量的具有如下結(jié)構(gòu)的隱杯傘素S或隱杯傘素M類似物與腫瘤接觸 其中類似物能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，而對受治療者沒有過高的毒性，并且其中R1是烷基或氫；R2是烷基；和R3是醇或酯。
該類似物可以是有所述結(jié)構(gòu)的任何化合物。有效類似物的實例為 本發(fā)明還提供了一種抑制受治療者的腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包括使治療量的具有如下結(jié)構(gòu)的隱杯傘素S或隱杯傘素M類似物與腫瘤接觸 其中類似物能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，而對受治療者沒有過高的毒性，并且其中R1是烷基、烷氧基或氫；R2是烷基；和R3是醇或酯。
類似物可以是具有所述結(jié)構(gòu)的任何化合物。有效類似的兩個實例為 類似物也可以是具有如下結(jié)構(gòu)的?；幌╊愃莆?其中R是 (其中R1＝烷基，芳基，NH2，NHR，或NR2)
“抑制”指的是或者與未進(jìn)行治療的速率相比降低了腫瘤細(xì)胞生長速率，或者導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞塊減少了尺寸。抑制還包括腫瘤的完全消退。因此，類似物對腫瘤細(xì)胞可以是細(xì)胞生長繁殖抑制的或有細(xì)胞毒素作用的。
受治療者可以是有腫瘤的任何動物。類似物對體內(nèi)人體腫瘤以及體外人體腫瘤細(xì)胞系是有效的。
腫瘤可與類似物以任何有效的方式接觸，其中許多是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。向受治療者給藥的有效途徑可以包括靜脈內(nèi)的、口腔、腹膜內(nèi)的和口腔和鼻內(nèi)吸入。優(yōu)選的給藥途徑取決于受治療者和所治療的腫瘤的類型。
申請人驚奇地發(fā)現(xiàn)隱杯傘素S和M的類似物與隱杯傘素S和M相比有較小的毒性，但是更有效的體內(nèi)化學(xué)治療劑。如上所述，隱杯傘素S和M由于其過高的毒性具有低的治療指數(shù)，因而不能用于人體治療。申請人發(fā)現(xiàn)隱杯傘素S和M的各種改性產(chǎn)物抑制親核試劑與化合物反應(yīng)。這導(dǎo)致環(huán)丙烷環(huán)不易打開，降低了化合物的體內(nèi)毒性，而產(chǎn)生高的治療指數(shù)。申請人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，酰基富烯類似物，6-羥基甲基酰基富烯，比上述已知的S和M隱杯傘素類似物明顯地更有效和無毒性。
不影響隱杯傘素或其類似物的活性官能基團(tuán)的上述定義范圍的各種R基團(tuán)可以是各種各樣的取代基。申請人想要將上述各種R基團(tuán)廣泛地認(rèn)作，例如，烷基包括任何連接于烷基的官能團(tuán)(即，烷基富烯或官能團(tuán)本身)。R基團(tuán)包括硝基、鹵素、烷基鹵化物、醇、過氧化物、內(nèi)過氧化物、伯、仲或叔胺、醚、酯、巰基、硫代烷基、硫酯、二硫代酯、二硫化物、羧酸、烯胺、亞胺或肟基。
類似物的治療有效量隨受治療者變化。然而，我們發(fā)現(xiàn)，與隱杯傘素S和M相比由于降低了毒性，類似物可以相對高的劑量給藥。對于靜脈內(nèi)給藥，發(fā)現(xiàn)每公斤體重30～112,000μg的治療量是尤其有效的，而對于腹膜內(nèi)給藥，每公斤體重300～112000μg是有效的。作為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，治療量可根據(jù)給藥方法變化。此外，如果類似物連接于毒素，治療量將變化。
類似物可連接于試劑以形成配合物，其結(jié)合于聯(lián)結(jié)腫瘤的抗原。該方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，其可包括一個用于連接試劑至類似物的銜接物。這種連接可包括任何化學(xué)鍵，例如共價健。試劑可以是特定地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面或腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)的聯(lián)結(jié)腫瘤的抗原的任何試劑。通常該試劑是一種抗體，多克隆抗體或單克隆抗體。這些配合物隨后能用于治療中。本發(fā)明的方法可用于任何腫瘤細(xì)胞，但對骨髓、表皮樣瘤、T細(xì)胞白血病和肺、卵巢和乳腺癌的腫瘤細(xì)胞尤其有效。
本發(fā)明還公開了有如下結(jié)構(gòu)的化合物 其中R＝甲基；和R1、R2和R3＝甲基或烷基。
還公開了有如下結(jié)構(gòu)的化合物 其中R＝H或甲基；和R1、R2和R3＝甲基或烷基。
實施例I脫氫隱杯傘素M的合成將隱杯傘素M(200mg)和重鉻酸吡啶鎓鹽(1g)在無水二氯甲烷(60ml)中的混合物在室溫下在燒瓶中攪拌，燒瓶配有橡膠隔膜，以便可維持氬氣氣氛。在20小時后，反應(yīng)混合物用乙醚(20ml)稀釋，通過硅膠短柱過濾。柱進(jìn)一步用更多的乙醚洗脫，將合并的濾液濃縮，得到的殘余物用硅膠色譜法分離，用己烷-乙酸乙酯(10∶1)作洗脫液。從色譜的最初餾份中得到所需化合物。產(chǎn)率為140mg白色結(jié)晶體，熔點64-65℃。記錄該化合物的NMR譜數(shù)據(jù)。
實施例II富烯的合成將隱杯傘素S(50mg)溶解于水(2mL)中，向溶液中加入3N鹽酸(2mL)。所生成的溶液不久變成混濁(30分鐘內(nèi))，形成黃色的沉淀。將混合物在電冰箱中放置過夜；隨后用氯仿(10mL)萃取。將黃色的氯仿溶液干燥(MgSO4)，減壓除去溶劑，得到桔黃色膠狀體。該物質(zhì)用硅膠色譜分離，用己烷∶乙酸乙酯(6∶1)作洗脫液，得到富烯(20mg)和二富烯(10mg)。記錄該化合物的NMR譜數(shù)據(jù)。
此外，富烯的全合成方法也可以用如下方法得到 所示的已知的1，1-二乙酰基環(huán)丙烷與環(huán)戊二烯衍生物的二陰離子反應(yīng)得到二醇，其在弱酸性下處理得到二醇酮。選擇性地除去叔羥基得到所需的富烯。
實施例III體外研究為測試細(xì)胞毒性效果，將各種濃度的隱杯傘素加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，48小時后，通過維蟲蘭排除法測定細(xì)胞生長/生存性。作為48小時連續(xù)暴露研究的可替代方法，將細(xì)胞放置在96孔平板中的液體培養(yǎng)物中，暴露于各種濃度的隱杯傘素2小時，用[3H]-胸苷脈沖1～2小時，在玻璃過濾器上采集。將濾紙加入含有閃爍液體的小瓶中，在β(閃爍)計數(shù)器中測定殘留放射性。
在篩選其他固體腫瘤細(xì)胞系對隱杯傘素S的敏感性時，乳腺細(xì)胞MCF-7被注意到是明顯敏感的(圖1)。發(fā)現(xiàn)在我們實驗室保存的另一乳腺細(xì)胞系MDA-231對隱杯傘素S也明顯敏感(附圖1)。
用脫氫隱杯傘素M研究表明該類似物對骨髓白血病細(xì)胞和乳腺癌系MCF-7和MDA-231顯示出選擇性毒性(表1)表1在暴露于毒素2小時后(N-3)通過抑制胸苷驗證的隱杯傘素S和脫氫隱杯傘素M的組織特異細(xì)胞毒性IC50(nM/L)化合物隱杯傘素S脫氫隱杯傘素MHL60，骨髓 7±1 246±198392，B-細(xì)胞236±31 ＞38,0008402，T-細(xì)胞669±196 ＞38,000242，黑瘤 607±70 ＞38,000547，卵巢 607±110 ＞38,000SL-2，鼠(胸腺) 142±15 5,235±277MCF-7，乳腺 58±5 653±65MDA-231，乳腺 2.0±0.2 112±17由于預(yù)先的研究表明，CEM mdr變異體對隱杯傘素S無抗藥性，因此，研究了若干其他mdr細(xì)胞類型對隱杯傘素S和脫氫隱杯傘素M的敏感性。這些mdr子細(xì)胞系顯示出對多種常規(guī)藥物化學(xué)治療藥物的抗藥性增加了200至800倍，但對隱杯傘素S或脫氫隱杯傘素M顯示出很小的或沒有抗藥性(表2)。因此，聯(lián)結(jié)或未聯(lián)結(jié)gp170蛋白質(zhì)的mdr細(xì)胞對隱杯傘素毒性仍是敏感的。這些研究表明，隱杯傘素的新的結(jié)構(gòu)具有在多種藥物抗藥性的造血細(xì)胞系中相對非交叉的抗藥性。隱杯傘素、脫氫隱杯傘素M的衍生物比原來的隱杯傘素化合物毒性略低，但結(jié)果(表2)表明，在各種mdr細(xì)胞系中對該化合物沒有交叉抗藥性。
研究隱杯傘素S和脫氫隱杯傘素M對L1210、鼠骨髓CFU-gm和C1498(AML細(xì)胞系)的效果。隱杯傘素S是試驗中試驗過的化合物中最有效的藥物，在L1210和AML白血病系之間和CFU-gm區(qū)域位點之間顯示最大的差別效果(表3)。衍生物，脫氫隱杯傘素M，雖然毒性較低，但對AML系明顯地更有選擇性。其在對CFU-gm細(xì)胞沒有作用的濃度下抑制了AML菌落形成(表4)。
表2不同Mdr系對隱杯傘素S的敏感性可得到的MDR 細(xì)胞系隱杯傘素S脫氫隱杯傘素MCEM變異體 母體 8.3±2.6ntVM-1 16.2±6.4 ntAraC 14 ntVLB100(gp170+) 3.7±0.7ntDox(gp170+) 14MDA-231(乳腺) 母體 0.85±0.23 54±73-1(gp170+) 0.89±0.38 58±11MCF7-wt(乳腺) 母體 0.88±0.11 92±15ADR(GSH- 3.7±0.468±15轉(zhuǎn)移酶)HL-60 母體 3.1±1.1163±11ADR(gp150+) 1.9±0.8191±44KB變異體 母體 0.58±0.12 125±14C-1(gp170+) 0.69±0.15 80±18VBL(gp170+) 0.69±0.11 78±19L1210 母體 0.42±0.08 62±8DDPt(順氯氨鉑) 0.46±0.12 119±39BCNU 0.58±0.08 100±31PAM(苯丙氨酸氮芥)0.62±0.15 73±31CPA(環(huán)磷酰胺)0.46±0.12 38±15
表3隱杯傘素S對生長的抑制隱杯傘素S濃度抑制區(qū)域(ug/盤)L1210Go結(jié)腸382.50500240301.2540070 00.6332030 0表4隱杯傘素對菌落形成的作用區(qū)域大小化合物稀釋度L1210CFU-GMC1498(AML)隱杯傘素S 1/1,000850400 ＞10001/4,000600200 8001/16,000 55005501/64,000 3000250脫氫隱杯傘素M 1/25 400200 ＞10001/125 200100 7501/125(重復(fù))30050 7001/625 1000400
實施例IV結(jié)構(gòu)功能研究用合成的隱杯傘素衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能研究，檢查其對于HL60白血病細(xì)胞的體外毒性(表5)。該研究確定了對于隱杯傘素毒性來說三個關(guān)鍵的位置。這些包括環(huán)丙烷環(huán)(位置A)、α/β不飽和鍵位置(位置B)和酮基(位置C)(附圖2)。這些位置中任一的替換會導(dǎo)致毒性多達(dá)4log的下降。與之相反，非環(huán)伯羥基(附圖2，位置D)對毒性不起作用。各種大的化學(xué)基因可接連于該位置而不會改變毒性。許多明顯降低毒性(與隱杯傘素S或M相比較)的衍生物比起常規(guī)的化學(xué)治療藥物如BCNU或順氯氨鉑更有效(表5)。
表5與在HL-60細(xì)胞中其他藥物相比各種隱杯傘素衍生物的IC50化合物 nM隱杯傘素S或M 10二氫隱杯傘素S或M 100,000?；幌?500脫氫隱杯傘素M(二酮) 246異隱杯傘素M 3,800Ptaquiloside 7,000蕨素C12,5002，5，6，7-四甲基茚酮475隱杯傘素甲苯磺酸酯 38DNA聚合酶抑制劑Aphidocolin 2,100烷基化劑BCNU 23,300交聯(lián)劑順氯氨鉑 550±14烷基化劑MNNG 15,000蛋白質(zhì)合成抑制劑蓖麻蛋白 0.2
實施例V結(jié)構(gòu)功能研究化學(xué)隱杯傘素M易轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的芳族化合物(用稀HCl處理)，其在細(xì)胞培養(yǎng)研究中是超過1000倍的低的毒性。氯-碳鍵的形成、環(huán)丙烷環(huán)打開和叔羥基的除去(例如水)是同步的。形成的中間體可通過反應(yīng)混合物NMR譜檢測到(附圖3)。然而，該中間體是十分活潑的，通過與第二個親核試劑即水，反應(yīng)迅速轉(zhuǎn)化為苯酚。于是，在酸性條件下，隱杯傘素M顯然是雙官能的。
上述研究表明，隱杯傘素類的毒性與其叔羥基易于被除去和環(huán)丙烷環(huán)易于打開有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，隱杯傘素的毒性取決于環(huán)丙烷基(位置A，附圖2)、兩個雙鍵(共軛二烯)(位置B)和酮(位置C)的結(jié)合的效果。假設(shè)在五元環(huán)中仲羥基氧化成酮通過分子內(nèi)的進(jìn)一步的電子離域作用會改變分子的效力或選擇性。新的酮基起到“電子槽”的作用，以致環(huán)丙烷C-C鍵的電子向酮離域，而不是向著帶有叔羥基的碳原子離域。這意味著，由于碳-氧(叔羥基的氧)鍵斷裂形成的最初的碳陽離子不如隱杯傘素M的情況下穩(wěn)定。因此，碳-氧鍵斷裂是不夠有利的，反應(yīng)活性被降低。稱之為脫氫隱杯傘素M的酮衍生物被合成，其比隱杯傘素S或M對體外HL-60細(xì)胞是較低毒性的(表4)。如上文討論的，脫氫隱杯傘素M的毒性呈現(xiàn)出對體外骨髓和乳腺癌細(xì)胞的相對選擇性(附圖1和表1)。
隱杯傘素M和脫氫隱杯傘素M與稀HCl的反應(yīng)動力學(xué)結(jié)果是與上述假設(shè)相一致的。在稀HCl中，隱杯傘素M進(jìn)行假設(shè)的一級反應(yīng)(k＝4.7×10-3分-1，t1/2＝148分鐘)。脫氫隱杯傘素M也證實了一級反應(yīng)動力學(xué)，但該反應(yīng)相當(dāng)緩慢(k＝2×10-4分-1，t1/2＝2765分鐘)。在與脫氫隱杯傘素M的反應(yīng)中，通過NMR譜未檢測到中間體。大概它形成太慢，并且存在時間太短難以檢測到。由脫氫隱杯傘素M顯示出的較低反應(yīng)性，我們認(rèn)為它在與親核試劑反應(yīng)中是更有選擇性的，因此，與隱杯傘素M相比具有較低的毒性。
我們還研究了隱杯傘素與天然存在的親核試劑，谷胱甘肽的反應(yīng)。在pH3至pH9的寬pH范圍中，谷胱甘肽自發(fā)地與隱杯傘素M、隱杯傘素S或脫氫隱杯傘素M反應(yīng)，產(chǎn)生的產(chǎn)物類似于隱杯傘素M和HCl的反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)速率在pH 6.1～7.0最佳，表明反應(yīng)可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。
隨后研究隱杯傘素對乳腺細(xì)胞癌系MCF7-wt和它的MDR抗藥性子系MCF-Adr的毒性。gp170負(fù)子細(xì)胞系在谷酰甘肽轉(zhuǎn)移酶增加50倍的基礎(chǔ)上是抗藥性的，其導(dǎo)致對常規(guī)化學(xué)治療藥物的敏感性降低200～800倍，該系還顯示谷胱甘肽含量降低了4.1倍。與用其他藥物可見到的200～800倍相比，該子系顯示對隱杯傘素S的敏感性降低4.2倍(母體IC500.88nmol/l；子系3.70nmol/l)。對隱杯傘素抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的能力的動力學(xué)研究表明，不存在酶活性的直接抑制。這些研究結(jié)果表明，盡管隱杯傘素毒性與分子內(nèi)谷酰甘肽含量成反比，但它與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性無關(guān)。
實施例VI動物研究使用Leonard，J.E.等人在Cancer Res.472899-02(1987)和Dillman，R.O.等人在Cancer Res.455632-36(1985)(均列為本文的參考文獻(xiàn))中所述的方法，在四周齡的無胸腺Balb/C的nu/nu小鼠中建立Molt-4(人T細(xì)胞白血病)異種移植。經(jīng)3周總體劑量輻射(600 cGy)后，在小鼠腹邊皮皮下注射Molt-4細(xì)胞和放射的(6000 cGy)HT-1080喂養(yǎng)細(xì)胞。兩只動物僅接受放射的HT-1080喂養(yǎng)細(xì)胞以確保這些細(xì)胞不會誘導(dǎo)腫瘤。監(jiān)測動物的Molt-4腫瘤發(fā)育，在腫瘤摸得出時(在5-7天約4×4mm)，如上所述小鼠隨機分成5只一組。對照的小鼠在腹膜內(nèi)接受鹽水，治療的小鼠則腹膜內(nèi)接受300μg/kg隱杯傘素S、或30或300μg/kg脫氫隱杯傘素M，每周兩次。在得到隱杯傘素S的小鼠中，腫瘤生長延緩(圖4)。
與之相反，在以30μg/kg的低劑量接受脫氫隱杯傘素M(該化合物后來被發(fā)現(xiàn)以60000μg/kg每周腹膜內(nèi)給藥兩次時對小鼠是無毒性的)的裸鼠中，5只中的3只腫瘤完全消退，但另2只腫瘤沒有起反應(yīng)(附圖5)。采集兩個明顯抗藥性的腫瘤，進(jìn)行對隱杯傘素S和脫氫隱杯傘素M的抗藥性的體外試驗。沒有對兩種化合物有抗藥性的跡象。兩個完全應(yīng)答者在隨后12周的時間內(nèi)沒有腫瘤消退的跡象。
使用不同來源的無胸腺裸鼠，重復(fù)這些實驗。在這些研究中，隱杯傘素對腫瘤生長幾乎沒有作用。其原因是，對Molt-4異種移植應(yīng)答的變異性的原因可能與脫氫隱杯傘素M的低劑量、動物之間對谷胱甘肽代謝的變異或藥物分布有關(guān)。
脫氫隱杯傘素M的效率隨后在使用鼠SL-2細(xì)胞的同基因模型中篩選。將SL-2白血病/淋巴瘤細(xì)胞皮下注射，使之轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、脾臟和肺，在該模型中藥物效率用增加壽命(ILS)測定。SL-2細(xì)胞以每動物2.5百萬細(xì)胞給藥，處理持續(xù)7天直到腫瘤可摸得出。這是一種對已建立的腫瘤的相對嚴(yán)格試驗，并與在SL-2模型中的常規(guī)藥物篩選作對比，在常規(guī)藥物篩選中，通常使用0.5百萬的細(xì)胞，從3天起開始藥物處理，脫氫隱杯傘素M在以30mg/kg每周腹膜內(nèi)給藥兩次，幾乎沒有效果，ILS為5％，在以60mg/kg每周腹膜內(nèi)給藥兩次，ILS為18％。如以0.03mg/kg每周靜脈內(nèi)給藥兩次，ILS增加至38％。這說明，該藥物由肝臟代謝，在靜脈給藥時更有效。
在體內(nèi)實驗進(jìn)行過程中，體外實驗結(jié)果已經(jīng)得出隱杯傘素的組織特異性取決于活性能量依賴泵的存在，研究SL-2和Molt-4細(xì)胞，確定其不存在攝入機制。因而，研究轉(zhuǎn)向用于骨髓譜系細(xì)胞的異種移植模型。
由Theodore Brightman博士的實驗室(NCT)得到在裸鼠中無需動物照射能夠作為異種移植生長的人HL-60細(xì)胞。這些細(xì)胞稱之為HL-60MRI細(xì)胞，被證實具有能量依賴攝入泵，由于其母體細(xì)具有這種泵該發(fā)現(xiàn)并非出人意料。在脫氫隱杯傘素M以一周兩次腹膜內(nèi)給藥時，誘發(fā)與劑量有關(guān)的腫瘤抑制(附圖6)。在這些研究中，脫氫隱杯傘素M的MTD腹膜內(nèi)劑量達(dá)到每周腹膜內(nèi)劑量表的2劑量。對靜脈內(nèi)給藥脫氫隱杯傘素M已觀察到類似的腫瘤消退。
在共同研究中，再次研究脫氫隱杯傘素M的體內(nèi)作用。最初研究化合物對L 1210細(xì)胞的作用。每天腹膜內(nèi)給藥劑量2.5mg/kg持續(xù)5天，導(dǎo)致僅9％ ILS。隨后脫氫隱杯傘素M以24小時靜注(5.0mg/kg)給藥，ILS為11％。在我們開始認(rèn)識在人骨髓瘤細(xì)胞中存在依賴于能量的攝入后，就脫氫隱杯傘素M對于同基因小鼠AML模型的體內(nèi)效率進(jìn)行篩選，使用C 1498細(xì)胞和單次大劑量隱杯傘素S，腹膜內(nèi)給藥2.5mg/kg，得到ILS 35％。使用同樣劑量的二次試驗，每天腹膜內(nèi)給藥一次，持續(xù)5天，得到ILS 44％。當(dāng)動物能忍受每周兩次60mg/kg(腹膜內(nèi))或1mg/kg(靜脈內(nèi))(尾靜脈)給藥，持續(xù)4周而沒有明顯的失重和食物/水?dāng)z入的下降，可以進(jìn)一步優(yōu)化劑量和治療程序。
實施例VII用?；幌┖兔摎潆[杯傘素M的HL60/MRI小鼠實驗在三十只小鼠在肩部皮下注射500,000HL 60/MRI細(xì)胞(人骨髓白血病腫瘤細(xì)胞)。在第11天開始治療，而不是馬上進(jìn)行治療。開始治療的延遲是嚴(yán)格試驗，以確定化合物是否有效。通過延遲治療，腫瘤細(xì)胞被牢固地建立。
將小鼠分成6組，5只一組。一組是對照組，這些動物接受空白對照劑，該溶液用于稀釋試劑。其他組接受如下化合物和劑量脫氫隱杯傘素M化合物，1.0mg/kg；脫氫隱杯傘素M，3.0mg/kg；?；幌?.3mg/kg；?；幌?，1.0mg/kg；?；幌?，3.0mg/kg。所有動物用尾靜脈靜脈注射空白對照劑或藥物?？瞻讓φ談┗蛩幬镆恢芙o藥兩次。
結(jié)果概括于附表6。脫氫隱杯傘素M和酰基富烯化合物對抑制腫瘤生長都是有效的，并顯示出依賴于劑量的抑制(給藥的藥物愈多，腫瘤生長愈少)。接受最高量的每一種藥物的動物未顯示任何有害效果的跡象，如食物或水?dāng)z入下降，或統(tǒng)計學(xué)上體重明顯降低。這些結(jié)果表明，每一種藥物可以較高的劑量給藥，此外，還表明藥物可以更有效的劑量程序例如每日給藥。
表6概括HL60/MRI 實驗， 靜脈 -#1總腫瘤重量[Mg]第11天第18天第25天第32天第40天對照組無藥物99±3 6845±2823299±108010162±4123 16747±5061脫氫隱杯傘素M1mg/kg114±55883±3112274±992 6025±1772 11507±3707IV3mg/kg101±40911±3092127±10922854±1260 4784±2303IV?；幌?.3mg/kg 73±38 540±1671352±520 3204±1147 9501±4605IV1mg/kg58±32 582±297964±685 2321±1434 6275±28653mg/kg38±30 369±250336±215 437±238 1201±501實施例VIII一般體外篩選方法和細(xì)胞攝入研究與上文中實施例的建議和我們的對隱杯傘素作用和組織特異性的機制的認(rèn)識相一致，其它骨髓白血病細(xì)胞系用快速隱杯傘素攝入進(jìn)行篩選(KG1、KG1a、HEL、K562、OCI-M1、AML-193)。
用于體外篩選隱杯傘素化合物的方法在上述的實施例中作了詳細(xì)說明。新的類似物對細(xì)胞系的細(xì)胞毒性首先用生長或半固體菌落形成試驗和胸苷摻入的抑制在5log范圍內(nèi)評價。使用胸苷摻入的抑制是因為早先的研究表明胸苷摻入優(yōu)先被隱杯傘素抑制，并與細(xì)胞死亡密切相關(guān)。對正常骨髓先祖和各種細(xì)胞系包括各種白血病、B和T細(xì)胞和固體腫瘤(黑瘤、卵巢瘤)進(jìn)行篩選類似物。
脫氫隱杯傘素M對各種細(xì)胞系包括MDR系的體外試驗也可用DNA修復(fù)缺陷細(xì)胞系和正常骨髓先祖進(jìn)行?？芍苽涓鞣N其他類似物。由于這些類似物將改變已知的活性位置，他們被預(yù)期產(chǎn)生相似的腫瘤抑制。用于這些類似物的篩選研究可包括各種mdr細(xì)胞(以確保不發(fā)生交叉抗藥性)和DNA修復(fù)缺陷細(xì)胞系。
體外試驗也可研究其他乳腺細(xì)胞系的敏感性，以確定是否它們也優(yōu)先對隱杯傘素S、脫氫隱杯傘素M和富烯類似物敏感。
實施例IX在腫瘤細(xì)胞中隱杯傘素攝入的試驗盡管人骨髓腫瘤細(xì)胞對隱杯傘素是敏感的，但它們的正常前體，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞形成單元，對隱杯傘素的相對抗藥性是1.5～2.0log表明在某些正常骨髓細(xì)胞中不存在傳遞系統(tǒng)，提供了一個安全的治療范圍。
特定的隱杯傘素S攝入用相對敏感的HL60細(xì)胞和抗藥性的B細(xì)胞進(jìn)行試驗。在37℃，HL60骨髓白血病細(xì)胞顯示隱杯傘素S的迅速攝入，而相對不敏感的8392B細(xì)胞顯示較小的藥物摻入(附圖7)。隱杯傘素在B細(xì)胞系中的細(xì)胞內(nèi)累積是緩慢和線性的，持續(xù)7小時(r-0.984)，在此時，細(xì)胞內(nèi)濃度接近保溫混合物的濃度。與之相比，HL60細(xì)胞迅速累積毒素，細(xì)胞內(nèi)累積在一小時內(nèi)達(dá)到平穩(wěn)期。暴露于10nM隱杯傘素S的HL60細(xì)胞濃縮毒素19倍，而B細(xì)胞不主動地濃縮毒素。被HL60細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)快速累積的隱杯傘素S在高濃度下飽和(附圖8)。與之相比，隱杯傘素S在8392B細(xì)胞中的累積仍然依賴于濃度。在變化的濃度下隱杯傘素S被HL60細(xì)胞的最初攝入的分析顯示隱杯傘素S的流入量符合Michaelis-Menton飽和動力學(xué)(附圖9)。HL60細(xì)胞的Vmax是27Picomole/min/mg蛋白質(zhì)，Km是4.2μM。這表明HL60細(xì)胞有很高的隱杯傘素的傳遞能力，因為隱杯傘素的Vmax是葉酸鹽(一種細(xì)胞所需的維生素)的Vmax的5倍。
冷的(4℃)1％疊氮化物和代謝阻斷劑α-脫氧葡萄糖和抗霉素A均阻斷隱杯傘素S攝入HL60細(xì)胞中，但對不敏感的8392B細(xì)胞幾乎沒有作用(表7)。這些研究表明，隱杯傘素S通過依賴于能量的傳遞系統(tǒng)傳遞和濃縮于HL60細(xì)胞中，而僅僅通過擴散(被動的或不需要能量的傳遞)傳遞至不敏感的B細(xì)胞中。MCF 7乳腺瘤細(xì)胞也顯示冷卻抑制攝入。依賴于能量的傳遞機制的發(fā)現(xiàn)解釋了為什么骨髓和乳腺腫瘤細(xì)胞在短的暴露時間內(nèi)對隱杯傘素如此敏感，而B細(xì)胞則不敏感。
表7與8392B細(xì)胞比較[3H]隱杯傘素S被HL60骨髓的攝入每小時最大攝入(picomoles)a條件HL608392MCF737℃ 75±16b5.5±1.4 29±44℃ 4.3±0.9 3.4±1.0 4.0±2.11％疊氮化物 8.7±1.4 4.3±1.3 NTb2-脫氧葡萄糖δ 16.7±3.5 3.6±1.4 NT抗霉素A
如上述方法將細(xì)胞暴露于100ng/ml的[3H]-標(biāo)記的隱杯傘素S1小時并采集。結(jié)果用平均±SE表示，并表示3次實驗。a每千萬細(xì)胞bNT＝未測試實施例X2，5，6，7-四甲基-1-二氫茚酮和蕨素化合物的合成和結(jié)構(gòu)首先通過制備1，2，3-三甲基苯和甲基丙二酰氯在二硫化碳中的溶液，然后在兩小時內(nèi)滴加三氯化鋁合成2，4，5，6-四甲基-2，3-二氫-1，3-茚二酮(indanione)。將混合物回流2小時，加入碎冰，用氯仿提取三次。合并的提取物用鹽水洗滌、干燥和除去溶劑得到殘余物，其用色譜法純化，用1％乙酸乙酯的苯溶液洗脫。除去溶劑和用升華提純得到所需的產(chǎn)物。
2，5，6，7-四甲基-1-二氫茚酮通過用鋅粉在50℃還原2，4，5，6-四甲基-2，3-二氫-1，3-茚二酮制備。產(chǎn)物用色譜法純化，用1％乙酸乙酯的苯溶液洗脫得到兩個異構(gòu)體。主要的異構(gòu)體用10％氫氧化鉀處理，隨后用升華提純，化合物有如下結(jié)構(gòu) 脫氫蕨素O合成將3-乙酰氧基-6-(β-甲氧基)乙基-2，5，7-三甲基-2，3-二氫-1-茚酮溶解于四氫呋喃和10％氫氧化鉀中，并回流2小時。溶液隨后用乙醚提取三次，合并的提取液用色譜法純化，用2％乙酸乙酯的苯溶液洗脫，得到脫氫蕨素O化合物。該有如下結(jié)構(gòu)； R＝H，脫氫蕨素BR＝CH3，脫氫蕨素O兩個化合物在體外對細(xì)胞是毒性的，具有抗真菌性質(zhì)。
實施例XI酰基富烯類似物的合成許多具有抗腫瘤活性所需的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征的?；幌╊愃莆锟捎呻[杯傘素S制備或由簡單的前體經(jīng)全合成制備。隱杯傘素S通過Omphalotus illudens發(fā)酵制備。將該化合物溶解于水并加入稀H2SO4后，將其轉(zhuǎn)化為?；幌?R1＝H，R2＝H，R3＝CH3)，產(chǎn)率55％。由?；幌┩ㄟ^R2取代基的改變得到大量的類似物，例如，R2＝羥甲基、溴、碘、氯、氟、硝基、對羥基芐基、對甲氧基芐基。R2也可以是多核或雜環(huán)芳基。

R1基團(tuán)可以是?；蛲榛?。帶不同R3基團(tuán)(和R2基團(tuán))的類似物也可按下圖概述的方法的全合成法制備。 1，1-二乙酰基環(huán)丙烷與適當(dāng)取代的環(huán)戊二烯衍生的二陰離子的醇醛縮合得到中間體，其迅速轉(zhuǎn)化為?；幌?。其可以是各種化合物，因為R2和R3可以是烷基，芳基或取代的烷基或芳基。
?；幌┑暮铣?。將2g(9.2mmol)隱杯傘素S溶解于700ml水中，隨后加入4M H2SO4(236ml)。將溶液攪拌過夜，用乙酸乙酯提取。有機相用飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌，用MgSO4干燥并濃縮。用硅膠色譜分離，用己烷和乙酸乙酯洗脫，得到0.82g?；幌?50％)。1H NMR δ0.73至1.50(m，4H)，1.38(s，3H)，2.00(s，3H)，2.15(s，3H)，3.93(s，1H)，6.43(s，1H)，7.16(s，1H)；MSm/Z 216(M+)，202(M+-CH2)，188(M+-CH2CH2)，173(M+-2CH2-CH3)，170(M+-2CH2-H2O).UV 325nm(8.3×103)，235nm(16.6×103)?；衔镉腥缦陆Y(jié)構(gòu) 6-羥甲基富烯的合成。將?；幌?550mg，2.5mmol)溶解于40ml THF中，加入30％甲醛-水溶液(40ml)。加入4NH2SO4溶液(26.4ml)使最終H2SO4的濃度為1N。將溶液攪拌過夜，并用乙酸乙酯提取。有機相用飽和NaHCO3溶液、水和鹽水洗滌，用MgSO4干燥。用硅膠色譜分離，用己烷和乙酸乙酯洗脫，得到400mg羥甲基富烯(64％)。
1H NMR δ 0.72 to 1.48(m，4H)，1.38(s，3H)，2.15(s，3H)，2.19(s，3H)，3.90(s，1H)，4.66(d，J＝2.1Hz，2H)，7.10(s，1H)。MS m/Z 246(M+)，228(M+-H2O)，218(M+-CH2CH2)，186(M+-CH3-CH2-CH2-OH)，185(M+-H2O-C2-CH2-CH3)。UV 233nm(1.0×104)，325nm(7.7×103)?；衔镉腥缦陆Y(jié)構(gòu)
碘富烯。向酰基富烯(60mg，0.28mmol)在15ml CH2Cl2中的溶液中加入三氟乙酸銀(63mg，0.29mmol)。在0℃滴加碘(70.5mg，0.28mmol)在8ml CH2Cl2中的溶液?；旌衔镌谠摐囟认聰嚢?小時，然后通過硅藻土過濾，用乙醚洗脫。濃縮濾液得到碘富烯，紅色膠狀物(73mg，77％)。
1H NMRδ0.76 to 1.54(m，4H)，1.38(s，3H)，2.14(s，3H)，2.36(s，3H)，3.87(s，1H)，7.16(s，1H).MS m/z 342(M+)，314(M+-CH2CH2)，299(M+-CH2CH2-CH3)，29 6(M+-CH2CH2-H2O)，215(M+-I)，187(M+-I-CH2CH2)，127(I+)?；衔镉腥缦陆Y(jié)構(gòu) 溴富烯。將?；幌?60mg，0.28mmol)在0℃溶解于9ml乙腈中。加入N-溴琥珀酰亞胺(50mg，0.28mmol)，混合物在該溫度下攪拌3.5小時。用水急冷反應(yīng)物，用乙醚提取產(chǎn)物。乙醚層用水和鹽水洗滌，用MgSO4干燥。經(jīng)色譜法分離得到溴富烯，橙色晶體(77mg，94％，用乙酸乙酯-己烷重結(jié)晶，m.p.92-94℃)。
1H NMR δ 0.75 to 1.55(m，4H)，1.40(s，3H)，2.12(s，3H)，2.33(s，3H)，3.89(s，1H)，7.15(s，1H).MSm/Z 295(M+)，293(M+-2)，267，265，(M+-CH2CH2)，252，250(M+-CH2CH2-CH3)，249，247(M+-CH2CH2-H2O)，215(富烯-1)?；衔镉腥缦陆Y(jié)構(gòu) 對羥基芐基富烯。將苯酚(40mg，0.4mmol)加入在無水CH2Cl2(25ml)中的羥甲基富烯(70mg，0.28mmol)溶液中。將混合物冷卻至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(0.3ml，2.7mmol)。反應(yīng)物在該溫度下攪拌1小時，加水急冷反應(yīng)物。有機層用H2O、NaHCO3和鹽水洗滌，用MgSO4干燥。用硅膠色譜法分離，用己烷-乙酸乙酯洗脫，得到90mg(98％)紅色結(jié)晶體(m.p.143-144℃)。
1H NMRδ0.59-1.43(m，4H)，1.36(s，3H)，1.76(s，3H)，2.07(s，3H)，3.95(s，1H)，3.97(d，J＝7.2Hz，2H)，4.83(s，1H)，6.74(d，J＝8.4Hz，2H)，6.91(d，J＝8.4Hz，2H)，7.22(s，1H)。MS m/Z 322(M+)，294(M+-2CH2)，279(M+-2CH2-CH3)，251(M+-2CH2-CH3-CO)，215，107。UV 228nm(1.2×104，在243和262nm轉(zhuǎn)折)，325(7.1×103)，410nm(2.6×103)。化合物有如下結(jié)構(gòu) 對甲氧基芐基富烯。將苯甲醚(0.04ml，0.37mmol)加入在無水CH2Cl2(5ml)中的羥甲基富烯(10mg，0.04mmol)溶液中。將混合物冷卻至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(0.04ml，0.36mmol)。反應(yīng)物在該溫度下攪拌1小時，加水急冷反應(yīng)物。有機層用H2O、飽和NaHCO3和鹽水洗滌，用MgSO4干燥。濃縮溶液得到殘余物，其經(jīng)真空干燥以定量產(chǎn)率得到產(chǎn)物(14mg)。1H NMRδ0.59-1.40(m，4H)。1.36(s，3H)，1.76(s，3H)，2.07(s，3H)，3.7 8(s，3H)，3.95(s，1H)，3.99(d，J＝16.12Hz，2H)，6.81(d，J＝8.8Hz，2H)，6.96(d，J＝8.3Hz，2H)，7.22(s，1H)。MS m/Z 336(M+)，3 08(M+-CH2CH2)，215，121((CH2-ph-OCH3)+)。UV 410nm(2.7×103)，325nm(7.0×103)，267nm(1.0×104)，245nm(轉(zhuǎn)折)，226nm(1.9×104)，203nm(1.4×104)?；衔镉腥缦陆Y(jié)構(gòu) 實施例XII?；幌╊愃莆锏捏w外細(xì)胞培養(yǎng)研究用細(xì)胞培養(yǎng)試驗進(jìn)行的體外測試表明6-羥甲基酰基富烯、溴?；幌┖偷怩；幌╊愃莆飳δ繕?biāo)腫瘤細(xì)胞HL60和MV522在2和48小時暴露時間明顯地是毒性的(表8和表9)。相對毒性比(2和48小時毒性)顯示這些類似物在體內(nèi)比母體隱杯傘素S化合物或在原先的專利申請中描述過的類似物更有效。
表8與原先的類似物和隱杯傘素S比較新類似物的2小時細(xì)胞毒性(由胸苷摻入的抑制測定)2小時IC50值(nmol/L)HL60細(xì)胞8392細(xì)胞MV522隱杯傘素S 10±1 236±22 19±6脫氫隱杯傘素M 377±81 61,335±9,8101,826±378酰基富烯 998±24466,435±13,006 727±1806-羥基甲基?；幌?150±11 7,359±2,096 114±286-HMAF的乙酸酯類似物 3,333±192 47,455±2,9511,066±87溴酰基富烯 803±88 17,175±890 4,180±424碘?；幌?2,602±345 10,331±497 956±152對羥基芐基富烯 264±38 95,236±11,984 1,180±180對甲氧基芐基富烯 1,964±84 35,714±7,2922,045±208
表9與原先的類似物和母體隱杯傘素S化合物比較新類似物的48小時細(xì)胞毒性4848小時IC50值(nmol/L)HL60細(xì)胞8392細(xì)胞MV522隱杯傘素S 3±18±2 4±1脫氫隱杯傘素M 296±66 269±100 313±23?；幌?64±74 833±152 349±236-羥基甲基酰基富烯 4±176±4 73±86-HMAF的乙酸酯類似物806±30 4,434±163 486±42溴?；幌? 412±21 1,186±138 356±61碘酰基富烯 290±12 1,696±183 556±47對羥基芐基富烯 382±39 11,078±388615±56對甲氧基芐基富烯1,051±104 7,143±244 1,548±214
實施例XIII體內(nèi)研究根據(jù)這些體外篩選結(jié)果，選擇類似物之一，6-羥甲基?；幌┻M(jìn)行體內(nèi)研究以確定該類似物是否確實比酰基富烯更有效。異種移植物是人肺腺癌MV522，因為它是對常規(guī)抗癌藥的非應(yīng)答模型，通過轉(zhuǎn)移殺死(不是局部腫瘤侵襲)。常規(guī)抗癌藥物，順氯氨鉑、紫杉酚、絲裂霉素C、亞德里亞霉素以及隱杯傘素S被選作對照藥物。對照組包括僅接受用于溶解藥物的溶劑，40％二甲基亞砜/生理鹽水混合物(40％DMSO/NS)。6-羥甲基?；幌╊愃莆飳嶋H上誘導(dǎo)動物腫瘤的消退。以前在此模型中從未顯示腫瘤被抗癌藥物實際的消退。通過常規(guī)的抗癌藥物或隱杯傘素S未抑制腫瘤生長(附圖10)。動物僅接受9劑量的6-羥甲基?；幌╊愃莆?，在這些動物中沒有毒副作用的跡象，如活力、體重、食物攝入或水?dāng)z入的降低。與對照(DMSO/NS)治療的動物比較，順氯氨鉑、紫杉酚、絲裂霉素C和亞德里亞霉素治療的動物沒有明顯地增加壽命。隱杯傘素S實際上引起早熟性死亡(藥物毒性)(表10)。6-羥基甲基?；幌┲委煹膭游锉葘φ?DMSO/NS處理的)、順氯氨鉑、紫杉酚、絲裂霉素C和亞德里亞霉素治療的動物存活時間明顯地長(對于所有組，P＜0.001)(表10)。
表10與其他藥物比較，在人肺腺癌，MV522轉(zhuǎn)移肺腫瘤模型中-羥甲基?；幌╊愃莆锏男?第一次實驗藥物壽命對照 DMSO/NS IP 3X/WK 100±7％順氯氨鉑 3.2mg/kg IP 1X/WK102±8％紫杉酚4.0mg/kg IP 5X/WK100±10％絲裂霉素c 2.4mg/kg IP 1X/WK111±2％亞德里亞霉素 2.6mg/kg IP 1X/WK98±12％隱杯傘素S 2.5mg/kg IP 3X/WK＜26％[在僅3劑量時/5死亡]6-羥甲基酰基富烯 10mg/kg IP 3X/WK233±18％用不同劑量的6-羥甲基?；幌╊愃莆镏貜?fù)實驗以確定是否存在劑量應(yīng)答模式。再次包括紫杉酚和低劑量隱杯傘素S作為對照藥物(表11)。并再次包括僅接受藥物溶劑(40％DMSO/NS)的對照組。在10mg/kg時同樣顯示腫瘤的消退，在1和5mg/kg治療時顯示出腫瘤生長的抑制。紫杉酚和低劑量S同樣不能抑制腫瘤生長(附圖11)。在第二次實驗中，和對照組(40％DMSO/NS治療的動物)比較，紫杉酚和隱杯傘素S治療的動物的壽命沒有明顯增加。10mg/kg 6-羥甲基酰基富烯和5mg/kg 6-羥甲基?；幌┲委煹膭游锉葘φ战M(DMSO/NS治療)、紫杉酚或隱杯傘素S治療的動物存活時間明顯地長。與對照組、紫杉酚治療的和隱杯傘素S治療的動物相比較，10mg/kg 6-羥甲基?；幌┲委煹膭游锏母怕?或顯著性)值在每種情況下小于0.001(p＜0.001)。與對照組、紫杉酚治療的和隱杯傘素S治療的動物比較，5mg/kg 6-羥甲基?；幌┲委煹膭游锏母怕手翟诿糠N情況下也小于0.001(p＜0.001)。1mg/kg 6-羥甲基?；幌┲委煹膭游锏拇婊顣r間也明顯長于對照組(p＜0.01)。
表11與其他藥物比較，在人肺腺癌MV522轉(zhuǎn)移肺腫瘤模型中6-羥甲基?；幌╊愃莆锏男?第二次實驗藥物壽命對照組 DMSO/NS IP 3X/WK 100±16％(根據(jù)定義為100％)紫杉酚 4.0 mg/kg IP 5X/WK 120±10％(不明顯)隱杯傘素S0.25mg/kg IP 3X/WK 104％±20％6-羥甲基酰基富烯 10mg/kg IP 3X/WK232±20％6-羥甲基?；幌?5mg/kg IP 3X/WK154±13％6-羥甲基酰基富烯 1mg/kg IP 3X/WK135±10％第三次重復(fù)實驗(表12)。腹膜內(nèi)給藥的紫杉酚的量增加至最高劑，并加入皮下給藥的劑量，因為據(jù)報導(dǎo)，該途徑會更有效。再次包括亞德里亞霉素和絲裂霉素C。在本實驗中包括了兩個新的?；幌┭苌?碘酰基富烯衍生物和對-羥基芐基富烯)。包括二酮類似物以說明6-羥甲基?；幌┑拿黠@改善。與對照組和所有其他藥物治療的動物比較，6-羥甲基?；幌┟黠@地增加壽命。與所有對照組、絲裂霉素C治療組、亞德里亞霉素治療組和兩個紫杉酚治療組比較，6-羥甲基酰基富烯的概率值(或顯著性值)小于0.0005(p＜0.0005)。這是極其明顯的效果。重要的是已表明，根據(jù)2只特殊動物的壽命長，存在它們可被治愈的可能性。盡管與對照組(p＜0.002)和其他藥物治療動物比較，二酮也顯著增加了壽命，但它不如6-羥甲基?；幌┯行?。注意高劑量紫杉酚治療的動物(6mg/kg，IP)的壽命不僅低于在上述實驗中4mg/kg紫杉酚治療的動物的壽命，而且還低于未治療的或?qū)φ战M的動物的壽命。這表明紫杉酚的最大劑量已達(dá)到，在此時藥物毒性殺死了動物。其他新的類似物，溴?；幌┖蛯αu基芐基富烯在此模型中也同樣有效。
表12與其他藥物比較，在人肺腺癌MV522轉(zhuǎn)移肺腫瘤模型中6-羥甲基酰基富烯類似物的效率一第三次實驗藥物壽命對照組 DMSO/NS IP 3X/WK 100±29％紫杉酚 6.0mg/kg IP 5X/WK 93±22％紫杉酚 20.0mg/kg IP 5X/WK 113±22％絲裂霉素c2.4mg/kg IP 1X/WK 149±12％亞德里亞霉素 2.6mg/kg IP 1X/WK 105±25％二酮 30mg/kg IP 3X/WK 163±6％(早先申請人所列)碘?；幌? 20mg/kg IP 3X/WK 120±34％對羥基芐基富烯 15mg/kg IP 3X/WK 125±16％對羥基芐基富烯 20mg/kg IP 3X/WK 126±22％6-羥甲基酰基富烯 10mg/kg IP 3X/WK ＞204％(2只動物存活，？治愈)--雖然本發(fā)明已根據(jù)現(xiàn)有的優(yōu)選方案進(jìn)行了描述，當(dāng)然，可以作出各種改進(jìn)而不會違背本發(fā)明的精神。因此，本發(fā)明僅由如下權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.一種抑制受治療者腫瘤生長的方法，包括使治療量的有如下結(jié)構(gòu)的?；幌╊愃莆锱c腫瘤接觸 其中類似物能夠抑制腫瘤生長，而對受治療者沒有高的毒性，其中R選自如下基團(tuán) (其中R1＝烷基，芳基，NH2，NHR，或NR2)
2.權(quán)利要求1的方法，其中在靜脈內(nèi)給藥時治療量為每kg體重30～112,000μg。
3.權(quán)利要求1的方法，其中腹膜下給藥時治療量為每kg體重300～112,000μg。
4.權(quán)利要求1的方法，其中類似物通過靜脈內(nèi)、口腔、腹膜下和吸入給藥。
5.一種能夠結(jié)合腫瘤抗原的組合物，包括連接具有如下結(jié)構(gòu)的?；幌╊愃莆锏脑噭?其中R選自如下基團(tuán) (其中R1＝烷基，芳基，NH2，NHR，或NR2)
6.權(quán)利要求5的配合物，其中試劑是抗體。
7.一種抑制受治療者腫瘤細(xì)胞生長的方法，包括使腫瘤與權(quán)利要求6的組合物接觸。
8.一種治療組合物，包括30～100mg權(quán)利要求1的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
9.權(quán)利要求1的方法，其中腫瘤細(xì)胞選自骨髓、表皮樣瘤、T細(xì)胞白血病和肺、卵巢和乳腺癌。
全文摘要
提供了一種抑制受治療者腫瘤細(xì)胞生長的方法，包括使治療量的有結(jié)構(gòu)式I的酰基富烯與腫瘤接觸，其中類似物能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，而對受治療者沒有過高的毒性，結(jié)構(gòu)式I中R是(a)，其中R
文檔編號A61P35/02GK1119854SQ94191560
公開日1996年4月3日 申請日期1994年2月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月9日
發(fā)明者M·J·凱爾納, T·C·麥莫里斯, R·蒂特爾 申請人:加州大學(xué)評議會